片段縮合制備利拉魯肽的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及制藥領(lǐng)域，具體地說，涉及片段縮合制備利拉魯肽的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 利拉魯肽，英文名liraglutide，是一種胰高血糖素樣肽-1 (GLP-1)類似物，序 列為：H-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(N-e-(N-a-Palmitoyl-L-Y-glutamyl))-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val -Arg-Gly-Arg-Gly-〇H，分子式：C172H265N43051，作為一種皮下注射制劑，能起到良好的降低血 糖作用，能夠通過降低2型糖尿病患者的空腹及餐后血糖而改善血糖控制，同時能夠降低 患者體重。
[0003] 目前利拉魯肽的合成方法如專利CN102286092、專利CN103145828、專利 CN103288951、專利CN103304660和專利CN103980358是利用Fmoc策略固相法依次連接合 成利拉魯肽。該方法氨基酸逐個偶聯(lián)合成周期長，逐步偶聯(lián)時樹脂收縮嚴(yán)重、反應(yīng)不完全、 產(chǎn)生缺陷肽，固相載體選用的取代值限制，總收率較低，同時雜質(zhì)較多，純化困難。
[0004] 專利 CN102875665、專利 CN104045705、專利 CN104045706、專利 CN103275208、專利 CN103304659、專利CN103864918和專利CN104004083采用固相片段縮合的方法合成，固相 片段縮合投入的每個片段都是1. 5-3. 5倍過量，嚴(yán)重浪費肽片段，造成合成成本很高；同時 固相片段縮合的樹脂取代值限制，物料通量降低，浪費溶劑，產(chǎn)生大量廢液。
[0005] 其他專利公開了基因重組生產(chǎn)利拉魯肽，然而基因表達有著工作量大、三廢嚴(yán)重、 技術(shù)難度大、生產(chǎn)成本高等缺點。
[0006] 所以本領(lǐng)域技術(shù)人員仍然期待以高產(chǎn)品收率、低合成成本獲得具有良好品質(zhì)產(chǎn)品 的方法，尤其是降低成本、減少廢液產(chǎn)生的新方法，對于大規(guī)模、產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)是非常必要和 重要的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有方法合成收率低、生產(chǎn)成本高、產(chǎn)生廢液 多、產(chǎn)品純化難、不能低成本高效率得到高純度的利拉魯肽的缺點，提供一種片段縮合制備 利拉魯肽的方法。
[0008] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
[0009] 片段縮合制備利拉魯肽的方法，固相合成4個側(cè)鏈保護的肽片段序列，將各肽片 段在溶液體系中逐步偶聯(lián)得到全保護利拉魯肽直鏈多肽，脫去第20位Lys的側(cè)鏈保護，并 完成修飾，形成全保護利拉魯肽，然后裂解脫除保護基得到利拉魯肽粗肽，純化換鹽得到利 拉魯膚；
[0010] 其中，所述的4個肽片段序列為：
[0011] 第一肽片段序列為利拉魯肽序列中的第1-8位氨基酸，
[0012] 第二肽片段序列為利拉魯肽序列中的第9-16位氨基酸，
[0013] 第三肽片段序列為利拉魯肽序列中的第17-26位氨基酸，
[0014] 第四肽片段序列為利拉魯肽序列中的第27-31位氨基酸。
[0015] 上述片段縮合制備利拉魯肽的方法，優(yōu)選包括以下步驟：
[0016] (1)分別固相合成側(cè)鏈保護的第一~第四肽片段序列，并從樹脂上裂解；
[0017] (2)將側(cè)鏈保護的第四肽片段序列羧基端修飾保護，并脫去其氨基保護基；
[0018] (3)將脫去氨基保護基的側(cè)鏈保護的第四肽片段序列和側(cè)鏈保護的第三肽片段序 列偶聯(lián)得到側(cè)鏈保護的第五肽片段序列，并脫去其氨基保護基；
[0019] (4)將脫去氨基保護基的側(cè)鏈保護的第五肽片段序列和側(cè)鏈保護的第二肽片段序 列偶聯(lián)得到側(cè)鏈保護的第六肽片段序列，并脫去其氨基保護基；
[0020] (5)將脫去氨基保護基的側(cè)鏈保護的第六肽片段序列和側(cè)鏈保護的第一肽片段序 列偶聯(lián)得到全保護的利拉魯肽直鏈多肽；
[0021] (6)將全保護的利拉魯肽直鏈多肽脫去第20位Lys的側(cè)鏈保護，并完成修飾得到 全保護利拉魯膚；
[0022] (7)將全保護的利拉魯肽裂解脫除保護基得到利拉魯肽粗肽；
[0023] (8)利拉魯肽粗肽經(jīng)純化換鹽得到利拉魯肽。
[0024] 步驟⑴中，側(cè)鏈保護的第一至第四肽片段序列分別由氨基酸依次偶聯(lián)在固相載 體上獲得；其中，所述的固相載體為酸敏感樹脂，優(yōu)選為2-氯-三苯甲基氯樹脂。
[0025] 側(cè)鏈保護的第一至第四肽片段序列固相合成中，
[0026] 所使用的氨基脫保護試劑為體積百分含量為20 %的哌啶的DMF溶液、或者體積百 分含量為1%的DBU的DMF溶液；優(yōu)選體積百分含量為20%哌啶的DMF溶液。
[0027] 所使用的偶聯(lián)劑為DIC與HOBt按摩爾比1:1的組合、或者HBTU與HOBt與DIEA 按摩爾比1:1:2的組合、或者PyBOP與HOBt與DIEA按摩爾比1:1:2的組合；優(yōu)選HBTU與 HOBt與DIEA按摩爾比1:1:2的組合；待偶聯(lián)的氨基酸與HOBt的摩爾比是1:1。
[0028] 所使用的裂解劑為體積百分含量為0. 5~1 %的TFA的DCM溶液、或者體積百分含 量為20 %的TFE的DCM溶液、或者TFE與AcOH與DCM按照體積比1:2:7的混合物，優(yōu)選體 積百分含量為0. 5~1 %的TFA的DCM溶液。
[0029] 步驟（1)中，具體的固相合成方法，為本領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)技術(shù)手段。
[0030] 步驟⑵中，所使用的羧基端保護試劑為0. 5M的2C1-Trt C1的DCM溶液或者 01(：13與TFE與TBTA按照體積比7:2:1的混合物，優(yōu)選為CHC1 3與TFE與TBTA按照體積比 7:2:1的混合物。
[0031]步驟（2)、（3)、（4)中，所使用的氨基脫保護試劑為體積百分含量為16%的哌啶的 DMF溶液，或者體積百分含量為1 %的DBU的DMF溶液。優(yōu)選體積百分含量為16 %哌啶的 DMF溶液。
[0032] 步驟（3)、⑷、（5)中，所使用的偶聯(lián)劑為HBTU與HOBt與DIEA按摩爾比1:1:2的 組合、或者HBTU與HOAt與DIEA按摩爾比1:1:2的組合、或者DIC與HOBt按摩爾比1:1的 組合、或者EDC與HOBt按摩爾比1:1的組合、或者PyBOP與HOBt與DIEA按摩爾比1:1:2的 組合。優(yōu)選HBTU與HOBt與DIEA按摩爾比1:1:2的組合。待偶聯(lián)的羧基端與氨基端的摩 爾比是0. 95~1. 05:1。待偶聯(lián)的羧基端與HOBt的摩爾比是1:1。偶聯(lián)反應(yīng)的溶劑為DMF、 DCM、NMP、THF、TFE和DMS0中的任意一種或幾種的組合，優(yōu)選DMF。
[0033] 步驟（6)中，脫去Lys的e -氨基保護基ivDde的試劑為水合肼與DMF按照體積 比1:15的混合物。
[0034] 步驟（6)中，Lys側(cè)鏈修飾的方法為先加入e -氨基端4倍摩爾量的 Fmoc-Glu-OtBu縮合；然后脫去Fmoc基團，所用試劑為體積百分含量為16%的哌啶的DMF 溶液，或者體積百分含量為1%的DBU的DMF溶液，優(yōu)選為體積百分含量為16%的哌啶的 DMF溶液；最后再與棕櫚酸縮合