一種用于全懸浮培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基及其制備方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供一種用于全懸浮培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基由以下組分組成：Grace’s Insect Medium培養(yǎng)基，BFPM401培養(yǎng)基，葡萄糖2?4g/L，水解乳蛋白1?3g/L，PF68 1?3g/L，酵母粉2?5g/L。本發(fā)明還提供其制備方法和應(yīng)用。經(jīng)試驗(yàn)，本發(fā)明無血清培養(yǎng)基能夠很好的全懸浮培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞，最大細(xì)胞增殖濃度分別為42.5×105/mL（培養(yǎng)Sf?21細(xì)胞）和45.4×105/mL（培養(yǎng)Hi?five細(xì)胞）。
【專利說明】
一種用于全懸浮培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基及其制備方法 和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物制品技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于全懸浮培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞的無血清 培養(yǎng)基。
【背景技術(shù)】
[0002] 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(Baculovirus Expression Vector System，BEVS)是以桿狀病 毒為載體，在昆蟲細(xì)胞上表達(dá)外源蛋白的真核表達(dá)系統(tǒng)。由于昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)能高水平 地生產(chǎn)異源蛋白質(zhì)，而且能保證異源蛋白質(zhì)的生物活性而被被應(yīng)用于醫(yī)療診斷、疫苗生產(chǎn) 方面。目前已上市的利用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的疫苗有豬瘟疫苗、豬圓環(huán)病毒2型疫 苗、宮頸癌疫苗和治療性前列腺癌疫苗等。另外，2013年美國Π)Α批準(zhǔn)了Flublok用于19至 49歲人群季節(jié)性流感的預(yù)防，F(xiàn)lublok也成為第一個(gè)用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的流感疫苗。
[0003] 到目前為止，全世界建立的昆蟲細(xì)胞系有800株以上，研究和應(yīng)用最多的是草地貪 夜蛾細(xì)胞系Sf-21及其克隆株Sf-9。上世紀(jì)90年代Granados和李國勛等人從粉紋夜蛾卵巢 細(xì)胞系BTI-TN-5B1克隆得到了具有外源基因高表達(dá)的新型宿主細(xì)胞，尤其對(duì)多角體病毒增 殖能力和重組蛋白表達(dá)水平特別高，BTI-TN-5B1-4因此而馳名，成為昆蟲桿狀病毒表達(dá)系 統(tǒng)的后起之秀，在商業(yè)上稱之為"高五"細(xì)胞，簡(jiǎn)稱"Hi-five"，在生物醫(yī)藥、動(dòng)物病毒疫苗研 究中開始廣泛應(yīng)用。由于以上三種昆蟲細(xì)胞在靜置培養(yǎng)時(shí)呈半貼壁狀態(tài)生長(zhǎng)，很容易馴化 成適應(yīng)懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞株。
[0004] 隨著昆蟲細(xì)胞體外培養(yǎng)的需要，昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基的研究當(dāng)然必不可少，目前成分 穩(wěn)定且廣泛應(yīng)用的商品化基礎(chǔ)培養(yǎng)基有Grace' S、IPL-41和TC-100,使用時(shí)通常要加 10%的 牛血清和4g/L酵母浸出液才能正常培養(yǎng)，由于使用時(shí)添加動(dòng)物血清增加了生物安全的風(fēng)險(xiǎn) 和下游純化工藝，另外酵母浸出液價(jià)格很貴。無血清培養(yǎng)基主要有Thermo Fisher Scientific公司的Sf-900TM、Express Five? SFM和HyQ SFX_Insect，LONZA公司的 fesect-XPRESSrM ,Sigma-Aldrich公司的EX-CELL ? 405、420和TiterHigliTM Medium 等。這些產(chǎn)品均為國外公司生產(chǎn)，由于中國沒有相應(yīng)的產(chǎn)品競(jìng)爭(zhēng)，外國公司給中國用戶的賣 價(jià)很高，如IL包裝的液體EX-CELL ? 405給中國用戶的直銷價(jià)為650元，導(dǎo)致工業(yè)用戶無法 生產(chǎn)。
[0005] Grace's Insect medium在一種基礎(chǔ)培養(yǎng)使用時(shí)需要加血清和酵母浸出液才能維 持昆蟲細(xì)胞生長(zhǎng)。無血清培養(yǎng)基BFPM401是一種國產(chǎn)的適合哺乳動(dòng)物細(xì)胞高密度的培養(yǎng)基， 目前沒有在昆蟲培養(yǎng)中進(jìn)行過培養(yǎng)的報(bào)道，本發(fā)明中單獨(dú)培養(yǎng)后細(xì)胞生長(zhǎng)也不理想。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供了一種用于全懸浮培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞的 無血清培養(yǎng)基，為應(yīng)用昆蟲細(xì)胞桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的研究和生產(chǎn)提供支撐。為此，本發(fā)明還 提供其制備方法和應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種用于全懸浮培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基，所述 培養(yǎng)基由以下組分組成:Grace's Insect Medium培養(yǎng)基，BFPM401培養(yǎng)基，葡萄糖2-4g/L， 水解乳蛋白 l_3g/L，PF68 l-3g/L，酵母粉2-5g/L。
[0008] 作為優(yōu)選，所述培養(yǎng)基由以下組分組成:Grace's Insect Medium培養(yǎng)基，BFPM401 培養(yǎng)基，葡萄糖3 · 075g/L，水解乳蛋白1 · 35g/L，PF68 2g/L，酵母粉4g/L。
[0009] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供上述無血清培養(yǎng)基的制備方法，IOL無血清培養(yǎng)基的 制備步驟如下： (1) 配制50倍酵母粉濃縮液:按照50倍濃縮液來計(jì)算酵母粉和注射用水用量，先用一半 重量的注射用水完全溶解酵母粉后，反復(fù)攪拌后置2-8°C下過夜，取出后再加入另一半重量 的注射用水，充分?jǐn)嚢韬筮^濾得濃縮液； (2) Grace's Insect Medium配制:配制略小于4.85L的溶液，其中各種溶質(zhì)的用量為5L 溶液時(shí)溶質(zhì)的用量，配制方法參見說明書，先不加碳酸氫鈉； (3 )無血清培養(yǎng)基BFPM401配制:配制略小于4.85L的溶液，其中各種溶質(zhì)的用量為5L溶 液時(shí)溶質(zhì)的用量，配制方法參見說明書，先不加碳酸氫鈉； (4)將以上兩種培養(yǎng)基合并到一起攪拌后，加入20-40g葡萄糖、10-30g水解乳蛋白、 100-250ml濃度50倍的酵母粉濃縮液和10-30g PF68，簡(jiǎn)單攪拌后再加12.752g碳酸氫鈉后 充分混勻，定容至IOL，調(diào)pH值到6.1 -6.2，即得。
[0010] 作為優(yōu)選，IOL無血清培養(yǎng)基的制備步驟如下： (1) 配制50倍酵母粉濃縮液:按照50倍濃縮液來計(jì)算酵母粉和注射用水用量，先用一半 重量的注射用水完全溶解酵母粉后，反復(fù)攪拌后置2_8°C下過夜，取出后再加入另一半重量 的注射用水，充分?jǐn)嚢韬筮^濾得濃縮液； (2) Grace' s Insect Medium配制：配制略小于4.9L的溶液，其中各種溶質(zhì)的用量為5L 溶液時(shí)溶質(zhì)的用量，配制方法參見說明書，先不加碳酸氫鈉； (3) 無血清培養(yǎng)基BFPM401配制:配制略小于4.9L的溶液，其中各種溶質(zhì)的用量為5L溶 液時(shí)溶質(zhì)的用量，配制方法參見說明書，先不加碳酸氫鈉； (4) 將以上兩種培養(yǎng)基合并到一起攪拌后，加入30.75g葡萄糖、13.5g水解乳蛋白、 200ml濃度50倍的酵母粉濃縮液和20g PF68，簡(jiǎn)單攪拌后再加12.752g碳酸氫鈉后充分混 勻，定容至10L，調(diào)pH值到6.16,即得。
[0011] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供上述無血清培養(yǎng)基在全懸浮培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞中的應(yīng)用。
[0012] 作為優(yōu)選，所述昆蟲細(xì)胞為Sf-21或Hi-five細(xì)胞。
[0013] 本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種全懸浮培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞的方法，將昆蟲細(xì)胞接種至 權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基中，不添加血清，置27-28°C 80-120rpm搖床培養(yǎng)。
[0014] 作為優(yōu)選，所述昆蟲細(xì)胞為Sf-21或Hi-five細(xì)胞。
[0015] 作為優(yōu)選，所述接種時(shí)接種量為4.0-7.0 X IO5AiL。
[0016] 作為優(yōu)選，將昆蟲細(xì)胞接種至權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基中，不添加血清，置28°C IOOrpm搖床培養(yǎng)。
[0017] 本發(fā)明的目的是提供一種用于昆蟲細(xì)胞全懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基是 Grace ' s Insect medium培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)基BFPM401以1:1比例混合培養(yǎng)基作為為基 礎(chǔ)，添加葡萄糖、水解乳蛋白、酵母粉溶液和PF-68等組成，適合昆蟲細(xì)胞的高密度懸浮培 養(yǎng)。用價(jià)格便宜的酵母粉制成溶液替代價(jià)格高的酵母浸出液，降低成本。本發(fā)明的培養(yǎng)基的 具體組分如表1-1至表1-4所示。
[0018]表1-1本發(fā)明的用于昆蟲細(xì)胞全懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)基的具體配方(單位:g/L)
表1-2本發(fā)明的用于昆蟲細(xì)胞全懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)基的具體配方(單位:g/L)
表1-3本發(fā)明的用于昆蟲細(xì)胞全懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)基的具體配方(單位:g/L)
表1-4本發(fā)明的用于昆蟲細(xì)胞全懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)基的具體配方(單位:g/L)
配制方式： 濃度50倍的酵母粉濃縮液配制：按1000 ml注射用水中加200g酵母粉的比例稱取酵母 粉，先用50%注射用水完全溶解酵母粉后放置在2-8°C下過夜，補(bǔ)足注射用水后攪拌后單層 普通濾紙過濾雜質(zhì)后備用。
[0019] 兩種培養(yǎng)基中各組分的用量參照表1，然后按配制說明書分別配制溶解后(此處先 不加碳酸氫鈉，注射用水加入大部分)混合到一起，再加入葡萄糖2_4g/L，水解乳蛋白l_3g/ L，PF68 l-3g/L，酵母粉濃縮液(酵母粉最終濃度為2-5g/L)充分混勻后，最后加碳酸氫鈉 1.2752g/L(原配方有中，到配液的這一步才加），定容，用IN氫氧化鈉或IN鹽酸調(diào)pH值到 6.1 -6.2，過濾除菌即得，在2-8 °C保存。
[0020] 昆蟲細(xì)胞（Sf-21或 Hi-five)以4.0-7.0\105/11^接種，不添加血清，在27-281€ 80-120rpm搖床培養(yǎng)，每24h計(jì)數(shù)細(xì)胞密度。
[0021] 經(jīng)試驗(yàn)，本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基能夠很好的全懸浮培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞，當(dāng)無血清培養(yǎng) 基的配方為:Grace ' S Insect Medium培養(yǎng)基，BFPM401培養(yǎng)基，葡萄糖3.075g/L，水解乳蛋 白1.35g/L，PF68 2g/L，酵母粉4g/L，培養(yǎng)基pH值為6.16時(shí)，細(xì)胞增殖濃度最大，最大細(xì)胞增 殖濃度分別為42.5 X 105/mL(培養(yǎng)Sf-21細(xì)胞)和45.4 X 105/mL(培養(yǎng)Hi-five細(xì)胞）。
【附圖說明】
[0022]附圖用來提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與本發(fā)明的實(shí) 施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。在附圖中： 圖1商品化培養(yǎng)基Grace's Insect medium加10%新生牛血清培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞的生長(zhǎng)曲 線； 圖2商品化培養(yǎng)基BFPM401加10%新生牛血清培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線； 圖3商品化培養(yǎng)基Grace's Insect medium:BFPM401(l:l)無血清培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞的生 長(zhǎng)曲線； 圖4本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基和商品化昆蟲細(xì)胞無血清培養(yǎng)基(HyQ SFX-Insect)培養(yǎng) sf-21細(xì)胞的結(jié)果比較圖； 圖5本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基和商品化昆蟲細(xì)胞無血清培養(yǎng)基(HyQ SFX-Insect)培養(yǎng) Hi-five細(xì)胞的結(jié)果比較圖； 圖6本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)sf-21細(xì)胞的形態(tài)圖（48h，20X); 圖7本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)Hi-five細(xì)胞的形態(tài)圖（48h，20X)。
【具體實(shí)施方式】
[0023]以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為市 售。
[0024] 實(shí)施例1 1材料與設(shè)備 1.1材料 昆蟲細(xì)胞:Sf-21、Hi-five(甘肅省動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)研究中心提供）； 培養(yǎng)基：Grace's Insect Medium干粉（Gibco)，無血清培養(yǎng)基BFPM401干粉(蘭州百 靈生物）； 對(duì)照用培養(yǎng)基HyQ SFX-Insect SFM(Hycl〇ne，為液體，直接使用），葡萄糖（國藥集團(tuán)）， 水解乳蛋白（HyClone)，Pluronic F_68(Gibco)，酵母粉（Organotechnie)等。
[0025] 1.2設(shè)備 倒置相差顯微鏡（CK40-32PH型，Olympus)，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(CASY TT型，INN0VATIS)，電子 天平(AR2140型，上海奧豪斯），搖床(2102C型，上海智誠），pH計(jì)(MP120-BLE型，梅特勒)等。
[0026] 2 方法 2.1配液 濃度50倍的酵母粉濃縮液配制:稱取200g酵母粉溶解到500ml注射用水中，反復(fù)攪拌后 置2-8°C冰箱，過夜后取出再加500ml注射用水充分?jǐn)嚢韬笥脝螌悠胀V紙過濾后備用。
[0027] Grace's Insect Medium配制：配制略小于4.85L的溶液，其中各種溶質(zhì)的用量為 5L溶液時(shí)溶質(zhì)的用量，配制方法參見說明書(先不加碳酸氫鈉）。
[0028] 無血清培養(yǎng)基BFPM401配制：配制略小于4.85L的溶液，其中各種溶質(zhì)的用量為5L 溶液時(shí)溶質(zhì)的用量，配制方法參見說明書(先不加碳酸氫鈉）。
[0029]將以上兩種培養(yǎng)基合并到一起簡(jiǎn)單攪拌后，加入20_40g葡萄糖、10_30g水解乳蛋 白、100-250ml濃度50倍的酵母粉濃縮液和10-30g PF68，簡(jiǎn)單攪拌后再加12.752g碳酸氫鈉 后充分混勻，定容至IOL，調(diào)pH值到6.16，過濾除菌在2-8 °C保存?zhèn)溆谩?br>[0030] 2.2細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞復(fù)蘇：用對(duì)照培養(yǎng)基HyQ SFX-Insect SFM按常規(guī)方法從液氮分別復(fù)蘇Sf-21 di-five 細(xì)胞 ，置 27 °C IOOrpm 搖床培養(yǎng) ，每 24h 計(jì)數(shù)細(xì)胞密度 。等細(xì)胞生長(zhǎng)致密度達(dá)到2 X IO6AiL 以上時(shí)進(jìn)行本發(fā)明培養(yǎng)基的測(cè)試。
[0031] 每一種細(xì)胞按6.0 X IO5AiL分別用本發(fā)明的培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基HyQ SFX-Insect SFM接種培養(yǎng)，不添加血清，置27 °C IOOrpm搖床，每24h計(jì)數(shù)細(xì)胞密度，連續(xù)培養(yǎng)三代，繪制三 個(gè)代次細(xì)胞計(jì)數(shù)平均值的生長(zhǎng)曲線。
[0032] 3結(jié)果 用本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基HyQ SFX-Insect SFM分別培養(yǎng)Sf-21、Hi-five 細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)均較好，能夠很好的全懸浮生長(zhǎng)。用本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的兩種細(xì)胞 的最大增殖濃度均稍高于進(jìn)口對(duì)照用培養(yǎng)基HyQ SFX-Insect SFM。
[0033] 經(jīng)試驗(yàn)，當(dāng)無血清培養(yǎng)基的配方為:Grace's Insect Medium培養(yǎng)基，BFPM401培養(yǎng) 基，葡萄糖3.075g/L，水解乳蛋白1.35g/L，PF68 2g/L，酵母粉4g/L;培養(yǎng)基pH值為6.16時(shí)， 細(xì)胞增殖濃度最大，此時(shí)，細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果的平均值見表2,生長(zhǎng)曲線見圖4和圖5,細(xì)胞形態(tài)見 圖6和圖7。
[0034] 表2兩種細(xì)胞培養(yǎng)三代計(jì)數(shù)結(jié)果平均值表（X IO5AiL)
最后應(yīng)說明的是：以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管 參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，其依然可以對(duì) 前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換。凡在 本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù) 范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于全懸浮培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基，其特征在于:所述培養(yǎng)基由以下組 分組成:Grace ' s Insect Medium培養(yǎng)基，BFPM401培養(yǎng)基，葡萄糖2-4g/L，水解乳蛋白l-3g/ L，PF68 l-3g/L，酵母粉2-5g/L。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的無血清培養(yǎng)基，其特征在于：所述培養(yǎng)基由以下組分組成： Grace' s Insect Medium培養(yǎng)基，BFPM401 培養(yǎng)基，葡萄糖3.075g/L，水解乳蛋白 1.35g/L， PF68 2g/L，酵母粉4g/L。3. 權(quán)利要求1所述的無血清培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于：10L無血清培養(yǎng)基的制備 步驟如下： (1) 配制50倍酵母粉濃縮液:按照50倍濃縮液來計(jì)算酵母粉和注射用水用量，先用一半 重量的注射用水完全溶解酵母粉后，反復(fù)攪拌后置2_8°C下過夜，取出后再加入另一半重量 的注射用水，充分?jǐn)嚢韬筮^濾得濃縮液； (2) Grace ' s Insect Medium配制：配制略小于4.85L的溶液，其中各種溶質(zhì)的用量為5L 溶液時(shí)溶質(zhì)的用量，配制方法參見說明書，先不加碳酸氫鈉； (3) 無血清培養(yǎng)基BFPM401配制：配制略小于4.85 L的溶液，其中各種溶質(zhì)的用量為5L 溶液時(shí)溶質(zhì)的用量，配制方法參見說明書，先不加碳酸氫鈉； (4) 將以上兩種培養(yǎng)基合并到一起攪拌后，加入20-40g葡萄糖、10-30g水解乳蛋白、 100-250ml濃度50倍的酵母粉濃縮液和10-30g PF68，簡(jiǎn)單攪拌后再加12.752g碳酸氫鈉后 充分混勻，定容至10L，調(diào)pH值到6.1 -6.2，即得。4. 權(quán)利要求2所述的無血清培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于：10L無血清培養(yǎng)基的制備 步驟如下： (1) 配制50倍酵母粉濃縮液:按照50倍濃縮液來計(jì)算酵母粉和注射用水用量，先用一半 重量的注射用水完全溶解酵母粉后，反復(fù)攪拌后置2_8°C下過夜，取出后再加入另一半重量 的注射用水，充分?jǐn)嚢韬筮^濾得濃縮液； (2) Grace ' s Insect Medium配制：配制略小于4.9L的溶液，其中各種溶質(zhì)的用量為5L 溶液時(shí)溶質(zhì)的用量，配制方法參見說明書，先不加碳酸氫鈉； (3) 無血清培養(yǎng)基BFPM401配制：配制略小于4.9L的溶液，其中各種溶質(zhì)的用量為5L溶 液時(shí)溶質(zhì)的用量，配制方法參見說明書，先不加碳酸氫鈉； (4) 將以上兩種培養(yǎng)基合并到一起攪拌后，加入30.75g葡萄糖、13.5g水解乳蛋白、 200ml濃度50倍的酵母粉濃縮液和20g PF68，簡(jiǎn)單攪拌后再加12.752g碳酸氫鈉后充分混 勻，定容至10L，調(diào)pH值到6.16,即得。5. 權(quán)利要求1或2所述的無血清培養(yǎng)基在全懸浮培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞中的應(yīng)用。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于:所述昆蟲細(xì)胞為Sf-21或Hi-five細(xì)胞。7. -種全懸浮培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞的方法，其特征在于:將昆蟲細(xì)胞接種至權(quán)利要求1所述的 培養(yǎng)基中，不添加血清，置27-28 °C 80-120rpm搖床培養(yǎng)。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于:所述昆蟲細(xì)胞為Sf-21或Hi-five細(xì)胞。9. 根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于:所述接種時(shí)接種量為4.0-7.0 X 105/mL。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于:將昆蟲細(xì)胞接種至權(quán)利要求1所述的培養(yǎng) 基中，不添加血清，置28°C lOOrpm搖床培養(yǎng)。
【文檔編號(hào)】C12N5/07GK105861416SQ201610391655
【公開日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年6月6日
【發(fā)明人】馬忠仁, 喬自林, 馬桂蘭, 馮玉萍, 馬偉, 王家敏, 馬祺
【申請(qǐng)人】西北民族大學(xué)