專利名稱：利用家蠶桿狀病毒體外表達系統(tǒng)合成蛋白質(zhì)的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)的合成方法，該方法利用家蠶桿狀病毒體外表達系 統(tǒng)合成蛋白質(zhì)的方法。
背景技術：
目前，已廣泛利用基因重組技術并使用酵母活細胞、昆蟲細胞等表達系統(tǒng) (以下簡稱細胞系統(tǒng))作為蛋白質(zhì)的生產(chǎn)方法。但是，活細胞由于其功能保 留而表現(xiàn)出外源蛋白質(zhì)消失的傾向，并且由于活細胞中細胞毒性蛋白質(zhì)的表達 阻止了細胞生長而存在許多不能被容易表達的蛋白質(zhì)。而體外表達系統(tǒng)相對而 言沒有上述細胞系統(tǒng)蛋白質(zhì)合成上的限制，并能在不傷害生物體的情況下合成 蛋白質(zhì)。另外由于蛋白質(zhì)的生產(chǎn)不伴有培養(yǎng)等操作，因而與細胞系統(tǒng)相比，可 在短時間內(nèi)合成蛋白質(zhì)。此外，由于體外表達系統(tǒng)還用來大規(guī)模生產(chǎn)由不被生 物體利用的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)，因而有望成為有前途的表達方法。
桿狀病毒表達系統(tǒng)可使高表達的外源蛋白在細胞內(nèi)進行正確折疊、二硫鍵 的搭配及寡聚物的形成提供良好的環(huán)境，可使表達產(chǎn)物在結構及功能上接近天 然蛋白。在桿狀病毒極晚期基因表達過程中，有種高效表達的蛋白，是pio蛋 白高效表達的極晚期蛋白為P10蛋白。P10基因現(xiàn)在已被定位和克隆這個基 因的啟動子具有較強的啟動能力，使外源基因能高水平表達。目前，利用桿狀 病毒P10基因啟動子進行體外蛋白表達的方法還未有報道。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術的不足之處，本發(fā)明的一種利用家蠶桿狀病毒體外表達系統(tǒng)
合成蛋白質(zhì)的方法在家蠶桿狀病毒提取液中加入pUC19-P10-GFP重組質(zhì)粒及 蛋白酶抑制劑，25-29'C水浴，即得目的蛋白的表達。
所述家蠶桿狀病毒提取液的制備方法包括取蠶蛹，接種桿狀病毒，待
蠶蛹發(fā)病后，冰上勻漿，吸取勻漿液于L5 ml EP管中，-80°C、 2(TC反復凍 融3次，4 。C， 18000 rpm離心15-30 min，取上清，重復兩次后，35000 rpm 超速離心30-60 min，吸取上清至新的1. 5 ml EP管中，用500 ul管子分裝， 每管50 ul，即用或存放于液氮中。
所述家蠶桿狀病毒提取液的制備方法包括接種桿狀病毒于家蠶細胞， 待細胞發(fā)病后，_80°C、 20。C反復凍融3次，4 。C， 18000 rpm離心15-30 min，重復兩次后，35000 rpm超速離心30-60 min，取上清至新的1. 5 ml EP 管中，用500 ul管子分裝，每管50 ul，即用或存放于液氮中。
所述pUC19-P10-GFP重組質(zhì)粒的制備方法包括 (O以家蠶桿狀病毒基因組DNA為模板，PCR擴增P10啟動子序列，PCR 所用的兩種引物為
L-l: 5，-atgaatcctgccggccgctccgtgtacggg-3， EcoRI位點； 2: 5，-gtggatccgatgatattgcagtcagtttgg-3， BamHI位點；
(2) 以質(zhì)粒pEGFP-Nl為模板，PCR擴增GFP報告基因序列，PCR所用的 兩種引物為
L-3: 5'-atggatccgtatgcatggtgagcaag-3'; BamHI位點； 4: 5'- tcgcatgcttacttgtacagctc-3'; Pael位點；
(3) 將P10啟動子序列片段和質(zhì)粒pUC19進行EcoRI、 BamHI雙酶切，37 'C反應2小時后分別回收酶切產(chǎn)物，再進行連接；轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞E.coli DH5a，得到pUC19-P10載體；
(4) 分別對GFP序列和載體pUC19-P10進行BamHI、 Pael雙酶切，37°C 反應2小時后分別回收酶切產(chǎn)物，再進行連接；轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞E.coli DH5a，得到pUC19-P10-GFP重組質(zhì)粒。
所述的蛋白酶抑制劑為PMSF蛋白酶抑制劑。
本發(fā)明的有益之處在于傳統(tǒng)的蛋白表達方法有兩個途徑， 一是原核表 達，它具有許多的優(yōu)點，如表達周期短，成本低，但有些基因在原核系統(tǒng)中的
持續(xù)表達可能會對宿主細胞產(chǎn)生毒害作用，目的蛋白常以包涵體形式表達，導 致產(chǎn)物純化困難，且不利于蛋白形成正確的構象；二是真核表達，它能誘導基 因高效表達，且能嚴格調(diào)控基因表達，但它受細胞培養(yǎng)的限制。本發(fā)明所述的 方法不受細胞的限制，可在短時間內(nèi)(3 — 6小時內(nèi))合成蛋白質(zhì)，以溶解狀態(tài) 存在，這有利于蛋白的分離純化，同時它屬于真核表達體系，有利于蛋白形成 正確的構象。


圖l、本發(fā)明的實施例的重組質(zhì)粒pUC19-P10-GFP。 圖2、本發(fā)明的實施例的蛋白表達電泳圖2: M，標準分子量蛋白；1， 0小時取樣；2， 3小時取樣；3， 6小時取 樣；4， 12小時取樣。
具體實施例方式
一、 家蠶桿狀病毒提取液的準備
1、 用家蠶蠶蛹制備桿狀病毒提取液
取蠶蛹若干，接種家蠶桿狀病毒(BraNPV，購自上海生化研究所)，待蠶 蛹發(fā)病后，冰上勻漿，吸取勻漿液于1.5 ml EP管中，-80°C、 20。C反復凍融3 次，4 °C， 18000 rpm離心20 min，取上清，重復兩次后，35000 rpm超速離 心30 min，吸取上清至新的1.5 ml EP管中，用500 ul管子分裝，每管50 ul，即為桿狀病毒提取液，即用或存放于液氮中。
2、 用家蠶Bm5細胞制備桿狀病毒提取液
接種桿狀病毒(BmNPV，購自上海生化研究所)于家蠶Bm5細胞，待細胞 發(fā)病后，-80°C、 20。C反復凍融3次，4 。C， 18000 rpm離心20 min，重復兩 次后，35000 rpm超速離心30 min，取上清至新的1. 5 ml EP管中，用500 ul 管子分裝，每管50ul，即為桿狀病毒提取液，即用或存放于液氮中。
二、 重組質(zhì)粒的構建 1.引物設計
LI: 5， -at卵atcctgccggccgctccgtgtacggg-3， (EcoRI位點)
L2: 5， -gtggatccgatgatattgcagtcagtttgg-3， (BamHI位點) 綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein, GFP)報告基因的引物 L-3: 5'- atggatccgtatgcatggtgagcaag -3'; (BamHI位點) L-4: 5'- tcgcatgcttacttgtacagctc -3'。 (PaeI位點)
2.P10啟動子序列的擴增
以家蠶桿狀病毒基因組DAN (NC-001875)為模板，以L-1、 L一2為引物， PCR反應參數(shù)為94。C預變性5min， 94。C變性30s， 68。C復性延伸lmin， 30個循 環(huán)，68。C延伸5min。
在一個無菌的0.5ml離心管中，混合下列成分
10xPCR Buffer 10nl 25mmol MgC12 8|il
2. 5 mmol dNTPs 8|il L-1
L-2 l^il
模板 1^1 KOD-Plus DNA聚合酶 (T0Y0B0公司，日本)lpl 加無菌雙蒸水至lOOiil
各組分混勻后，放入PCR儀中，按上述反應參數(shù)設計30個循環(huán)。待反應結 束后，電泳鑒定擴增片段，同時切膠回收目的片段，獲得P10啟動子。
3. GFP報告基因序列的擴增
以質(zhì)粒pEGFP-Nl (GE公司，Genbank U55762)為模板，PCR反應參數(shù)為94。C 預變性5min， 94'C變性30s， 68'C復性延伸lmin， 30個循環(huán)，68。C延伸5min。 在一個無菌的0.5ml離心管中，混合下列成分 10xPCR Buffer 10^1 25mmol MgC12 8|il 2. 5 ,1 dNTPs 8^1 L-3 l^il
L-4 模板
KOD-Plus DNA聚合酶(T0Y0B0公司，日本) 加無菌雙蒸水至100pl
各組分混勻后，放入PCR儀中，按上述反應參數(shù)設計30個循環(huán)。待反應結 束后，電泳鑒定擴增片段，同時切膠回收目的片段。 4. pUC19-P10載體的構建
分別對P10啟動子序列片段和質(zhì)粒pUC19 (promega公司)進行&oy I、 5aMH雙酶切，37'C反應2小時后分別回收酶切產(chǎn)物，再進行連接。 在一個無菌的0.2ml離心管中，混合下列成分
P10啟動子序列片段 2pl
質(zhì)粒pUC19 0.5^1
2xRapid Ligation buffer 5(il
T4 DNA ligase (購自promage公司) lpl
加無菌雙蒸水至10pl，混勻。25i:反應lh后，反應混合物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細 胞E.coli DH5a中。挑取單菌落，提取質(zhì)粒，進行酶切初步鑒定，經(jīng)測序，序 列完全正確，得pUC19-P10載體。
5. pUC19-P10-GFP重組質(zhì)粒的制備
分別對GFP序列和質(zhì)粒pUC19-P10進行勘WI、尸ael雙酶切，37。C反應2小時 后分別回收酶切產(chǎn)物，再進行連接。
在一個無菌的0. 2ml離心管中，混合下列成分
GFP序列片段 2pl
質(zhì)粒pUC19-P10 0. 5^1
2xRapid Ligation buffer 5(al
T4 DNA ligase (購自promage公司) ljxl
加無菌雙蒸水至10pl，混勻。25。C反應lh后，反應混合物轉(zhuǎn)化至感受態(tài) 細胞E.coli DH5a中。挑取單菌落，提取質(zhì)粒，進行酶切初步鑒定，經(jīng)測序， 序列完全正確，得pUC19-P10-GFP重組質(zhì)粒(圖l)。
本發(fā)明僅以P10啟動子、GFP為例，但P10啟動子可以用多角體 (polyhedrin)啟動子代替，GFP也可用其他可用于分子標記的基因代替，如 綠色熒光蛋白。
三、反應體系
在家蠶桿狀病毒提取液中加入pUC19-P10-GFP重組質(zhì)粒或含有外源基因的 pUC19-P10-GFP重組質(zhì)粒、PMSF蛋白酶抑制劑，25-29。C水浴，分0， 3h， 6h， 12h， 18h， 24h取樣。見圖2，在3小時后蛋白的表達量就可達到所需的量，6 小時表達.量最大，隨后，蛋白表達量將會降低。
三、電泳檢測表達產(chǎn)物
電泳結束后，在熒光顯微鏡下觀察，在488nm激發(fā)波長下觀察綠色熒光蛋 白GFP的表達，或用考染法觀測蛋白的表達。結果表明(圖2)，約在6小時 蛋白表達量較大。
最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的具體實施例子。顯然， 本發(fā)明不限于以上實施例子，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從 本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導出或聯(lián)想到的所有變形，均應認為是本發(fā)明的保護范 圍。
SEQ ID NO 1:
30 atgaatcctg
SEQ ID NO 2:
30 gtggatccga
SEQ ID NO 3: 26 atggatccgt SEQ ID NO 4:
23 tcgcatgctt
ccggccgctc
tgatattgca atgcatggtg acttgtacag
序列表
cgtgtacggg gtcagtttgg
3gC犯g
etc
權利要求
1、一種利用家蠶桿狀病毒體外表達系統(tǒng)合成蛋白質(zhì)的方法，其特征在于在家蠶桿狀病毒提取液中加入pUC19-P10-GFP重組質(zhì)粒及蛋白酶抑制劑，25-29℃水浴，即得目的蛋白的表達。
2、 根據(jù)權利要求1所述的利用家蠶桿狀病毒體外表達系統(tǒng)合成蛋白質(zhì)的方 法，其特征在于所述家蠶桿狀病毒提取液的制備方法包括取蠶蛹，接種桿狀 病毒，待蠶蛹發(fā)病后，冰上勻漿，吸取勻漿液于1.5mlEP管中，-8(TC、 20°C 反復凍融3次，4°C， 18000rpm離心15-30min，取上清，重復兩次后，35000 rpm超速離心30-60 min，吸取上清至新的L5 ml EP管中，用500 ul管子分 裝，每管50 ul，即用或存放于液氮中。
3、 根據(jù)權利要求1所述的利用家蠶桿狀病毒體外表達系統(tǒng)合成蛋白質(zhì)的方 法，其特征在于所述家蠶桿狀病毒提取液的制備方法包括接種桿狀病毒于家 蠶細胞，待細胞發(fā)病后，-80°C、 20。C反復凍融3次，4 。C， 18000 rpm離心15-30 min，重復兩次后，35000 rpm超速離心30-60 min，取上清至新的1.5 ml EP 管中，用500 ul管子分裝，每管50 ul，即用或存放于液氮中。
4、 根據(jù)權利要求l所述的利用家蠶桿狀病毒體外表達系統(tǒng)合成蛋白質(zhì)的方 法，其特征在于所述pUC19-P10-GFP重組質(zhì)粒的制備方法包括(1) 以家蠶桿狀病毒基因組DNA為模板，PCR擴增P10啟動子序列，PCR所用的兩種引物為5，-atgaa"tcctgccggccgctccg"tgtacggg-3' EcoRI位點； L-2.' 5'-gtggatccgatgatattgcagtcagtttgg-3， BamHI位點；(2) 以質(zhì)粒pEGFP-Nl為模板，PCR擴增GFP報告基因序列，PCR所用的兩 種引物為L-3: 5'-atggatccgtatgcatggtgagcaag-3'; BamHI位點；L-4: 5'- tcgcatgcttacttgtacagctc-3'; Pael位點；(3) 將P10啟動子序列片段和質(zhì)粒pUC19進行EcoRI、 BamHI雙酶切，37 "C反應2小時后分別回收酶切產(chǎn)物，再進行連接；轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞E.coli DH5a，得到pUC19-P10載體；(4) 分別對GFP序列和載體pUC19-P10進行BamHI、 Pael雙酶切，37"C反 應2小時后分別回收酶切產(chǎn)物，再進行連接；轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞E.coUDH5a， 得到pUC19-P10-GFP重組質(zhì)粒。
5、根據(jù)權利要求1所述的利用家蠶桿狀病毒體外表達系統(tǒng)合成蛋白質(zhì)的方 法，其特征在于所述的蛋白酶抑制劑為PMSF蛋白酶抑制劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用家蠶桿狀病毒體外表達系統(tǒng)合成蛋白質(zhì)的方法在家蠶桿狀病毒提取液中加入pUC19-P10-GFP重組質(zhì)粒及蛋白酶抑制劑，25-29℃水浴，即得目的蛋白的表達。本發(fā)明所述的方法不受細胞的限制，可在短時間內(nèi)(3-6小時內(nèi))合成蛋白質(zhì)，以溶解狀態(tài)存在，這有利于蛋白的分離純化，同時它屬于真核表達體系，有利于蛋白形成正確的構象。
文檔編號C12N15/866GK101358205SQ20081012047
公開日2009年2月4日 申請日期2008年8月29日 優(yōu)先權日2008年8月29日
發(fā)明者呂正兵, 夏佳音, 張耀洲, 清 盛, 聶作明, 健 陳, 琴 陳 申請人:浙江理工大學