專利名稱：植酸酶appb及編碼該植酸酶的dna的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植酸酶，特別涉及一種植酸酶APPB，同時(shí)還涉及編碼該植酸酶的DNA，及含有該植酸酶的表達(dá)載體和含有該表達(dá)載體的重組酵母細(xì)胞。
中國(guó)發(fā)明專利97121731.9公開了一種植酸酶，該植酸酶在小試水平上表達(dá)量達(dá)到5×105U/mL，中試水平上將表達(dá)量提高到1×106U/mL發(fā)酵液。但在這項(xiàng)研究中，由于所采用的植酸酶比活性較低，雖然在重組菌株中植酸酶的絕對(duì)表達(dá)量已達(dá)到了10mg酶蛋白/mL發(fā)酵液，達(dá)到了較高的水平，但單位體積發(fā)酵液中的酶活性還是偏低，因而生產(chǎn)成本較高。
植酸酶的抗胰蛋白酶和胃蛋白酶的能力是影響植酸酶實(shí)際應(yīng)用效果的關(guān)鍵因素之一。植酸酶的作用場(chǎng)所是動(dòng)物的胃腸道，動(dòng)物在胃腸道中分泌胃蛋白酶、胰蛋白酶等多種蛋白酶以消化食物，植酸酶本身就是一種蛋白質(zhì)，也有可能被這些蛋白酶降解而失去活性，這就要求植酸酶必需對(duì)動(dòng)物胃腸道中的蛋白酶有一定的抗性。2000年Igbasan(Igbasan.Arch anim nutr，53353-373，2000)的研究結(jié)果表明，真菌來源的植酸酶，包括目前商品化的植酸酶，其抗胃蛋白酶的能力均較差，用胃蛋白酶處理60分鐘后，植酸酶的剩余活性不超過33％，僅有大腸桿菌來源的植酸酶APPA剩余活性還維持在95％左右，具有很好的抗胃蛋白酶能力。但是，Rodriguez的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)(Rodriguez.Arch BiochemBiophys，365262-267，1999)，APPA雖具有好的抗胃蛋白酶能力，但它確不抗胰蛋白酶，處理30分鐘和2小時(shí)后，酶活性分別喪失了87％和95％。
本發(fā)明的目的是通過以下途徑來實(shí)現(xiàn)的。
植酸酶APPB，它是一種具有APPB ID NO1所示的氨基酸序列的純化的植酸酶。
本發(fā)明中生物植酸酶APPB來源于一種大腸桿菌生物，它具有很好的同時(shí)抗胃蛋白酶和胰蛋白酶的能力。目前報(bào)道絕大部分植酸酶，包括來源于曲霉等真菌和芽孢桿菌的植酸酶均不抗胃蛋白酶(Igbasan.Archanim nutr，53353-373，2000)，而來源于大腸桿菌的植酸酶APPA(Greiner，Arch Biochem Biophys，303107-113，1993；Rodriguez，Biochem Biophys Res Commun，257117-123，1999)有很好的胃蛋白酶抗性，但對(duì)胰蛋白酶抗性很差(Rodriguez.Arch Biochem Biophys，365262-267，1999)。目前還未有報(bào)道同時(shí)對(duì)胃蛋白酶和胰蛋白酶均具有高抗性的植酸酶。
本發(fā)明采用純化后的植酸酶APPB來進(jìn)行抗胃蛋白酶和胰蛋白酶能力的測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胃蛋白酶和胰蛋白酶作用2小時(shí)后，植酸酶的酶活性都依然維持在90％以上，具有很好的同時(shí)抗胃蛋白酶和胰蛋白酶活性(見

圖1)。
本發(fā)明中的植酸酶APPB具有高比活性，它的比活性達(dá)到3.2×106U/mg酶蛋白，比曲霉來源的植酸酶(1×105U/mg)高30倍(見VanGorcom R.F.M.et al.，1995；姚斌等，中國(guó)發(fā)明專利97121731.9，2000)，比Peniophora來源的植酸酶(Lassen，US Patent 6060298，2000)高6倍?？梢姳景l(fā)明植酸酶APPB具有比現(xiàn)有技術(shù)中植酸酶更高的比活性。
本發(fā)明的植酸酶可通過PCR技術(shù)、定點(diǎn)突變技術(shù)、基因設(shè)計(jì)后化學(xué)合成等技術(shù)來改造，使用表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)。可選擇的表達(dá)系統(tǒng)包括低等真核表達(dá)系統(tǒng)如酵母、絲狀真菌等；原核表達(dá)系統(tǒng)大腸桿菌、芽孢桿菌、乳酸桿菌、桿狀病毒等；高等真核表達(dá)系統(tǒng)如玉米、大豆、水稻、豬、雞、鴨及各種魚類和昆蟲等。本發(fā)明中，為了使植酸酶基因能在畢赤酵母中高效表達(dá)，我們通過PCR的方法將植酸酶基因APPB原有的信號(hào)肽序列除掉，改造后的植酸酶基因插入到帶有α-因子信號(hào)肽序列的酵母表達(dá)載體上，經(jīng)轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞后，穩(wěn)定整合到酵母染色體上，此重組酵母經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后，表達(dá)的植酸酶蛋白在信號(hào)肽的引導(dǎo)下分泌到培養(yǎng)基中。經(jīng)測(cè)定，植酸酶表達(dá)量達(dá)到4×106U/mL，比國(guó)際表達(dá)水平最高的專利(VanGorcom R.F.M.et al.，Patent No.US 5436156，1995)所報(bào)道的高近15倍。
本發(fā)明經(jīng)研究結(jié)果還表明(如圖2所示)，表達(dá)的植酸酶隨誘導(dǎo)時(shí)間的增加而積累，在誘導(dǎo)106小時(shí)時(shí)達(dá)到高峰，這時(shí)的表達(dá)量達(dá)到4mg/mL發(fā)酵液時(shí)，酶活性達(dá)到4×106U/mL發(fā)酵液。表達(dá)的酶蛋白分子量大小約為50kD，比植酸酶的理論分子量大5kDa左右，這可能是因?yàn)檫M(jìn)行了蛋白翻譯后修飾—糖基化。以上結(jié)果證明植酸酶基因不僅得到了表達(dá)、有效分泌，且表達(dá)的植酸酶具有正常的生物學(xué)活性。
該植酸酶1)分子量為45Kda；2)活性的pH值范圍為2.0～7.5；3)穩(wěn)定性的pH值范圍為2.0～9.0；4)活性的溫度范圍為4～75℃；5)穩(wěn)定性的溫度范圍為4～75℃。
進(jìn)一步講還在于該植酸酶1)性的最適pH值范圍為4.5；2)活性的最適溫度范圍為35～60℃。
本發(fā)明還可以經(jīng)如下方式來實(shí)現(xiàn)。
編碼如APPB ID NO1所示的氨基酸序列的純化的植酸酶的DNA。
可以具體為編碼如APPB ID NO1所示的氨基酸序列的純化的植酸酶的DNA，其具有APPB ID NO2所示的核苷酸序列。
本發(fā)明對(duì)已報(bào)道的來源于大腸桿菌的植酸酶基因序列(Rodriguez，Biochem Biophys Res Commun，257117-123，1999)，設(shè)計(jì)合成克隆植酸酶APPB基因所需的PCR引物P1和P2P15’TCGAATTCATGAAAGCGATCTTAATCCCA 3’P25’CTGAATTCTTACAAACTGCACGCCGG 3’以大腸桿菌CGMCC1.1541的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，然后通過DNA全序列分析結(jié)果表明，植酸酶APPB結(jié)構(gòu)基因全長(zhǎng)1299個(gè)核苷酸，編碼432個(gè)氨基酸，N端的22個(gè)氨基酸為信號(hào)肽。從氨基酸推斷出的理論分子量約為45kDa。此基因與來源于真菌的植酸酶基因相比，同源性很低，與來源于大腸桿菌的appA(Dassa，Mol Gen Gent，20068-73，1985；Greiner，Arch Biochem Biophys，303107-113，1993)和appA2(Rodriguez，Biochem Biophys Res Commun，257117-123，1999)基因有較高的同源性，氨基酸序列同源性分別達(dá)到97.9％和96.7％，分別有9個(gè)和15個(gè)氨基酸的差異，但APPB編碼的植酸酶同時(shí)具有抗胃蛋白酶和胰蛋白酶的能力，而報(bào)道的同樣來源于大腸桿菌的appA和appA2編碼的植酸酶卻不能抗胰蛋白酶，綜合基因序列和酶學(xué)性質(zhì)上的差異，證明植酸酶APPB是一性質(zhì)更為優(yōu)良的植酸酶新基因。
一種復(fù)制和表達(dá)載體，它含有編碼如APPB ID NO1所示的氨基酸序列的純化的植酸酶的DNA。
這種復(fù)制和表達(dá)載體可以再具體為它含有編碼如APPB ID NO1所示的氨基酸序列的純化的植酸酶的DNA，并且該DNA具有APPB ID NO2所示的核苷酸序列。
載體為可復(fù)制的DNA構(gòu)建體。它用于擴(kuò)增、表達(dá)編碼植酸酶APPB的基因，也可以用于擴(kuò)大生產(chǎn)、克隆植酸酶APPB的基因。并且含有植酸酶APPB的載體均具有植酸酶APPB的基本特性。
一種宿主細(xì)胞，它由一種復(fù)制和表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染，該載體含有編碼如APPB ID NO1所示的氨基酸序列的純化的植酸酶的DNA。
這種宿主細(xì)胞可以進(jìn)一步具體為它由一種復(fù)制和表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染，該載體含有編碼如APPB IDNO1所示的氨基酸序列的純化的植酸酶的DNA，該DNA具有APPB IDNO2所示的核苷酸序列。
一種動(dòng)物食品，其組成要點(diǎn)為，其含有如APPB ID NO1所示氨基酸序列的植酸酶。
動(dòng)物體內(nèi)所含的植酸磷不能被單胃動(dòng)物有效利用，從而在飼喂過程中造成了許多問題，(1)造成磷源浪費(fèi)。一方面飼料中的磷源不能得到有效利用，另一方面為了滿足動(dòng)物對(duì)磷的需求，又必須在飼料中額外添加無機(jī)磷，提高了飼料成本。(2)形成高磷糞便而污染環(huán)境。飼料中85％左右的植酸磷會(huì)被動(dòng)物直接排出體外，糞便中大量的磷使水和土壤受到嚴(yán)重污染。(3)植酸磷還是一種抗?fàn)I養(yǎng)因子，它在動(dòng)物腸胃道的消化吸收過程中會(huì)與多種金屬離子Zn2+、Ca2+、Cu2+、Fe2+等以及蛋白質(zhì)螯合成相應(yīng)的不溶性復(fù)合物，從而降低了動(dòng)物對(duì)這些營(yíng)養(yǎng)元素的有效利用。
而含有如APPB ID NO1所示氨基酸序列植酸酶的動(dòng)物食品則可以解決上述問題，同時(shí)還使制作植酸酶的成本降低了很多，且該植酸酶比現(xiàn)有技術(shù)中的植酸酶在消化系統(tǒng)中的適用性和有效性也大大提高了，顯然就此而言，本發(fā)明具有突出的特點(diǎn)和顯著的進(jìn)步。
綜上所述，本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有如下優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明提供植酸酶APPB比活性高、能同時(shí)抗胃蛋白酶和胰蛋白酶、表達(dá)能力強(qiáng)的，比現(xiàn)有植酸酶的生產(chǎn)成本降低，而含有該植酸酶的動(dòng)物飼料制品則可以用于酶解動(dòng)物體內(nèi)的植酸磷。
圖2為在5L發(fā)酵罐中不同誘導(dǎo)時(shí)間所積累的植酸酶的SDS-PAGE。
1為標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子；2-10分別為誘導(dǎo)后0、12、24、36、48、60、72、96、108小時(shí)圖3為重組酵母表達(dá)載體pFY02的物理圖譜。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的描述。
最佳實(shí)施例本實(shí)施例包含如下的步驟1、植酸酶的菌株的篩選；2、植酸酶APPB的純化；3、植酸酶APPB的酶學(xué)性質(zhì)研究；4、從大腸桿菌中獲得植酸酶APPB；5、植酸酶基因APPB的改造；6、植酸酶APPB在酵母表達(dá)載體上的構(gòu)建程序；7、酵母轉(zhuǎn)化及篩選重組酵母株系的程序；8、重組酵母在5升發(fā)酵罐中高密度發(fā)酵生產(chǎn)植酸酶的程序。
實(shí)施例中實(shí)驗(yàn)材料的準(zhǔn)備1)菌株與載體 大腸桿菌菌株E.coli DH5a、質(zhì)粒pUC18等購自Promega公司，酵母菌株P(guān)ichia pastoris GS115(His-Mut+)、質(zhì)粒pPIC9由加拿大Alberta大學(xué)D.Luo博士惠贈(zèng)。
2)酶與試劑盒 限制性內(nèi)切酶、連接酶、Taq酶、Mung bean酶為Boehringer公司產(chǎn)品。T7DNA sequence kit購于Pharmacia公司。Invitro mutagenesis systems Kit、隨機(jī)引物標(biāo)記Kit和PCR Kit均購于Promega公司。
3)生化試劑 DNA合成試劑為Milipore公司產(chǎn)品。引物合成用ABI公司Cyclone DNA合成儀。IPTG、X-Gal、SDS及植酸鈉為Sigma公司產(chǎn)品。TEMED、過硫酸銨、丙烯酰胺及甲叉雙丙烯酰胺為Promega公司產(chǎn)品。
4)培養(yǎng)基 大腸桿菌培養(yǎng)基為L(zhǎng)B(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl，pH7.0)。酵母完全培養(yǎng)基為YPD(1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％葡萄糖)；酵母轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基為RDB[18.6％山梨醇、2％葡萄糖、1.34％ YeastNitrogen Base W/O amino acids(YNB)、0.00004％ Biotin、0.005％谷氨酸、0.005％甲硫氨酸、0.005％賴氨酸、0.005％亮氨酸、0.005％異亮氨酸、2％瓊脂糖)]；酵母選擇培養(yǎng)基為MM(1.34％YNB、0.00004％ Biotin、0.5％甲醇、1.5％瓊脂糖)和MD(1.34％YNB、0.00004％ Biotin、2％葡萄糖、1.5％瓊脂糖)；酵母誘導(dǎo)培養(yǎng)基BMGY[1％酵母提取物、2％蛋白胨、1.34％YNB、0.00004％ Biotin、1％甘油(V/V)]和BMMY(除以0.5％甲醇代替甘油，其余成份相與BMGY相同)。重組酵母發(fā)酵培養(yǎng)基為10×Basal Salts(2.67％磷酸、0.093％硫酸鈣、1.82％硫酸鉀、1.49％硫酸鎂、0.413％氫氧化鉀、4％甘油或葡萄糖)；發(fā)酵中所用的微量鹽溶液PTM1(0.6％硫酸銅、0.008％碘化鈉、0.3％硫酸錳、0.02％鉬酸鈉、0.002％硼酸、0.05％氯化鈷、2％氯化鋅、6.5％硫酸亞鐵、0.02 5％生物素、0.5％硫酸)。
1、植酸酶的菌株的篩選用常規(guī)方法獲得34株大腸桿菌，接種到LB培養(yǎng)液中，37℃培養(yǎng)過夜，按1％接種量轉(zhuǎn)接到50mL LB培養(yǎng)液中，37℃培養(yǎng)至OD值1.0，離心收集菌體，菌體重懸于5mL 0.25mol/L醋酸緩沖液(pH5.0)中，超聲波破碎菌體，15000rpm離心15分鐘去除細(xì)胞碎片，上清液用于進(jìn)行植酸酶酶活性測(cè)定。收集菌體破碎抽提測(cè)酶活測(cè)定方法為0.2mL的酶稀釋液加入0.8mL 1.25mmol/L的植酸鈉，37℃保溫30min，加入1mL 10％ TCA終止酶活反應(yīng)，然后加入2mL硫酸亞鐵-鉬酸銨顯色液，700nm測(cè)定無機(jī)磷含量。對(duì)照為先在0.2mL的酶稀釋液中加入1mL 10％TCA使酶滅活，再加入同體積的底物保溫。一個(gè)酶活性單位(U)定義為在一定條件下，每分鐘釋放出1nmol無機(jī)磷所需酶量為一個(gè)酶活性單位。篩選到的產(chǎn)生植酸酶的菌株為大腸桿菌CGMCC1.1541。
2、植酸酶APPB的純化含植酸酶的細(xì)胞破碎液用85％硫酸胺沉淀濃縮，純化用KTA FPLC快速液相色譜儀(Pharmacia公司)純化。含酶的濃縮液首先用HiPrep_26/10_Desalting柱脫鹽，緩沖液為20mmol/L HAc-NaAc(pH5.0)，流速為5mL/min，收集洗脫峰，接著用離子交換柱Hitrip_SP_Sepharose_XL(5mL)分離，A泵為20mmol/L HAc-NaAc(pH5.0)，B泵為1mol/L NaCl、20mmol/L HAc-NaAc(pH5.0)高鹽緩沖液，流速為2mL/min，高鹽緩沖液從0～100％梯度洗脫10個(gè)柱床，分部收集洗脫峰，通過酶活性測(cè)定后的洗脫峰進(jìn)一步用凝膠柱Superdex_75_HR_10/30純化，緩沖液同樣為20mmol/L HAc-NaAc(pH5.0)，流速為0.5mL/min，收集洗脫峰得到純蛋白。
3、植酸酶APPB的酶學(xué)性質(zhì)研究通過FPLC快速液相色譜儀純化后的植酸酶蛋白用來進(jìn)行詳細(xì)的酶學(xué)性質(zhì)研究。
最適pH的測(cè)定為底物植酸鈉，用一系列不同pH值的緩沖液(pH2.0、2.5、3.0、3.5的HCl-Gly緩沖液；pH4.0、4.4、5.0、5.5、5.8的HAc-NaAc緩沖液；pH6.0、6.5的咪唑-HCl；pH7.0、7.5、8.0、9.0的Tris-HCl緩沖液)配制，37℃下在這些不同的緩沖體系中進(jìn)行酶促反應(yīng)，測(cè)定酶活性。結(jié)果表明，其最適為pH4.5。
植酸酶的酸堿穩(wěn)定性測(cè)定為植酸酶蛋白在一系列不同pH值的緩沖液中37℃保溫30分鐘后，稀釋后再在37℃、pH4.5的標(biāo)準(zhǔn)緩沖體系中進(jìn)行酶促反應(yīng)。結(jié)果表明，在pH2～9的范圍內(nèi)，植酸酶具有很好的酸堿穩(wěn)定性。
取定量純化后的植酸酶蛋白，進(jìn)行酶活性測(cè)定，計(jì)算出酶的比活性為3.2×106U/mg。
純化后的APPB用來進(jìn)行抗胃蛋白酶和胰蛋白酶能力的測(cè)定。含10μg植酸酶，分別加入0.5mL 0.1mg/mL的胃蛋白酶(pH2.0、濃度80u/ml)和0.5mL 0.1mg/mL的胰蛋白酶(pH7.0、胰蛋白酶濃度為150U/mL)，混合后于37℃處理不同時(shí)間，稀釋后再用常規(guī)方法測(cè)酶活性。結(jié)果(如圖1所示)發(fā)現(xiàn)，胃蛋白酶和胰蛋白酶作用2小時(shí)后，植酸酶的酶活性都依然維持在90％以上，具有很好的抗蛋白酶活性。
以上結(jié)果表明，植酸酶APPB具有高比活性，同時(shí)具有很好的抗胃蛋白酶和胰蛋白酶的活性。
4、從大腸桿菌中獲得植酸酶APPB菌株在LB培養(yǎng)基中37℃搖床培養(yǎng)24h，取5mL培養(yǎng)液離心沉淀菌體，沉淀重懸于25mL 1.0mol/L的NaCl中，4℃下劇烈振蕩1h，離心后沉淀用25mL預(yù)冷的TES緩沖液(0.01mol/L Tris，pH8.0；0.025mol/LEDTA；0.15mol/L NaCl)洗一次，沉淀再懸浮于5mL TE緩沖液(不含NaCl的TES)中，加入0.5mL 2mg/mL的溶菌酶，37℃保溫15min，再加入0.6mL的肌氨酰-蛋白酶溶液(10％肌氨酰和5mg/mL的蛋白酶溶于TE中)，37℃保溫1h，細(xì)胞裂解液用苯酚、苯酚-氯仿、氯仿依次抽提，酒精沉淀DNA后溶于pH8.0的TE中備用。
對(duì)已報(bào)道的來源于大腸桿菌的植酸酶基因序列(Rodriguez，Biochem Biophys Res Commun，257117-123，1999)，設(shè)計(jì)合成克隆植酸酶基因所需的PCR引物P1和P2P15’TCGAATTCATGAAAGCGATCTTAATCCCA 3’P25’CTGAATTCTTACAAACTGCACGCCGG 3’這兩段引物序列都設(shè)計(jì)在植酸酶結(jié)構(gòu)基因序列兩端，引物上設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)均為EcoRI。以大腸桿菌CGMCCl.1541的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出的約1.3kb的DNA片斷，用EcoRI酶切后通過瓊脂糖凝膠電泳回收純化，與經(jīng)EcoRI酶切的載體pUC18于15℃連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli DH5a，LB培養(yǎng)基上涂板后挑選陽性重組子，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，得到重組質(zhì)粒pRTF-1。
通過DNA全序列分析，測(cè)定了植酸酶基因的完整DNA序列(圖2)。appB結(jié)構(gòu)基因全長(zhǎng)1299個(gè)核苷酸，編碼432個(gè)氨基酸(圖3)，N端的22個(gè)氨基酸為信號(hào)肽。從氨基酸推斷出的理論分子量約為45kDa。此基因與來源于真菌的植酸酶基因相比，同源性很低，與來源于大腸桿菌的appA(Dassa，Mol Gen Gent，20068-73，1985；Greiner，Arch BiochemBiophys，303107-113，1993)和appA2(Rodriguez，Biochem BiophysRes Commun，257117-123，1999)基因有較高的同源性，氨基酸序列同源性分別達(dá)到97.9％和96.7％，分別有9個(gè)和15個(gè)氨基酸的差異，綜合其編碼酶蛋白在抗蛋白酶能力與報(bào)道的這兩種有顯著差異，說明我們克隆到的appB基因是一新基因。
5、植酸酶基因APPB的改造為了使appB能在酵母中順利異源表達(dá)，本研究去掉了appB中信號(hào)肽編碼序列，具體方法為，參照信號(hào)肽編碼序列之后的核苷酸序列合成一個(gè)寡聚核苷酸片斷P3(5’GCGAATTCCAGAGTGAGCCGGAGCTGAAG 3’)作為PCR引物，另一引物為實(shí)驗(yàn)五中的P2。用這對(duì)引物通過PCR的方法擴(kuò)增到的appB基因就是除去信號(hào)肽編碼序列的完整的植酸酶結(jié)構(gòu)基因編碼序列。擴(kuò)增出的DNA片斷用引物上設(shè)計(jì)的EcoRI酶切后插入到載體pUC18的EcoRI位點(diǎn)上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后篩選陽性重組子。這樣就將無信號(hào)肽編碼序列的appB基因克隆到了pUC18上，得到重組質(zhì)粒pRPF-2，通過序列測(cè)定證實(shí)其序列的正確性。
6、植酸酶APPB在酵母表達(dá)載體上的構(gòu)建程序用于構(gòu)建酵母表達(dá)載體的質(zhì)粒是pFY01(帶有α-因子分泌信號(hào))。首先將植酸酶基因插入到上述表達(dá)載體的信號(hào)肽序列的下游，與信號(hào)肽形成正確的閱讀框架，然后通過載體與酵母P.pastoris染色體基因組之間的同源重組事件使目的基因穩(wěn)定整合到酵母染色體上。具體的過程是將去除信號(hào)肽編碼序列的植酸酶基因appB用EcoRI從質(zhì)粒pRPF-2上酶切下后，電泳回收約1.3Kb的DNA片段，再將它們插入到載體pFY01上的EcoRI位點(diǎn)，得到了用于酵母轉(zhuǎn)化的重組表達(dá)載體-pFY02(圖3)。這樣就將帶有α-因子分泌信號(hào)的植酸酶基因克隆到了AOX1啟動(dòng)子下游。
7、酵母轉(zhuǎn)化及篩選重組酵母株系的程序質(zhì)粒pFY02的DNA經(jīng)DraI酶切后電擊轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞后，通過體內(nèi)重組，目的基因?qū)⒄系绞荏w酵母基因組中。在外源誘導(dǎo)物甲醇存在的條件下，AOX1啟動(dòng)子可以啟動(dòng)其下游基因的表達(dá)，并且信號(hào)肽可以指導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)入酵母的分泌途徑，經(jīng)過信號(hào)肽酶的作用，成熟的外源蛋白產(chǎn)物最終分泌至胞外。外源蛋白經(jīng)過這樣的代謝途徑，可以進(jìn)行翻譯后修飾，例如糖基化等，從而得到具有生物活性的蛋白產(chǎn)物。
首先用2～3倍過量的內(nèi)切酶DraI消化質(zhì)粒pFY02的DNA，使之線性化，電泳檢測(cè)酶切是否完全。用酚抽提，乙醇沉淀，70％乙醇洗兩次，冷凍干燥，無菌水溶解，取1～5μg DNA轉(zhuǎn)化畢赤酵母細(xì)胞，在RDB固體培養(yǎng)基上涂板，每板涂0.1mL，30℃下將培養(yǎng)皿倒置培養(yǎng)至轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)。
篩選在MD平板上生長(zhǎng)正常但在MM平板上有一點(diǎn)生長(zhǎng)或完全不生長(zhǎng)的克隆子(his+mut-)即為陽性克隆子。
為了篩選得到高表達(dá)的重組酵母菌株，直接檢測(cè)誘導(dǎo)培養(yǎng)基中植酸酶的表達(dá)情況。將his+mut-轉(zhuǎn)化子首先在BMGY培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待其生長(zhǎng)至飽和狀態(tài)，離心棄BMGY，換入誘導(dǎo)培養(yǎng)基BMMY，在誘導(dǎo)培養(yǎng)36h后取上清液進(jìn)行植酸酶酶活性分析。通過表達(dá)植酸酶的酶活性測(cè)定，從200株重組酵母中初步篩選到42株表達(dá)植酸酶的重組子，其中表達(dá)量最高的4株重組子，分別定名為P.pastoris pFY02-3，33，96，164。
8、重組酵母在5升發(fā)酵罐中高密度發(fā)酵生產(chǎn)植酸酶的程序優(yōu)化后的重組酵母發(fā)酵方法如下5％接種Basal Salts培養(yǎng)基C源4％葡萄糖 菌體生長(zhǎng)階段N源氨水無機(jī)鹽↓24h流加25％葡萄糖流量36mL/h/L 碳源飼喂階段↓4h甲醇誘導(dǎo)(維持終濃度為0.3％左右) 誘導(dǎo)表達(dá)階段發(fā)酵過程分為三個(gè)階段。具體如下1)菌株培養(yǎng)階段。發(fā)酵培養(yǎng)基10×Basal Salts接種前先加入28％氨水使培養(yǎng)基的pH達(dá)到5.0，再按每升培養(yǎng)基加入4.37mL PTM1，5-10％接種種子液，通氣攪拌培養(yǎng)18～24h，在培養(yǎng)過程中隨著菌株的生長(zhǎng)，培養(yǎng)基中的溶氧量由100％逐漸降低，當(dāng)碳源消耗完后溶氧量將再度升高至80％以上，此時(shí)菌體濕重達(dá)到90～110g/L。2)碳源飼喂階段。流加25％葡萄糖(每升中含12mL PTM1)，流加量為28mL/h/L，培養(yǎng)4h。調(diào)整通氣量使溶氧量始終大于20％。此步結(jié)束時(shí)菌體濕重達(dá)到180～220g/L。3)誘導(dǎo)表達(dá)階段。加入誘導(dǎo)劑甲醇(每升中含12mL PTM1)，使甲醇終濃度維持在0.3％，溶氧量始終大于20％。在誘導(dǎo)過程中每12h取樣一次測(cè)定表達(dá)的植酸酶的積累量并進(jìn)行表達(dá)蛋白的SDS-PAGE。
隨誘導(dǎo)時(shí)間增加發(fā)酵液中表達(dá)積累的植酸酶的SDS-PAGE分析見圖5。結(jié)果表明，表達(dá)的植酸酶隨誘導(dǎo)時(shí)間的增加而積累，在誘導(dǎo)106小時(shí)時(shí)達(dá)到高峰，這時(shí)的表達(dá)量達(dá)到4mg/mL發(fā)酵液，酶活性達(dá)到4×106U/mL發(fā)酵液。表達(dá)的酶蛋白分子量大小約為50kD，比植酸酶的理論分子量大5kDa左右，這可能是因?yàn)檫M(jìn)行了蛋白翻譯后修飾—糖基化。以上結(jié)果證明植酸酶基因不僅得到了表達(dá)、有效分泌，且表達(dá)的植酸酶具有正常的生物學(xué)活性。
在重組P.pastoris生長(zhǎng)、誘導(dǎo)表達(dá)的一個(gè)發(fā)酵周期結(jié)束后，直接取這種經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液做為種子液(接種量為1％)進(jìn)行下一輪的發(fā)酵過程，累計(jì)共進(jìn)行5輪，在每輪中均對(duì)菌株生長(zhǎng)的生物量和植酸酶表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定。另外，取每輪發(fā)酵完的菌體鋪完全培養(yǎng)基平板，挑取10個(gè)單菌落提取基因組DNA進(jìn)行appB的PCR檢測(cè)。結(jié)果表明(表1)，菌株生長(zhǎng)的生物量、速度及植酸酶的表達(dá)量在各輪中基本保持穩(wěn)定。PCR的結(jié)果也證明，經(jīng)過5輪的連續(xù)培養(yǎng)，appB依然穩(wěn)定整合在P.pastoris基因組中，這些結(jié)果證明重組P.pastoris不僅具有良好的遺傳穩(wěn)定性而且具有良好的植酸酶表達(dá)的穩(wěn)定性。
表1.重組畢赤酵母(P.pastoris pPFY02-33)的遺傳穩(wěn)定性及植酸酶基因表達(dá)的穩(wěn)定性傳種代數(shù)PCR陽性 生長(zhǎng)24h的生物量 誘導(dǎo)120h植酸酶表達(dá)量(菌體濕重g/L) (mg/mL)1 100％ 98.24.12 100％ 110.1 4.03 100％ 107.5 3.84 100％ 104.0 4.25 100％ 115.3 4.1序列表(一)一般信息1、申請(qǐng)人福建福大百特科技發(fā)展有限公司。
2、發(fā)明名稱植酸酶APPB及編碼該植酸酶的DNA3、序列數(shù)量24、聯(lián)系地址國(guó)別中國(guó)省份福建城市福州市地址古田路能源巷6號(hào)郵編3500055、代理人信息姓名林天凱代理人證號(hào)352010036、電信信息電話0591-3364424傳真0591-3358803(二)APPB ID NO1的信息1、序列特征(1)長(zhǎng)度432個(gè)氨基酸(2)類型氨基酸(3)拓?fù)鋵W(xué)線性2、分子類型蛋白質(zhì)3、假擬4、原始來源(1)生物體大腸桿菌(2)菌株E.coli DH5a5、序列描述APPB ID NO11 M K A I L I P F L S L L I P L T P Q S A F A Q S E P E L K L31 E S V V I V S R H G V R A P T K A T Q L L Q N V T P D A W P61 T W P V K L G W L T P R G G E L I A Y L G H Y Q R Q R L V A91 D G L L A K K G C P K S G Q V A I I A D V D E R T R K T G E121 A F A A G L A P D C A I T V H T Q A D T S S P D P L F N P L151 E T G V C Q L D N A N V T D A I L S R A G G S I A D F T G H181 R Q T A F R E L E R V L N F P Q S N L C D K R E K Q D E S C211 S L T Q A L P S E L K V S A D N V S L T G A V S L A S M L T241 E I F L L Q Q A Q G L M E P G W G R I T D S H Q W N T L L S271 L H N A Q F Y L L Q R T P E V A R S R A T P L L D L I K T A301 P P P H P P Q K Q A Y G V T L P T S V L F I A G H D T N L A331 N L G G A L E L N W T L P G Q P D N T P P G G E L V F E R W361 R R L S D N S Q W I Q V S L V F Q T L Q Q M R D K T P L S L391 N T P P G E V K L T L A G C E E R N A Q G M C S L A G F T Q
421 V N E A R I P A C S L(三)APPB ID NO2的信息1、序列特征(1)長(zhǎng)度1299個(gè)堿基對(duì)(2)類型核酸(3)拓?fù)鋵W(xué)單鏈2、分子類型DNA(基因組的)3、假擬無4、原始來源(1)生物體大腸桿菌(2)菌株E.coli DH5a序列描述APPB ID NO21ATGAAAGCGA TCTTAATCCC ATTTTTATCT CTTCTGATTC CGTTAACCCC GCAATCTGCA61 TTCGCTCAGA GTGAGCCGGA GCTGAAGCTG GAAAGTGTGG TGATTGTCAG TCGTCATGGT121 GTGCGTGCTC CAACCAAGGC CACGCAACTG TTGCAGAATG TCACCCCAGA CGCATGGCCA181 ACCTGGCCGG TAAAACTGGG TTGGCTGACA CCGCGAGGTG GTGAGCTAAT CGCCTATCTC241 GGACATTACC AACGCCAGCG TCTGGTAGCC GACGGATTGC TGGCGAAAAA GGGCTGCCCG301 AAGTCTGGTC AGGTCGCGAT TATTGCTGAT GTCGACGAGC GTACCCGTAA AACAGGCGAA361 GCCTTCGCCG CCGGGCTGGC ACCTGACTGT GCAATAACCG TACATACCCA GGCAGATACG421 TCCAGTCCCG ATCCGTTATT TAATCCTCTA GAAACTGGCG TTTGCCAACT GGATAACGCG481 AACGTGACTG ACGCGATCCT CAGCAGGGCA GGAGGGTCAA TTGCTGACTT TACCGGGCAT541 CGGCAAACGG CGTTTCGCGA ACTGGAACGG GTGCTTAATT TTCCGCAATC AAACTTGTGC601 GATAAACGTG AGAAACAGGA CGAAAGCTGT TCATTAACGC AGGCATTACC ATCGGAACTC661 AAGGTGAGCG CCGACAATGT CTCATTAACC GGTGCGGTAA GCCTCGCATC AATGCTGACG721 GAGATATTTC TCCTGCAACA AGCACAGGGA CTGATGGAGC CGGGGTGGGG AAGGATCACC781 GATTCACACC AGTGGAACAC CTTGCTAAGT TTGCATAACG CGCAATTTTA TTTGCTACAA841 CGCACGCCAG AGGTTGCCCG CAGCCGCGCC ACCCCGTTAT TAGATTTGAT CAAGACAGCG901 CCGCCGCCCC ATCCACCGCA AAAACAGGCG TATGGTGTGA CATTACCCAC TTCAGTGCTG961 TTTATCGCCG GACACGATAC TAATCTGGCA AATCTCGGCG GCGCACTGGA GCTCAACTGG1021 ACGCTTCCCG GTCAGCCGGA TAACACGCCG CCAGGTGGTG AACTGGTGTT TGAACGCTGG1081 CGTCGGCTAA GCGATAACAG CCAGTGGATT CAGGTTTCGC TGGTCTTCCA GACTTTACAG1141 CAGATGCGTG ATAAAACGCC GCTGTCATTA AATACGCCGC CCGGAGAGGT GAAACTGACC1201 CTGGCAGGAT GTGAAGAGCG AAATGCGCAG GGCATGTGTT CGTTGGCAGG TTTTACGCAA1261 ATCGTGAATG AAGCACGCAT ACCGGCGTGC AGTTTGTAA
權(quán)利要求
1.植酸酶APPB，其特征在于，它是一種具有APPB ID NO1所示的氨基酸序列的純化的植酸酶。
2.據(jù)權(quán)利要求1所述的植酸酶APPB，其特征在于，該植酸酶1)分子量為45Kda；2)活性的pH值范圍為2.0～7.5；3)穩(wěn)定性的pH值范圍為2.0～9.0；4)活性的溫度范圍為4～75℃；5)穩(wěn)定性的溫度范圍為4～75℃。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的植酸酶APPB，其特征在于，該植酸酶1)活性的最適pH值范圍為4.5；2)活性的最適溫度范圍為35～60℃。
4.編碼植酸酶APPB的DNA，其特征在于，它編碼如APPB ID NO1所示的氨基酸序列的純化的植酸酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的編碼植酸酶APPB的DNA，其特征在于，它具有APPB ID NO2所示的核苷酸序列。
6.一種復(fù)制和表達(dá)載體，其特征在于，它含有編碼如APPB ID NO1所示的氨基酸序列的純化的植酸酶的DNA。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種復(fù)制和表達(dá)載體，其特征在于，它具有APPB ID NO2所示的核苷酸序列。
8.一種宿主細(xì)胞，其特征在于，它由一種復(fù)制和表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染，該載體含有編碼如APPB ID NO1所示的氨基酸序列的純化的植酸酶的DNA。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種宿主細(xì)胞，其特征在于，該DNA具有APPB ID NO2所示的核苷酸序列。
10.一種動(dòng)物食品，其特征在于，它含有如APPB ID NO1所示氨基酸序列的植酸酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種植酸酶APPB；編碼該植酸酶的DNA；含有該植酸酶的表達(dá)載體；含有該表達(dá)載體的重組酵母細(xì)胞；含有該植酸酶的動(dòng)物食品。該植酸酶APPB比活性高、能同時(shí)抗胃蛋白酶和胰蛋白酶、表達(dá)能力強(qiáng)的，比現(xiàn)有植酸酶的生產(chǎn)成本降低，而含有該植酸酶的動(dòng)物飼料制品則可以用于酶解動(dòng)物體內(nèi)的植酸磷。
文檔編號(hào)C12N15/55GK1465698SQ02137869
公開日2004年1月7日 申請(qǐng)日期2002年6月26日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月26日
發(fā)明者姚斌, 饒平凡, 葉秀云, 陳躬瑞, 劉樹滔, 陳娟, 姚 斌 申請(qǐng)人:福建福大百特科技發(fā)展有限公司