專利名稱：一種羊水/絨毛膜細胞原位培養(yǎng)專用培養(yǎng)裝置及應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬細胞培養(yǎng)技術領域，涉及羊水/絨毛膜細胞原位培養(yǎng)皿，具體涉及一種 用于產(chǎn)前診斷中為羊水/絨毛膜細胞培養(yǎng)提供無菌環(huán)境的培養(yǎng)裝置。
背景技術：
羊水/絨毛膜細胞培養(yǎng)及染色體制備分析是產(chǎn)前診斷胎兒先天畸形、遺傳性疾病 最常用的方法，是染色體病產(chǎn)前診斷的主要手段。羊水內(nèi)的細胞大部分為羊膜上皮及胎兒 脫落上皮，后者來自胎兒的皮膚(包括汗腺及皮脂腺)、口腔粘膜、部分消化道、尿道和生殖 道，此外也有來自喉頭及氣管的內(nèi)胚層上皮。這些細胞脫落在羊水內(nèi)后，根據(jù)有活力細胞的 比例決定能否培養(yǎng)生長。由于羊水細胞培養(yǎng)一直存在技術要求高、難度大、培養(yǎng)時間長、易 污染、分裂相較少等問題，許多單位仍未能開展羊水產(chǎn)前診斷工作。近10年來，世界各地對 羊水細胞的培養(yǎng)及其在染色體制片上雖不斷有所改進，但羊水細胞培養(yǎng)與制片仍有一定難 度。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種羊水/絨毛膜細胞原位培養(yǎng)專用培養(yǎng)裝置，該培養(yǎng)裝置 由培養(yǎng)槽、玻片和培養(yǎng)蓋組成，其中，在培養(yǎng)槽中設置了加液孔，方便加液和換液操作，不會 影響已貼壁細胞的生長，在培養(yǎng)槽底部設置了 2個支撐條，既起到了抗震的作用，又方便取 用。其中玻片表面經(jīng)常規(guī)處理處理(如硅化處理、多聚賴氨酸處理、膠原蛋白處理等 常規(guī)處理)，適合細胞黏附生長。整個裝置用塑封包裝后經(jīng)鈷60滅菌處理以達到無菌。本裝置室溫保存。本發(fā)明的另一個目的是提供所述裝置在羊水/絨毛膜細胞原位培養(yǎng)中應用。本發(fā)明羊水/絨毛膜細胞原位培養(yǎng)皿使用方法細胞原位培養(yǎng)程序1.接種取Iml含培養(yǎng)基的羊水/絨毛膜細胞懸液輕輕滴到培養(yǎng)槽內(nèi)的玻片上。2.放37°C，含5%二氧化碳氣體濃度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，避免機械性的不平衡。 3. 6-12小時后添加入4ml新鮮的培養(yǎng)基。4.換液接種后第6天，吸棄培養(yǎng)槽內(nèi)的培養(yǎng)液，加5ml新鮮的培養(yǎng)基。5.第7或第8天在倒置顯微鏡下視細胞生長情況加秋水仙素或秋水仙胺終止培養(yǎng)。6.放37°C，含5%二氧化碳氣體濃度的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)60-90分鐘。染色體制片程序1.完全吸棄培養(yǎng)槽內(nèi)的培養(yǎng)液。2.低滲處理加6ml低滲液，在室溫下放置10分鐘。3.預固定在培養(yǎng)槽中加入2ml新鮮配制的固定液(甲醇醋酸=3 1體積)，室溫下放置2-3分鐘。4.固定吸棄培養(yǎng)槽內(nèi)的液體，加入6ml固定液，室溫下放置5分鐘。5.重復步驟2次。6.取出玻片，快速過火10-15次。7.玻片放80°C烤箱1. 5 2小時，G顯帶(18秒-20秒)、染色(3-5分)。8.顯微鏡下核型分析。本培養(yǎng)皿細胞培養(yǎng)技術的基本原理直接將羊水/絨毛膜細胞接種在玻片上，等 細胞貼壁生長成多個克隆，而后在玻片上加秋水仙素，低滲，固定及分帶染色，最后直接在 顯微鏡下進行核型分析。本發(fā)明的有益之處是實現(xiàn)了直接將羊水/絨毛膜細胞接種在玻片上，一張玻片 可形成多個克隆，后續(xù)分析可直接在克隆原位置進行；有效地解決了以往培養(yǎng)瓶方法集中 收獲細胞而不能區(qū)分開嵌合體來源于哪個克隆細胞群的問題；由于每個克隆的細胞各自分 開，可以計數(shù)有幾個克隆有異常染色體，幾個克隆是正常染色體，從而能排除離體培養(yǎng)中個 別細胞的染色體變異并能準確地計算嵌合比例，解決了嵌合體難判斷的難題。本發(fā)明裝置 設計合理，操作簡便，是一種無菌環(huán)境的培養(yǎng)裝置，實現(xiàn)了直接在玻片上進行羊水/絨毛膜 細胞原位培養(yǎng)和核型分析的方法。


圖1為本發(fā)明的結構示意圖。圖2是21三體患者核型譜圖。圖3是13三體患者核型譜圖。圖4是特納氏綜合征患者核型譜圖。圖5是正常人核型譜圖。
具體實施例方式本發(fā)明結合附圖和具體實施例作進一步說明。應該理解，這些實施例僅用于說明 目的，而不用于限制本發(fā)明范圍。實施例1參見圖1，該培養(yǎng)裝置由培養(yǎng)蓋1、培養(yǎng)槽2和玻片3組成，其中，在培養(yǎng)槽2中設 置了加液孔2a，方便加液和換液操作，不會影響已貼壁細胞的生長，在培養(yǎng)槽2底部設置了 2個支撐條4a和4b，既起到了抗震的作用，又方便取用。其中玻片3經(jīng)表面處理(硅化處理是通過在玻片上形成硅氧共價鍵，增加細胞在 玻片上的黏附性，膠原蛋白或多聚賴氨酸等處理的原理是通過在玻片表面涂染這類物質(zhì)后 利于羊水細胞等貼壁，阻止細胞隨意游動)，適合細胞黏附生長。整個裝置用塑封包裝后經(jīng) 鈷60滅菌處理以達到無菌。本裝置室溫保存。實施例2應用本培養(yǎng)裝置對2000余例羊水/絨毛膜標本進行細胞培養(yǎng)及核型分析。累計 檢測出唐氏綜合癥(21三體)胎兒1例，Patau綜合癥(13三體)胎兒1例，特納氏綜合征(X，0)胎兒1例。唐氏綜合癥、Patau綜合癥、特納綜合征及正常胎兒的核型分析圖譜結果 分別參見圖2、3、4、5。試劑材料實施例所描述細胞原位培養(yǎng)皿；標本浙江省婦幼保健院產(chǎn)前門診的羊水/絨毛膜標本；檢測方法細胞培養(yǎng)1.羊水標本(約15-20ml)等分到2個離心管，1000轉/分鐘速度離心10分鐘。2.棄上清液，每個離心管保留細胞懸液約0. 5ml，依據(jù)沉淀大小估計補加入培養(yǎng) 基后混勻(每個離心管可加不同廠家培養(yǎng)基)。3.準備幾個培養(yǎng)皿，編號后備用。將細胞懸液平分到幾個培養(yǎng)皿中(lml/培養(yǎng) 皿)；將培養(yǎng)皿放入37°C二氧化碳培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。4.第二天在每個培養(yǎng)皿中各加入4ml培養(yǎng)基，放37°C二氧化碳培養(yǎng)箱繼續(xù)靜置培養(yǎng)。5. 4 5天后，觀察細胞貼壁生長狀況(有大小克隆5-6片即可換液)，先吸棄培 養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)液，再加入5ml預熱到37°C的培養(yǎng)基。6. 1天后視細胞的生長狀況(細胞克隆數(shù)多于5個，每個克隆群的細胞數(shù)量大于 50個)，往培養(yǎng)皿中加入秋水仙素收獲細胞。染色體制備1.吸棄培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)液。2.每個培養(yǎng)皿加6ml低滲液，室溫放置10分鐘。3.加2ml固定液預固定，室溫放置2-3分鐘。4.棄去培養(yǎng)皿內(nèi)的液體，加6ml固定液固定，室溫放置10分鐘。5.重復固定2次。6.棄固定液，用尖頭鑷子從培養(yǎng)皿中取出玻片，快速過火10-15次；7.在玻片上標記姓名、病例編號，80度烤玻片1.5 2小時，G顯帶(18秒-20 秒)、染色(3-5分)、閱片本發(fā)明是結合羊水/絨毛膜細胞原位培養(yǎng)皿進行描述的，然而在閱讀了本發(fā)明的 上述內(nèi)容后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本 申請所附權利要求書所限定的范圍。
權利要求
一種羊水/絨毛膜細胞原位培養(yǎng)專用培養(yǎng)裝置，由培養(yǎng)蓋(1)、培養(yǎng)槽(2)和玻片(3)組成，其中，在培養(yǎng)槽(2)中設置加液孔(2a)，在培養(yǎng)槽(2)底部設置支撐條(4a)和支撐條(4b)。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種羊水/絨毛膜細胞原位培養(yǎng)專用培養(yǎng)裝置，其特征在于， 所述玻片(3)表面經(jīng)硅化處理、多聚賴氨酸處理或膠原蛋白處理。
3.根據(jù)權利要求1所述的一種羊水/絨毛膜細胞原位培養(yǎng)專用培養(yǎng)裝置，其特征在于， 整個裝置用塑封包裝后經(jīng)鈷60滅菌處理。
4.根據(jù)權利要求1所述的一種羊水/絨毛膜細胞原位培養(yǎng)專用培養(yǎng)裝置，其特征在于， 所述裝置室溫保存。
5.根據(jù)權利要求1所述的一種羊水/絨毛膜細胞原位培養(yǎng)專用培養(yǎng)裝置在原位培養(yǎng)羊 水/絨毛膜細胞中的應用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種羊水/絨毛膜細胞原位培養(yǎng)專用培養(yǎng)裝置，由培養(yǎng)槽、玻片和培養(yǎng)蓋組成，在培養(yǎng)槽中設置加液孔，方便加液和換液操作，不會影響已貼壁細胞的生長，在培養(yǎng)槽底部設置2個支撐條，既起到了抗震的作用，又方便取用。本發(fā)明實現(xiàn)了直接將羊水/絨毛膜細胞接種在玻片上，一張玻片可形成多個克隆，后續(xù)分析也是直接在克隆原位置進行。有效地解決了以往培養(yǎng)瓶方法集中收獲細胞而不能區(qū)分開嵌合體來源于哪個克隆細胞群的問題。由于每個克隆的細胞各自分開，可計數(shù)有幾個克隆有異常染色體，幾個克隆是正常染色體，從而能排除離體培養(yǎng)中個別細胞的染色體變異并能準確地計算嵌合比例，解決了嵌合體難判斷的難題。
文檔編號C12M1/22GK101892155SQ201010231619
公開日2010年11月24日 申請日期2010年7月20日 優(yōu)先權日2010年7月20日
發(fā)明者張民, 王強, 黃成剛 申請人:杭州寶榮科技有限公司