。
[0035] 步驟（7)中，全保護利拉魯肽裂解的裂解液為TFA與H20按體積比95:5的混合溶 液、或者TFA與EDT與TIS與PhOH與H20按體積比80:5:5:5:5的混合溶液、或者TFA與EDT 與TIS與H20按體積比92. 5:2. 5:2. 5: 2. 5的混合溶液，優(yōu)選TFA與EDT與TIS與H20按體 積比92. 5:2. 5:2. 5:2. 5的混合溶液。
[0036] 步驟（8)中，純化為反相高效液相色譜純化換鹽；即色譜柱為C18柱；流動相為體 積百分比0. 25%醋酸的水溶液和乙腈。
[0037] 本發(fā)明使用酸敏感樹脂進行各個肽片段的固相合成，樹脂取代值高，氨基酸1. 5-2 倍投量，物料成本低。合成的肽片段純度高，不必進行HPLC純化，即可進行液相反應(yīng)，減少 了后處理的步驟，減少了廢液產(chǎn)生。多個片段可以同時合成，節(jié)約合成時間，縮短合成周期。 片段縮合采用液相體系，羧基端片段的投量僅為氨基端片段〇. 95-1. 05倍，不會造成片段 的浪費，大大降低了成本，而未反應(yīng)的片段均可通過合適的反應(yīng)體系通過萃取清除，后處理 簡單、快捷。并且液相片段縮合沒有了固相片段縮合存在的樹脂取代值限制的問題，物料通 量增加，減少了廢液產(chǎn)生。在最終的液相色譜純化步驟中，雜質(zhì)不是缺少一個或幾個氨基酸 的缺陷肽，而是未縮合的片段，不會造成純化困難的問題。所以本發(fā)明的特點是高通量、低 成本、廢液少、效率高、純化易，非常適合大規(guī)模、產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
[0038] 本發(fā)明所涉及的目標(biāo)肽（利拉魯肽）及中間體的各個肽片段的氨基酸序列見表1。 本發(fā)明中所使用的物料縮寫的含義見表2。
[0039] 表1利拉魯肽相應(yīng)的編碼氨基酸序列
[0040]
【主權(quán)項】
1. 片段縮合制備利拉魯肽的方法，其特征在于，固相合成4個側(cè)鏈保護的肽片段序列， 將各肽片段在溶液體系中逐步偶聯(lián)得到全保護利拉魯肽直鏈多肽，脫去第20位Lys的側(cè)鏈 保護，并完成修飾，形成全保護利拉魯肽，然后裂解脫除保護基得到利拉魯肽粗肽，純化換 鹽得到利拉魯肽； 其中，所述的4個肽片段序列為： 第一肽片段序列為利拉魯肽序列中的第1-8位氨基酸， 第二肽片段序列為利拉魯肽序列中的第9-16位氨基酸， 第三肽片段序列為利拉魯肽序列中的第17-26位氨基酸， 第四肽片段序列為利拉魯肽序列中的第27-31位氨基酸。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的片段縮合制備利拉魯肽的方法，其特征在于，它包括以下步 驟： (1) 分別固相合成側(cè)鏈保護的第一~第四肽片段序列，并從樹脂上裂解； (2) 將側(cè)鏈保護的第四肽片段序列羧基端修飾保護，并脫去其氨基保護基； (3) 將脫去氨基保護基的側(cè)鏈保護的第四肽片段序列和側(cè)鏈保護的第三肽片段序列偶 聯(lián)得到側(cè)鏈保護的第五肽片段序列，并脫去其氨基保護基； (4) 將脫去氨基保護基的側(cè)鏈保護的第五肽片段序列和側(cè)鏈保護的第二肽片段序列偶 聯(lián)得到側(cè)鏈保護的第六肽片段序列，并脫去其氨基保護基； (5) 將脫去氨基保護基的側(cè)鏈保護的第六肽片段序列和側(cè)鏈保護的第一肽片段序列偶 聯(lián)得到全保護的利拉魯肽直鏈多肽； (6) 將全保護的利拉魯肽直鏈多肽脫去第20位Lys的側(cè)鏈保護，并完成修飾得到全保 護利拉魯膚； (7) 將全保護的利拉魯肽裂解脫除保護基得到利拉魯肽粗肽； (8) 利拉魯肽粗肽經(jīng)純化換鹽得到利拉魯肽。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的片段縮合制備利拉魯肽的方法，其特征在于，步驟（1)中，側(cè) 鏈保護的第一至第四肽片段序列分別由氨基酸依次偶聯(lián)在固相載體上獲得；其中，所述的 固相載體為酸敏感樹脂； 側(cè)鏈保護的第一至第四肽片段序列固相合成中，所使用的氨基脫保護試劑為體積百分 含量為20 %的哌啶的DMF溶液、或者體積百分含量為1 %的DBU的DMF溶液；所使用的偶 聯(lián)劑為DIC與HOBt的組合、或者HBTU與HOBt與DIEA的組合、或者PyBOP與HOBt與DIEA 的組合；所使用的裂解劑為體積百分含量為〇. 5~1 %的TFA的DCM溶液、體積百分含量為 20 %的TFE的DCM溶液、或者TFE與AcOH與DCM按照體積比1:2:7的混合物。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的片段縮合制備利拉魯肽的方法，其特征在于，步驟（2)中，所 使用的羧基端保護試劑為〇. 5M的2C1-Trt Cl的DCM溶液或者01(：13與TFE與TBTA按照 體積比7:2:1的混合物。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的片段縮合制備利拉魯肽的方法，其特征在于，步驟（2)、（3)、 (4) 中，所使用的氨基脫保護試劑為體積百分含量為16%的哌啶的DMF溶液，或者體積百分 含量為1 %的DBU的DMF溶液。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的片段縮合制備利拉魯肽的方法，其特征在于，步驟（3)、（4)、 (5) 中，所使用的偶聯(lián)劑為HBTU與HOBt與DIEA的組合、或者HBTU與HOAt與DIEA的組合、 或者DIC與HOBt的組合、或者EDC與HOBt的組合、或者PyBOP與HOBt與DIEA的組合；偶 聯(lián)反應(yīng)的溶劑為DMF、DCM、NMP、THF、TFE和DMSO中的任意一種或幾種的組合。
7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的片段縮合制備利拉魯肽的方法，其特征在于，步驟(6)中，脫 去Lys側(cè)鏈保護ivDde的試劑為水合肼與DMF按照體積比1:15的混合物。
8. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的片段縮合制備利拉魯肽的方法，其特征在于，步驟（6)中，Lys 側(cè)鏈修飾的方法為先加入Fmoc-Glu-OtBu縮合；然后脫去Fmoc基團，所用試劑為體積百分 含量為16 %的哌啶的DMF溶液，或者體積百分含量為1 %的DBU的DMF溶液；最后再與棕櫚 酸縮合。
9. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的片段縮合制備利拉魯肽的方法，其特征在于，步驟（7)中，全 保護利拉魯肽裂解的裂解液為TFA與H2O按體積比95:5的混合溶液、或者TFA與EDT與TIS 與PhOH與H2O按體積比80:5:5:5:5的混合溶液、或者TFA與EDT與TIS與H2O按體積比 92. 5:2. 5:2. 5:2. 5 的混合溶液。
10. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的片段縮合制備利拉魯肽的方法，其特征在于，步驟（8)中，純 化為反相高效液相色譜純化換鹽；流動相為醋酸水溶液和乙腈溶液。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種片段縮合制備利拉魯肽的方法，固相合成4個側(cè)鏈保護的肽片段序列，將各肽片段在溶液體系中逐步偶聯(lián)得到全保護利拉魯肽直鏈多肽，脫去第20位Lys的側(cè)鏈保護，并完成修飾，形成全保護利拉魯肽，然后裂解脫除保護基得到利拉魯肽粗肽，純化換鹽得到利拉魯肽；其中，所述的4個肽片段序列為：第一肽片段序列為利拉魯肽序列中的第1-8位氨基酸，第二肽片段序列為利拉魯肽序列中的第9-16位氨基酸，第三肽片段序列為利拉魯肽序列中的第17-26位氨基酸，第四肽片段序列為利拉魯肽序列中的第27-31位氨基酸。本發(fā)明方法，提高了產(chǎn)率，大幅降低了合成成本，利于大規(guī)模、產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
【IPC分類】C07K1-04, C07K1-06, C07K1-10, C07K14-605
【公開號】CN104650219
【申請?zhí)枴緾N201510079168
【發(fā)明人】彭雅麗, 王銳, 常民, 薛宏祥, 魏麗娟, 王曉麗
【申請人】蘭州大學(xué)
【公開日】2015年5月27日
【申請日】2015年2月15日