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家蠶核型多角體病毒39k誘導(dǎo)型啟動子及其應(yīng)用的制作方法

文檔序號:584812閱讀:785來源:國知局
專利名稱:家蠶核型多角體病毒39k誘導(dǎo)型啟動子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域,特別涉及家蠶核型多角體病毒(Bombyx mori nuclearpolyhedrosis virus, BmNPV) 39k 誘導(dǎo)型啟動子及其應(yīng)用。
背景技術(shù)
家蠶是具有重要經(jīng)濟價值的鱗翅目昆蟲。BmNPV是蠶業(yè)生產(chǎn)上最常見且危害最嚴 重的一類病原,對蠶業(yè)影響巨大。如何利用當今發(fā)展迅速的基因工程技術(shù),從根本上提高 家蠶病毒抗性,是蠶業(yè)領(lǐng)域重要的研究課題?;蚯贸芯勘砻?,缺失某些增殖必需基因, BmNPV將不能增殖。因此,抑制這些病毒增殖必需基因的表達將成為防治家蠶感染BmNPV的 一種有效策略。RNA 干擾(RNA interference, RNAi)是指外源性雙鏈 RNA (double-strandedRNA, dsRNA)引發(fā)生物體內(nèi)同源mRNA降解從而表現(xiàn)出的基因轉(zhuǎn)錄后沉默現(xiàn)象,現(xiàn)已成為分子生 物學(xué)家分析基因組功能和基因治療的一個有力工具。小干擾RNA(small interference RNA, siRNA)是RNAi的效應(yīng)分子,是一類長21 23個核苷酸的雙鏈RNA,在體內(nèi)可特異性降 解與其序列互補的mRNA而引發(fā)RNA沉默。產(chǎn)生siRNA的方法有多種,其中化學(xué)合成法簡單 易行,但由于siRNA的穩(wěn)定性較差,在體內(nèi)易被核酸酶降解,RNAi干擾效應(yīng)時間短,因而分 子生物學(xué)家多采用siRNA表達載體法,即將短發(fā)卡RNA (short hairpin RNA,shRNA)對應(yīng)的 DNA模板序列插入載體啟動子后構(gòu)建RNAi載體,RNAi載體導(dǎo)入體內(nèi)后持續(xù)轉(zhuǎn)錄出shRNA, shRNA被RNaseIII家族的內(nèi)切核酸酶Dicer剪切成siRNA,從而引發(fā)較長時間的RNA沉默效 果。因此,利用RNAi技術(shù),以BmNPV增殖必需基因為靶標構(gòu)建RNAi載體,再將其導(dǎo)入家蠶 細胞并持續(xù)表達能夠?qū)е翨mNPV增殖必需基因mRNA降解的siRNA,是防治家蠶感染BmNPV 和培育家蠶抗病毒品系的有效手段。近年來,研究者先后利用T7啟動子,3XP3啟動子及IE-I啟動子等組成型啟動子 來構(gòu)建以BmNPV增殖必需基因為靶標的RNAi載體。雖然這些啟動子能夠誘發(fā)較高的RNAi 效率,但外源基因的組成性表達會對轉(zhuǎn)基因家蠶的發(fā)育和健康造成一定負面影響。根據(jù)桿 狀病毒基因轉(zhuǎn)錄的級聯(lián)模式,延遲早期基因的轉(zhuǎn)錄依賴于反式激活因子的基因產(chǎn)物,如果 在構(gòu)建RNAi載體時選擇由病毒感染所誘導(dǎo)的誘導(dǎo)型啟動子,則有望在病毒感染時迅速提 高siRNA表達水平,減少外源基因組成性表達的負荷,提高轉(zhuǎn)基因家蠶的健康性。但迄今為 止,尚未見有關(guān)BmNPV誘導(dǎo)型啟動子的研究報道。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此,本發(fā)明的目的之一在于提供一種BmNPV誘導(dǎo)型啟動子,具有明顯的 BmNPV誘導(dǎo)啟動活性,能使細胞在受到BmNPV感染時啟動外源基因的表達;目的之二在于提 供含有所述誘導(dǎo)型啟動子的重組表達載體;目的之三在于提供含有所述重組表達載體的轉(zhuǎn) 化體;目的之四在于提供所述誘導(dǎo)型啟動子的應(yīng)用。為達到上述目的,本發(fā)明采用如下技術(shù)方案
1、BmNPV 39k誘導(dǎo)型啟動子,其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。2、含有所述BmNPV 39k誘導(dǎo)型啟動子的重組表達載體。進一步,所述重組表達載體是以BmNPV增殖必需基因為靶標的RNAi載體,所述 RNAi載體包含由BmNPV 39k誘導(dǎo)型啟動子控制表達的shRNA,所述shRNA與BmNPV增殖必 需基因的mRNA具有同源性。3、含有所述重組表達載體的轉(zhuǎn)化體。4、所述BmNPV 39k誘導(dǎo)型啟動子在家蠶抗BmNPV品系的基因工程育種中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明提供了一種BmNPV 39k誘導(dǎo)型啟動子,具有明顯 的BmNPV誘導(dǎo)啟動活性,能使細胞在受到BmNPV感染時啟動外源基因的表達。利用本發(fā)明 的啟動子和shRNA可以構(gòu)建以BmNPV增殖必需基因為靶標的RNAi載體,在家蠶遭受BmNPV 感染時高豐度表達shRNA,shRNA在胞內(nèi)被酶剪切成siRNA,特異性降解BmNPV增殖必需基因 的mRNA,從而引發(fā)BmNPV增殖必需基因的轉(zhuǎn)錄后沉默,達到抑制病毒增殖的目的,可用于家 蠶感染BmNPV的防治以及家蠶抗BmNPV品系的基因工程育種,同時也可為其他生物病毒病 的轉(zhuǎn)基因治療提供了很好的參考模式。由于BmNPV只感染昆蟲,因此,本發(fā)明的BmNPV 39k 誘導(dǎo)型啟動子對人畜及植物安全無害。


為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚,下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進 一步的詳細描述,其中圖1為克隆的含有BmNPV 39k啟動子序列與BmNPV基因組序列的比對結(jié)果;圖2為39k啟動子報告基因重組載體pGL3_39k的構(gòu)建示意圖;圖 3 為 39k 啟動子 RNAi 載體 pBac [39kP-dsIE2-A3_EGFP afm]的構(gòu)建示意圖;圖4為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pBac[39kP-dsIE2-A3-EGFP afm]的BmN-SWUl細胞的篩選結(jié)果 (IOX),A為熒光視野,B為白光視野;圖5為Bm-BacPAK6在感染后不同時間點穩(wěn)定轉(zhuǎn)染BmN-SWUl細胞中的增殖 情況,A、B、C 的病毒滴度依次為 1.014X 101Q、1. 014X107、l. 014X 106PFU/mL ;* 代表與 pBac [39kP-dsIE2-A3-EGFP afm]組相比,P < 0. 05 ;# 代表與空白組相比,P < 0. 05 ;圖6為野生型BmNPV在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染BmN-SWUl細胞中的增殖情況(1000X) ;A為白光 視野,B為熒光視野,C為AB疊加。
具體實施例方式以下將參照附圖,對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細的描述。優(yōu)選實施例中未注明 具體條件的實驗方法,通常按照常規(guī)條件,例如分子克隆實驗指南(第三版,J.薩姆布魯克 等著,黃培堂等譯,科學(xué)出版社,2002年)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。一、BmNPV誘導(dǎo)型啟動子的選擇與克隆從美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)下載BmNPV全基因組序列(NC001962. 1), 根據(jù)桿狀病毒的級聯(lián)調(diào)控特征,延遲早期基因啟動子(β基因)受到立即早期基因(α基 因)產(chǎn)物的激活調(diào)控作用,選擇BmNPV延遲早期基因39k啟動子作為候選啟動子。通過Primer Premier 5. 0軟件設(shè)計如下PCR特異引物上游引物39kP_F :5,_cccaagctttgttgctccggcatgttt-3' (SEQ ID No. 2),下劃線部分為 Hind III 酶切位點;下游引 物 39kP~R :5,-ggggtacccttgacccgaagcgaaat-3,(SEQ ID No. 3),下劃線部分為 Kpn I 酶切 位點。以BmNPV全基因組為模板,以39kP-F和39kP_R為引物,PCR擴增長度為362bp的含 有39k啟動子片段,PCR程序為94°C預(yù)變性5分鐘;然后94°C變性50秒,58°C退火50秒, 72°C延伸2分鐘,共30個循環(huán);最后72°C延伸10分鐘。所得PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳 鑒定、切膠回收純化后,與T載體pMD19-T連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞, 用含有氨芐青霉素(Amp)的LB平板篩選陽性克隆,挑取陽性克隆單菌落,用含有Amp的LB 培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒,測序,將陽性克隆質(zhì)粒命名為pMD19-T-39k。將克隆的含有39k啟動子片段的序列與BmNPV基因組序列進行比對,結(jié)果如圖1 所示,克隆的含有39k啟動子片段包含啟動子轉(zhuǎn)錄核心區(qū)域,存在明顯的桿狀病毒啟動子 特征序列,在轉(zhuǎn)錄起始位點(cat)上游含有真核啟動子TATA盒(142 148bp的tataaaa 以及152 158bp的tatataa)、早期基因轉(zhuǎn)錄起始位點的保守序列(cagt)和翻譯起始密碼 子(atg),序列上符合真核生物啟動子的特點,局部位置存在突變。39k啟動子片段的序列 如 SEQ ID No. 1 所示。二、BmNPV誘導(dǎo)型啟動子的活性檢測U39k啟動子報告基因重組載體pGL3-39k的構(gòu)建及其在Sf9和BmN-SWUl細胞中 的相對熒光素酶活性檢測(1) 39k啟動子報告基因重組載體pGL3_39k的構(gòu)建39k啟動子報告基因重組載體pGL3_39k的構(gòu)建示意圖如圖2所示,將重組載體 pMD19-T-39k用Hind III和Kpn I雙酶切,雙酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定、切膠回收純 化后,與同樣經(jīng)Hind III和Kpn I雙酶切的雙熒光素酶報告基因檢測載體pGL3-BasiC連 接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞,用含有Amp的LB平板篩選陽性克隆,挑取陽 性克隆單菌落,用含有Amp的LB培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒,Hind III和Kpn I雙酶切鑒 定,將陽性克隆質(zhì)粒命名為pGL3-39k。(2) pGL3-39k轉(zhuǎn)染Sf9細胞的相對熒光素酶活性檢測將空載體pGL3-Basic、重組載體 pGL3_39k、pGL3_39k+BmNPV、 pGL3-39k+AcMNPV(苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒)分別用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑瞬時轉(zhuǎn)染草地 貪夜蛾細胞系Sf9,轉(zhuǎn)染后72小時收集、裂解細胞,離心取上清,用雙熒光素酶報告基因檢 測試劑盒測定裂解上清的螢火蟲熒光素酶活性(PPL)和海腎熒光素酶活性(PRL),計算相 對熒光素酶活性(PPL/PRL),考察轉(zhuǎn)染Sf9細胞的39k啟動子活性。結(jié)果見表l,39k啟動子 在異源細胞Sf9中的組成型表達活性較低;當sf9細胞被AcMNPV感染后,39k啟動子活性 顯著提高,相對熒光素酶活性由0. 4110提高至64. 9268,感染后約為感染前的158倍。表1轉(zhuǎn)染Sf9細胞的相對熒光素酶活性 注:*表示與pGL3-Basic組及空白組相比,P < 0.01o(3) pGL3-39k轉(zhuǎn)染BmN-SWUl細胞的相對熒光素酶活性檢測將空載體pGL3-Basic、重組載體pGL3-39k、pGL3_39k+BmNPV分別用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試 劑瞬時轉(zhuǎn)染家蠶卵巢細胞BmN-SWUl,分別于轉(zhuǎn)染后12、24、48、72小時收集、裂解細胞,離心 取上清,用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒測定裂解上清的PPL和PRL,計算相對熒光素酶 活性,考察轉(zhuǎn)染BmN-SWUl細胞在轉(zhuǎn)染后不同時間點的39k啟動子活性。結(jié)果見表2,39k啟 動子在BmN-SWUl細胞中有一定的組成型表達活性;當BmN-SWUl細胞被BmNPV感染后,39k 啟動子活性上調(diào)且隨著時間延長逐步提高,轉(zhuǎn)染后72小時39k啟動子活性顯著增加,相對 熒光素酶活性由6. 0151提高到12. 6497,感染后約為感染前的2. 103倍。表2轉(zhuǎn)染BmN-SWUl細胞在轉(zhuǎn)染后不同時間點的相對熒光素酶活性 注:*表示與pGL3-Basic組及空白組相比,P < 0.01o2,39k 啟動子 RNAi 載體 pBac[39kP-dsIE2-A3_EGFPafm]的構(gòu)建及其在 BmN-SWUl 細胞中的抗病毒活性檢測(1) 39k 啟動子 RNAi 載體 pBac [39kP-dsIE2-A3-EGFPafm]的構(gòu)建39k 啟動子 RNAi 載體 pBac[39kP-dsIE2-A3_EGFPafm]是以 BmNPV 增殖必需基因 IE-2為靶標的shRNA載體,為避免在構(gòu)建過程中IE-2正、反向片段配對導(dǎo)致載體結(jié)構(gòu)不穩(wěn) 定,采用將IE-2正、反向片段分別連接至中間載體的構(gòu)建策略。其構(gòu)建示意圖如圖3所示①PCR分別擴增載體構(gòu)建所需的各DNA片段,包括兩端帶有Hind III和Spe I 酶切位點的39k啟動子片段(SEQ ID No. 1)、兩端帶有Spe I和Pst I酶切位點的IE-2 正向片段(SEQ ID No. 4)、兩端帶有Pst I和Kpn I酶切位點的A3內(nèi)含子片段(SEQ ID No. 5)、兩端帶有Kpn I和BamH I酶切位點的IE-2反向片段(SEQ IDNo. 6)、以及兩端帶 有BamH I和EcoR I酶切位點的SV40終止序列(SEQ ID No. 7),再將各DNA片段分別連接入 T 載體 PMD19-T Simple 中,獲得重組載體 PMD19_T_39kP、PMD19-T-IE2S、PMD19-T-A3、 PMD19-T-IE2A 和 PMD19-T-SV40 ;②用Hind III 禾口 Spe I 分別酶切 PMD19_T_39kP 和載體 pSLfall80fa,回收 39k啟動子片段并連接入pSLfall80fa中,獲得重組載體PSLfall80fa_39kP ;再用Spe 和Pst I分別酶切PMD19-T-IE2S和pSLfall80fa-39kP,回收IE-2正向片段并連接入 pSLfall80fa-39kP 中,獲得重組載體 pSLfall80fa_39kP_IE2S ;③用Pst I和Kpn I分別酶切PMD19-T-A3和pSLfall80fa,回收A3內(nèi)含子片段 并連接入pSLfall80fa中,獲得重組載體pSLfall80fa_A3 ;再用BamH I和EcoRI分別酶 切 PMD19-T-SV40 和 pSLfall80fa_A3,回收 SV40 終止序列并連接入 pSLfall80fa_A3 中, 獲得重組載體pSLfall80fa-A3-SV40 ;再用Kpn I和BamH I分別酶切PMD19-T-IE2A和 pSLfall80fa-A3-SV40,回收IE-2反向片段并連接入pSLfall80fa-A3-SV40中,獲得重組載 體pSLfall80fa-A3-IE2A-SV40 ;④用Pst I 禾口 EcoR I 分另lj g| 切 pSLfal 180fa-A3-IE2A-SV40 禾口 pSLfal 180fa-39kP-IE2S,回收 A3-IE2A-SV40 片段并連接入 pSLfal 180fa_39kP_IE2S 中,獲 得重組載體 pSLfal 180fa-39kP-IE2S-A3-IE2A-SV40 ;⑤用ASC I 自 pSLfal 180fa-39kP-IE2S-A3-IE2A-SV40 中酶切出 39kP-IE2S-A3-IE2A-SV40 片段;同時用 Bgl II 酶切載體 piggyBac [A3-EGFP afm],補平末 端,將 39kP-IE2S-A3-IE2A-SV40 片段連接入 piggyBac [A3-EGFP afm]中,即得 39k 啟動子 RNAi 載體 pBac[39kP-dsIE2-A3-EGFP afm]。(2)pBac[39kP-dsIE2-A3-EGFP afm]轉(zhuǎn)染 BmN-SWUl 細胞的抗病毒活性檢測將39k啟動子RNAi載體pBac [39kP-dsIE2-A3_EGFP afm]用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑瞬時 轉(zhuǎn)染BmN-SWUl細胞,轉(zhuǎn)染后72小時用含有750 μ g/ml G418的培養(yǎng)基進行篩選培養(yǎng),近4 個月后獲得約有80%穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pBac[39kP-dsIE2-A3-EGFP afm]的BmN-SWUl細胞,如圖4 所示,綠色熒光細胞即為轉(zhuǎn)基因細胞。取pBac[39kP-dsIE2-A3_EGFP afm]轉(zhuǎn)基因細胞、piggyBac [A3-EGFP afm] 轉(zhuǎn)基因細胞和正常BmN-SWUl細胞(空白),接種不同稀釋度的線性化家蠶桿狀病毒 Bm-BacPAK6 (母液滴度為1. 014X 10nPFU/ml),分別于接種后不同時間點取培養(yǎng)基,利用 X-gal顯色檢測Bm-BacPAK6中β -半乳糖苷酶(LacZ)的表達,以觀察線性化病毒的增殖情 況。數(shù)據(jù)采用SPSS 13. O軟件的One-way ANOVA進行統(tǒng)計學(xué)分析,并進一步用LSD法和SNK 法分析組間顯著性差異。結(jié)果如圖5所示,當pBaC[39kP-dsIE2-A3-EGFP afm]轉(zhuǎn)基因細胞 受到較高滴度(1. 014X IOkiPFUAiI)的Bm-BacPAK6感染時,在病毒感染前期(48 84小 時)具有顯著的抗病毒效果(P < 0. 05);而受到較低滴度(1. 014 X IO7 1. 014 X IO6PFU/ ml)的Bm-BacPAK6感染時,在病毒感染后期(84 108小時)具有顯著的抗病毒效果(P < 0. 05)。取pBac[39kP-dsIE2-A3-EGFP afm]轉(zhuǎn)基因細胞,接種野生型BmNPV后,在熒光顯 微鏡下檢測病毒在細胞中的增殖情況。結(jié)果如圖6所示,發(fā)綠色熒光的轉(zhuǎn)基因細胞中未見 病毒多角體形成,而不發(fā)綠色熒光的非轉(zhuǎn)基因細胞中形成大量病毒多角體,說明轉(zhuǎn)基因細 胞對野生型BmNPV增殖的抑制作用很顯著。上述實驗結(jié)果證實BmNPV 39k啟動子為BmNPV誘導(dǎo)型啟動子,具有很高的BmNPV誘導(dǎo)啟動活性,能使細胞在受到BmNPV感染時啟動外源基因的表達。利用本發(fā)明的39k啟 動子和shRNA構(gòu)建以BmNPV增殖必需基因IE-2為靶標的RNAi載體,將其導(dǎo)入家蠶細胞后, 可以達到抑制BmNPV增殖的目的,可用于家蠶感染BmNPV的防治以及家蠶抗BmNPV品系的 基因工程育種。 最后說明的是,以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制,盡管通過參 照本發(fā)明的優(yōu)選實施例已經(jīng)對本發(fā)明進行了描述,但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當理解,可 以在形式上和細節(jié)上對其作出各種各樣的改變,而不偏離所附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明 的精神和范圍。
權(quán)利要求
家蠶核型多角體病毒39k誘導(dǎo)型啟動子,其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.含有權(quán)利要求1所述家蠶核型多角體病毒39k誘導(dǎo)型啟動子的重組表達載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述重組表達載體,其特征在于所述重組表達載體是以家蠶核型 多角體病毒增殖必需基因為靶標的RNA干擾載體,所述RNA干擾載體包含由家蠶核型多角 體病毒39k誘導(dǎo)型啟動子控制表達的短發(fā)卡RNA,所述短發(fā)卡RNA與家蠶核型多角體病毒增 殖必需基因的mRNA具有同源性。
4.含有權(quán)利要求2或3所述重組表達載體的轉(zhuǎn)化體。
5.權(quán)利要求1所述家蠶核型多角體病毒39k誘導(dǎo)型啟動子在家蠶抗核型多角體病毒品 系的基因工程育種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了家蠶核型多角體病毒(BmNPV)39k誘導(dǎo)型啟動子及其應(yīng)用,該啟動子的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示,其具有明顯的BmNPV誘導(dǎo)啟動活性,能使細胞在受到BmNPV感染時啟動外源基因的表達;利用該啟動子可以構(gòu)建以BmNPV增殖必需基因為靶標的RNAi載體,在家蠶遭受BmNPV感染時高豐度表達shRNA,shRNA在胞內(nèi)被酶剪切成siRNA,特異性降解BmNPV增殖必需基因mRNA,從而引發(fā)BmNPV增殖必需基因的轉(zhuǎn)錄后沉默,達到抑制病毒增殖的目的,可用于家蠶感染BmNPV的防治以及家蠶抗BmNPV品系的基因工程育種,同時也可為其他生物病毒病的轉(zhuǎn)基因治療提供很好的參考模式。
文檔編號C12N15/63GK101914537SQ20101023195
公開日2010年12月15日 申請日期2010年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月20日
發(fā)明者向仲懷, 夏慶友, 李娜, 潘敏慧, 趙愛春, 魯成 申請人:西南大學(xué)
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