大容量血清抗體的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物領(lǐng)域，具體涉及大容量血清抗體的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]血清抗體屬于抗體藥物中的最初級產(chǎn)品，僅在實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模制備以用于科學(xué)研宄較常見。纖維蛋白原是血漿與血清區(qū)別的主要組分之一，由a、f3和γ鏈通過29對二硫鍵連接而成的分子量為340kDa的六聚體，作為血小板膜糖蛋白II b/ III a的受體參與血小板的活化聚集和在凝血酶及動物機(jī)體其他組分的作用下參與第三階段的凝血。
[0003]隨著養(yǎng)殖業(yè)集約化的快速發(fā)展，免疫失敗、動物重大疫病的散發(fā)性暴發(fā)、抗病毒藥物在獸醫(yī)臨床的禁用及以原發(fā)性病毒性疾病所至的混合感染，為動物各種疫病特異性的血清、免疫球蛋白及白蛋白等提供了市場空間。目前，提取制備血清抗體最常見的方法是凍融法、冷乙醇法、自然沉析法，前兩種成本低，但對血漿中的纖維蛋白去除不徹底，易在制備后的短時間內(nèi)出現(xiàn)絮狀物的沉析，影響提取的血清抗體的品質(zhì)及后續(xù)相關(guān)研宄；自然沉析法對提取的血清總蛋白量影響最小，且析出的血清抗體品質(zhì)很好，但提取的血清抗體量最少，丟失較多，不能滿足制備大容量血清抗體的需求。
[0004]因此，急需一種大容量血清抗體的制備方法，纖維蛋白去除徹底，血清抗體量多，品質(zhì)好。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供大容量血清抗體的制備方法，該方法血清抗體獲得量多，纖維蛋白去除徹底，品質(zhì)好，適合大容量制備，能夠?qū)崿F(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案:
[0007]1、大容量血清抗體的制備方法，包括如下步驟:
[0008](I)采集經(jīng)免疫后的新鮮血液，收集血漿，保存?zhèn)溆茫?br>[0009](2)將步驟(I)收集的血漿進(jìn)行過濾，收集濾液，得初濾血清制品；
[0010](3)將步驟⑵制得的初濾血清制品中加入凝血酶，攪拌均勻，20_37°C條件下溫敷0.5?4h，接著用濾紙過濾，收集濾液，得血清抗體；所述凝血酶的加入量按每毫升初濾血清制品加入10?40IU凝血酶。
[0011]優(yōu)選的，采集經(jīng)免疫后的新鮮血液為將免疫的待宰正常健康肥豬于最后次免疫豬瘟疫苗3天后屠宰，收集新鮮豬血即可。
[0012]優(yōu)選的，所述收集血漿是將收集的新鮮豬血按抗凝劑與新鮮豬血體積比為1:10抗凝劑，所述抗凝劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.8% ;混勻后于4°C靜置4?5小時，然后于5000r/min條件下離心0.5h，收集上清液得血漿。
[0013]更優(yōu)選的，所述抗凝劑為枸椽酸鈉。
[0014]優(yōu)選的，步驟(2)中，所述過濾是將血漿用孔徑為0.22-0.88 μ m的過濾器過濾，過濾器為不銹鋼正壓微孔濾器。
[0015]優(yōu)選的，步驟(3)中，所述凝血酶的加入量按每毫升初濾血清制品加入30IU凝血酶。
[0016]優(yōu)選的，所述溫敷37°C條件下溫敷2h。
[0017]優(yōu)選的，所述過濾為用孔徑為0.88 μπι的濾紙過濾。
[0018]更優(yōu)選的，步驟(3)中收集濾液后還包括如下步驟:將獲得的血清抗體加入硫柳汞鈉至硫柳汞鈉的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0.02?0.4%。
[0019]本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明公開了大容量血清抗體的制備方法，該方法簡單，能夠用于大容量血清的制備，并且血清獲得量多，纖維蛋白去除徹底，品質(zhì)佳，穩(wěn)定性好，在5?15°C條件下靜置I個月保持澄清透明，且血清(比如豬瘟抗體血凝試驗(yàn))在5?15°C條件下靜置I個月后效價達(dá)1: 16，效價優(yōu)于其他方法制備的血清抗體。
【附圖說明】
[0020]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖:
[0021]圖1為四種方法備血清抗體前后的豬瘟抗體效價(豬瘟正向間接血凝試驗(yàn)檢測法)比較(效價3、2分別表示稀釋倍數(shù)或凝集效價為1:8和1:4)。
[0022]圖2為不同保存溫度對四種方法制備的血清抗體效價變化曲線。
[0023]圖3為不同溫度環(huán)境下保存時間對四種方法制備的血清抗體穩(wěn)定性的影響(A:5-15°C室溫環(huán)境下保存30d血清豬瘟抗體效價變化曲線；B:15-25°C室溫環(huán)境下保存30d血清豬瘟抗體效價變化曲線)。
【具體實(shí)施方式】
[0024]下面將結(jié)合附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。
[0025]本發(fā)明所使用的主要試劑盒材料如下:豬瘟凍干正向間接血凝試驗(yàn)診斷液購自中國農(nóng)科院蘭州獸醫(yī)研宄所；凝血酶凍干粉(10IU/mg)購自北京第一生物化學(xué)藥業(yè)有限公司；蛋白質(zhì)定量(雙縮脲法)測試盒購于江蘇南京建成生物有限公司；硫柳汞鈉購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；試驗(yàn)用豬血采自重慶市榮昌縣施濟(jì)橋屠宰場經(jīng)檢疫的待宰正常健康肥豬。
[0026]本發(fā)明中抗凝劑可以為枸櫞酸鈉。
[0027]實(shí)施例1
[0028]大容量血清抗體的制備方法(凝血酶法)，具體步驟如下:
[0029](I)取待宰正常健康肥豬免疫豬瘟疫苗按5、2、3、4頭份/頭或2、2、2、4頭份/份免疫(注:疫苗為兔源豬瘟活疫苗，規(guī)格；10頭份/瓶，多0.02g組織毒/頭份，疫苗生產(chǎn)單位為:上海海利生物技術(shù)有限公司)，每周免疫一次，第5周用首免的2-3倍劑量免疫豬瘟疫苗，加倍免疫3天后屠宰收集新鮮豬血；屠宰前用潔凈自來水沖洗待屠宰肥豬全身，并用來蘇爾消毒；放血刀或其他屠宰用品用酒精或其他消毒液消毒；
[0030](2)將步驟(I)收集的新鮮豬血按體積比為1:10加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.8%的枸椽酸鈉，混勻后于4°C靜置4?5小時，然后于5000r/min條件下離心0.5h，收集上清液即血漿，于-20°C下過夜保存，備用；
[0031](3)將步驟⑵保存的血漿在4°C下用5-10L規(guī)格濾膜孔徑0.22-0.88微米的特制不銹鋼正壓微孔濾器過濾，收集濾液，得初濾血清制品；
[0032](4)將步驟(3)制得的初濾血清制品按I毫升初濾血清制品加入1IU加入凝血酶，攪拌均勻，然后在37°C條件下溫敷2h，再用孔徑為0.88 μπι的濾紙過濾，收集濾液，保存，備用；
[0033](5)將步驟(4)獲得的濾液加入硫柳汞鈉至硫柳汞鈉的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0.02%，混勾，得血清初級廣品。
[0034]本實(shí)施例中，凝血酶使用前用20?50mL無菌蒸餾水稀釋溶解；溫敷中在20?37°C下溫敷0.5?4小時均可；硫柳汞鈉的作用為防腐，硫柳汞鈉濃度度為0.02%?0.04% (質(zhì)量百分比)范圍內(nèi)均能實(shí)現(xiàn)發(fā)明目的。
[0035]對比實(shí)施例1
[0036]大容量血清抗體的制備方法(自然沉析法)，具體步驟如下:按上述相同方法采集的新鮮豬血37°C靜置30min，劃口，4°C靜置24_48h，收集析出的液體經(jīng)離心即為血清抗體。
[0037]對比實(shí)施例2
[0038]大容量血清抗體的制備方法(凍融法)，具體步驟如下:按上述相同方法采集的新鮮豬血，經(jīng)抗凝處理后，離心取上清液，置_20°C條件下靜置冷凍24-48h，過濾，收集濾液即為血清抗體。
[0039]對比實(shí)施例3
[0040]大容量血清抗體的制備方法(冷乙醇法)，具體步驟如下:按上述相同方法采集的新鮮豬血，經(jīng)抗凝處理后，離心取上清液，然后按體積比為(10:1)加入冷乙醇，作用0.5?2h，過濾，收集濾液即為血清抗體。
[0041]實(shí)施例1與對比實(shí)施例1?3獲得血清抗體比較:
[0042]I)血清抗體量:分別取500mL新鮮豬血，按照上述方法制備血清抗體，然后將去置刻度量杯中統(tǒng)計(jì)血清抗體獲得量，每組設(shè)置3次。結(jié)果顯示，實(shí)施例1、對比實(shí)施例1?3血清抗體的獲得量依次為207mL、39mL、185mL和181mL。上述結(jié)果表明