一種載玻片原位培養(yǎng)羊水細胞及核型處理分析的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種載玻片原位培養(yǎng)羊水細胞及核型處理分析的方法，本發(fā)明在以前的研究基礎上進一步提高，采用特定濃度和種類的低滲液、預固定液，嚴格控制染色體分散時分散環(huán)境的溫度和濕度，以獲得豐富的優(yōu)質分裂相，此技術將為高通量自動掃描捕獲體系提供了基礎技術平臺，建立自動化閱片流程，提升臨床工作效率。
【專利說明】一種載玻片原位培養(yǎng)羊水細胞及核型處理分析的方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種羊水細胞培養(yǎng)領域，具體涉及一種載玻片原位培養(yǎng)羊水細胞及核 型處理分析的方法。

【背景技術】
[0002] 羊水細胞培養(yǎng)及核型分析是產前診斷的關鍵技術，該技術需要歷經羊水細胞貼 壁、收獲(低滲、預固定)、制片（染色體分散)、顯微鏡下拍取核型以及核型分析等諸多步驟， 以完成最終的臨床報告。隨著產前篩查不斷普及和產前診斷需求量急速增加的狀況，傳統(tǒng) 的羊水細胞培養(yǎng)(耗時、耗力）無法滿足臨床需求，且傳統(tǒng)的羊水細胞培養(yǎng)步驟繁多，制片質 量不穩(wěn)定，不宜于產前診斷質量控制。為了縮短培養(yǎng)時間，提高工作效率，研究人員成功研 制自動核型掃描儀，即將顯微鏡與自動進片的軌道相連接，以實現(xiàn)24小時無人值守全自動 換片、取片、掃描、滴油、采集核型。該儀器在外周血及FISH核型捕獲中顯示快速、省力的極 好效果，但羊水原位培養(yǎng)的細胞貼壁于4X6cm 2的塑料培養(yǎng)瓶，塑料瓶底片不平整、厚度太 高，顯微鏡無法自動調節(jié)焦距自動掃描捕獲。國外普遍采取蓋玻片法，該法將細胞貼壁在蓋 玻片，以培養(yǎng)平皿為載體，收獲細胞后移出蓋玻片到載玻片上，再用膠粘附實現(xiàn)核型分析， 但由于粘附劑關系，厚度不適合顯微鏡調節(jié)聚焦，或以反面自動閱片，效果局限。載玻片原 位培養(yǎng)羊水細胞可以解決上述兩種方法的不足。Tabor等使用NUNC公司的載玻片培養(yǎng)皿進 行羊水細胞原位培養(yǎng)，但分析成本太高，國內不易普及。


【發(fā)明內容】

[0003] 為了解決現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種載玻片原位培養(yǎng)羊水細胞 及核型處理分析的方法。
[0004] 本發(fā)明采用的技術解決方案是：一種載玻片原位培養(yǎng)羊水細胞的方法，包括以下 步驟： (1) 接種：將每個羊水細胞標本取18-22ml，無菌分入尖底離心管2管，9-1 Iml/管，平 衡離心lOmin，轉速為1200rpm，各管留取0. 5ml細胞懸液，各加入I. 5ml羊水培養(yǎng)基，充分 混勻，平鋪于載玻片的細胞貼壁面，在37°C，5% CO2的條件下培育2天，2天后在載玻片內 再緩慢添加3ml羊水培養(yǎng)基，新添加的培養(yǎng)基與舊培養(yǎng)基混合均勻，重新置于37°C，5% CO2 的條件下培育5天； (2) 換液：待羊水細胞培養(yǎng)至7-8天，倒置于顯微鏡下觀察生長進展，待克隆細胞群增 殖，用2ml/瓶新鮮的羊水培養(yǎng)基替換舊培養(yǎng)基，待第二天即收獲包含原位培養(yǎng)的羊水細胞 載玻片。
[0005] 所述的一種載玻片原位培養(yǎng)羊水細胞的方法，所述的步驟（1)中細胞懸液為羊水 細胞沉淀和羊水。
[0006] 一種羊水細胞核型處理分析的方法，包括以下步驟： (1)收獲、制片：在含原位培養(yǎng)的羊水細胞載玻片中加入秋水仙素，搖勻，再置入5% C02, 37°C培養(yǎng)箱25min，棄去上清液； (2)低滲：羊水細胞載玻片中緩慢加入預溫37°C的低滲液6ml，室溫平置25min ; (3 )預固定：緩慢抽取載玻片的上清液，棄之，后緩慢加預固定液6ml，7min之后，棄上 清液，再加入4ml新鮮固定液，沖洗細胞壁，棄上清液； (4) 固定：再在載玻片中加如新鮮固定液6ml，室溫靜置lOmin，棄上清液； (5) 重復第（4)步步驟2次，靜置時間縮短為Imin ; (6) 用鑷子取出載玻片，用紗布吸去多余的固定液，放入染色體分散儀器中，設定溫度 為21 °C，濕度為30或33%，待載玻片完全干燥； (7) 將載玻片置于烘箱65°C下烤片2h，取出載玻片后，lmg/ml胰酶浸泡處理16-20s， Giemsa染液浸泡處理IOmin ; (8) 拍取核型：采用顯微鏡拍取羊水細胞載玻片：，GLS-120自動核型掃描儀捕獲采集 染色體核型。
[0007] 所述的一種羊水細胞核型處理分析的方法，其特征在于：所述的秋水仙素濃度為 20ug/ml。
[0008] 所述的一種羊水細胞核型處理分析的方法，其特征在于：所述的低滲液為濃度1% 的枸櫞酸鈉。
[0009] 所述的一種羊水細胞核型處理分析的方法，其特征在于：所述的預固定液為濃度 5%的冰醋酸。
[0010] 所述的一種羊水細胞核型處理分析的方法，其特征在于：所述的固定液為甲醇： 冰乙酸=3 :1的卡諾固定液。
[0011] 所述的一種羊水細胞核型處理分析的方法，其特征在于：所述的Giemsa染液成份 為1 :10的Giemsa原液與PH6. 8的磷酸緩沖液。
[0012] 本發(fā)明得到的有益效果是：本發(fā)明提供了一種載玻片原位培養(yǎng)羊水細胞及核型處 理分析的方法，本發(fā)明在以前的研究基礎上進一步提高，采用特定濃度和種類的低滲液、低 滲時間、預固定液、預固定時間、固定液、固定時間以及嚴格控制染色體分散時分散環(huán)境的 溫度和濕度，以獲得豐富的優(yōu)質分裂相，此技術將為高通量自動掃描捕獲體系提供了基礎 技術平臺，建立自動化閱片流程，提升臨床工作效率，本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：（1) 本發(fā)明不干擾產前診斷程序，不增加羊水穿刺次數(shù)及羊水量，不存在倫理問題；（2)本發(fā)明 所涉及的試劑為自配試劑，原材料均可國內購買，無需額外增加試劑，不增加成本；（3)本 發(fā)明建立的羊水原位培養(yǎng)方法可以用于自動顯微鏡掃描，解決了產前診斷自動化關鍵技 術，且建立規(guī)范化流程，達到制片質量穩(wěn)定，獲得培養(yǎng)克隆豐富、分裂相優(yōu)質，成功率高等特 點；（4)本發(fā)明可采用國產載玻片，獲得細胞克隆數(shù)和有效分裂相數(shù)能力不亞于進口載玻 片，且國產載玻片價格低。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013] 圖1為本發(fā)明的國產載玻片無菌培養(yǎng)盒。
[0014] 圖2:為本發(fā)明載玻片示意圖。
[0015] 圖3為本發(fā)明羊水細胞生長圖。
[0016] 圖4為染色體核型分散質量評估對照圖。
[0017] 其中圖2中：a為載玻片標記處；b為載玻片細胞貼壁面。
[0018]

【具體實施方式】： 下面結合說明書附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明做進一步說明。
[0019] 下面結合具體實施例對本技術進行進一步描述(本發(fā)明的試劑除特殊說明外，國 產載玻片購自杭州寶榮公司；進口載玻片為意大利Euroclone ;羊水培養(yǎng)基為以色列的 BI0AMF-2 培養(yǎng)基）： 實施例1 :國產載玻片與進口載玻片同步培養(yǎng)羊水細胞 (1)接種：選取10個羊水標本，每個標本取18-22ml。無菌分入尖底離心管2管， 9-llml/管，平衡離心lOmin，轉速為1200rpm，各管留取0. 5ml細胞懸液(羊水細胞沉淀+少 許羊水)，各加入1.5ml羊水培養(yǎng)基，分別平鋪于國產載玻片、進口原裝載玻片培養(yǎng)瓶的細胞 貼壁面（圖2b)，在37°C，5% CO2的條件下培育2天，最少的機械干擾，2天后在載玻片的標 記處（圖2a)再添加3ml羊水培養(yǎng)基，新添加的培養(yǎng)基與舊培養(yǎng)基混合均勻，重新置于37°C， 5% CO2的條件下培育5天。
[0020] (2)換液：待羊水細胞培養(yǎng)至7-8天，倒置于顯微鏡下觀察生長進展，待克隆細胞 群增多，面積大，透亮細胞多時，用2ml/瓶新鮮的羊水培養(yǎng)基替換舊培養(yǎng)基，待第二天即收 獲包含原位培養(yǎng)的羊水細胞載玻片。原來的培養(yǎng)物傳代到對應組織細胞培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)生 長，待出報告后，棄之。
[0021] (3)收獲、制片：在含原位培養(yǎng)的羊水細胞載玻片中加入秋水仙素，搖勻，再置入 5% C02 , 37°C培養(yǎng)箱25min，棄去上清液； (4) 低滲：羊水細胞載玻片中的標記處（圖2a)緩慢加入預溫37°C的低滲液6ml，低滲 液為濃度1%的枸櫞酸鈉，室溫平置25min ; (5) 預固定：在載玻片的標記處（圖2a)緩慢抽取載玻片的上清液，棄之，后緩慢加預固 定液6ml，預固定液為濃度5%的冰醋酸，7min之后，棄上清液，再加入4ml新鮮固定液，沖洗 細胞壁，棄上清液； (6) 固定：再在載玻片中加如新鮮固定液6ml，固定液為甲醇：冰乙酸=3 :1的卡諾固 定液，室溫靜置lOmin，棄上清液； (7) 重復固定步驟2次，靜置時間縮短為Imin ; (8) 用鑷子取出載玻片，玻片邊緣靠在紗布上，吸去多余的固定液，放入染色體分散儀 器中，設定溫度為21 °C，濕度為30或33%，待載玻片完全干燥； (9) 將載玻片置于烘箱65°C下烤片2h，取出載玻片后，lmg/ml胰酶浸泡處理16-20s， Giemsa染液浸泡處理lOmin，Giemsa染液成份為I : 10的Giemsa原液與PH6. 8的磷酸緩沖 液； (10) 拍取核型：采用GLS-120自動掃描捕獲體系捕獲染色體核型。染色體分散質量采 用數(shù)字評分：1)分散(不是所有染色體都在一個視野中);2)優(yōu)質(所有染色體都在一個視野 中，且染色體交叉少于或等于5條）；3)差(染色體交叉大于5條)。
[0022] (11)臨床報告：分析染色體核型，15個核型/人。
[0023] 上述步驟中所用的秋水仙素濃度為20ug/ml。
[0024] 3)計算載玻片上貼壁的細胞克隆數(shù)及優(yōu)質分裂相。載玻片上細胞克隆成片生長， 細胞計為60個。

【權利要求】
1. 一種載玻片原位培養(yǎng)羊水細胞的方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 接種：將每個羊水細胞標本取18_22ml，無菌分入尖底離心管2管，9-1 lml/管，平 衡離心lOmin，轉速為1200rpm，各管留取0. 5ml細胞懸液，各加入1. 5ml羊水培養(yǎng)基，充分 混勻，平鋪于載玻片的細胞貼壁面，在37°C，5% C02的條件下培育2天，2天后在載玻片內 再緩慢添加3ml羊水培養(yǎng)基，新添加的培養(yǎng)基與舊培養(yǎng)基混合均勻，重新置于37°C，5% C02的條件下培育5天； (2) 換液：待羊水細胞培養(yǎng)至7-8天，倒置于顯微鏡下觀察生長進展，待克隆細胞群增 殖，用2ml/瓶新鮮的羊水培養(yǎng)基替換舊培養(yǎng)基，待第二天即收獲包含原位培養(yǎng)的羊水細胞 載玻片。
2. 根據權利要求1所述的一種載玻片原位培養(yǎng)羊水細胞的方法，其特征在于：所述的 步驟（1)中細胞懸液為羊水細胞沉淀和羊水。
3. -種羊水細胞核型處理分析的方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 收獲、制片：在含原位培養(yǎng)的羊水細胞載玻片中加入秋水仙素，搖勻，再置入5% C02, 37°C培養(yǎng)箱25min，棄去上清液； (2) 低滲：羊水細胞載玻片中緩慢加入預溫37°C的低滲液6ml，室溫平置25min ; (3 )預固定：緩慢抽取載玻片的上清液，棄之，后緩慢加預固定液6ml，7min之后，棄上 清液，再加入4ml新鮮固定液，沖洗細胞壁，棄上清液； (4) 固定：再在載玻片中加如新鮮固定液6ml，室溫靜置lOmin，棄上清液； (5) 重復第（4)步步驟2次，靜置時間縮短為lmin ; (6) 用鑷子取出載玻片，用紗布吸去多余的固定液，放入染色體分散儀器中，設定溫度 為21 °C，濕度為30或33%，待載玻片完全干燥； (7) 將載玻片置于烘箱65°C下烤片2h，取出載玻片后，lmg/ml胰酶浸泡處理16-20s， Giemsa染液浸泡處理lOmin ; (8) 拍取核型：采用顯微鏡拍取羊水細胞載玻片：，GLS-120自動核型掃描儀捕獲采集 染色體核型。
4. 根據權利要求3所述的一種羊水細胞核型處理分析的方法，其特征在于：所述的秋 水仙素濃度為20ug/ml。
5. 根據權利要求3所述的一種羊水細胞核型處理分析的方法，其特征在于：所述的低 滲液為濃度1%的枸櫞酸鈉。
6. 根據權利要求3所述的一種羊水細胞核型處理分析的方法，其特征在于：所述的預 固定液為濃度5%的冰醋酸。
7. 根據權利要求3所述的一種羊水細胞核型處理分析的方法，其特征在于：所述的固 定液為甲醇：冰乙酸=3 :1的卡諾固定液。
8. 根據權利要求3所述的一種羊水細胞核型處理分析的方法，其特征在于：所述的 Giemsa染液成份為1 :10的Giemsa原液與PH6. 8的磷酸緩沖液。
【文檔編號】C12N5/071GK104498431SQ201510034434
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2015年1月23日 優(yōu)先權日:2015年1月23日
【發(fā)明者】唐少華, 林小玲, 鄭義 申請人:溫州市中心醫(yī)院