釀酒酵母代謝工程改造提高s-腺苷-l-蛋氨酸生產(chǎn)水平的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物技術(shù)、代謝工程領(lǐng)域,涉及一種通過(guò)代謝途徑改造來(lái)提高釀酒 酵母菌株生產(chǎn)s-腺苷-L-蛋氨酸能力的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] S-腺苷-L-蛋氨酸,簡(jiǎn)稱SAM,廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物細(xì)胞中,是一種重要 的代謝中間產(chǎn)物。作為胞內(nèi)甲基供體,SAM在核酸、蛋白質(zhì)以及脂類等分子的甲基化修飾中 扮演重要角色。同時(shí),SAM還參與胞內(nèi)的轉(zhuǎn)硫基反應(yīng)以及聚胺的合成等重要生化反應(yīng)。SAM也 是一種非常有價(jià)值的醫(yī)藥分子,在治療肝病、抑郁癥和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中發(fā)揮重要作用。
[0003] SAM在胞內(nèi)是經(jīng)過(guò)腺苷蛋氨酸合成酶催化,由蛋氨酸和ATP結(jié)合生成的。研究標(biāo)明, 胞質(zhì)內(nèi)過(guò)量的SAM對(duì)細(xì)胞毒害作用非常強(qiáng),SAM不能在細(xì)胞液中大量貯存。然而,酵母一類微 生物卻能在富含蛋氨酸的環(huán)境中大量合成并積累SAM,這是因?yàn)榻湍讣?xì)胞的液泡中含有大 量的帶負(fù)電荷的聚磷酸鹽,這些聚磷酸鹽能固定住帶正電荷的SAM。因此,酵母成為了工業(yè) 生產(chǎn)SAM的首選宿主。
[0004] 釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)具有遺傳背景清楚、食品級(jí)安全、抗逆性 強(qiáng)以及發(fā)酵條件容易控制等許多優(yōu)良特性,因此被廣泛用作食品、醫(yī)藥以及化工工業(yè)的生 產(chǎn)菌株。盡管天然的釀酒酵母生產(chǎn)腺苷蛋氨酸能力已經(jīng)很強(qiáng),但還是不能滿足市場(chǎng)日益增 長(zhǎng)的需求,尋求更多途徑繼續(xù)提高腺苷蛋氨酸的產(chǎn)量的任務(wù)迫在眉睫。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 本發(fā)明的目的是為滿足腺苷蛋氨酸日益增長(zhǎng)的工業(yè)生產(chǎn)需求,提供一種釀酒酵母 代謝工程改造提高S-腺苷-L-蛋氨酸生產(chǎn)水平的方法。
[0006] 釀酒酵母代謝工程改造提高S-腺苷-L-蛋氨酸生產(chǎn)水平的方法,其特征在于,對(duì)釀 酒酵母菌株腺苷蛋氨酸脫羧途徑進(jìn)行了基因敲除。
[0007] 進(jìn)一步地,所述對(duì)釀酒酵母菌株腺苷蛋氨酸脫羧途徑的敲除是通過(guò)敲除釀酒酵母 菌株染色體上腺苷蛋氨酸脫羧酶基因 SPE2來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
[0008] 進(jìn)一步地,所述釀酒酵母菌株采用釀酒酵母單倍體菌株,在釀酒酵母單倍體菌株 中實(shí)施所述敲除包括以下步驟: 步驟1:設(shè)計(jì)含有SPE2基因同源臂的引物,以質(zhì)粒pUG6為模版進(jìn)行PCR,PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)純 化得到SPE2基因的敲除框; 步驟2:通過(guò)醋酸鋰(LiAC)轉(zhuǎn)化法將步驟1中所得敲除框?qū)脶劸平湍竼伪扼w菌株中, 通過(guò)G418平板篩選,挑取單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證。
[0009] 進(jìn)一步地,所述釀酒酵母菌株采用釀酒酵母雙倍體菌株,在釀酒酵母雙倍體菌株 中實(shí)施所述敲除包括以下步驟: 步驟1:設(shè)計(jì)含有SPE2基因同源臂的引物,以質(zhì)粒pUG6為模版進(jìn)行PCR,PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)純 化得到SPE2基因的敲除框; 步驟2:通過(guò)醋酸鋰(LiAC)轉(zhuǎn)化法將步驟1中所得敲除框?qū)脶劸平湍鸽p倍體菌株中, 通過(guò)G418平板篩選以及PCR驗(yàn)證,得到一條SPE2等位基因被置換的雜合子; 步驟3:將步驟2得到的雜合子置于產(chǎn)孢培養(yǎng)基上培養(yǎng)至孢子大量產(chǎn)生,收集孢子,溶解 孢子子囊壁后,分離孢子; 步驟4:將步驟3得到的分離孢子置于G418平板上培養(yǎng)至菌落生成,挑取單菌落進(jìn)行PCR 驗(yàn)證。
[0010] 進(jìn)一步地,所述步驟中設(shè)計(jì)含有SPE2基因同源臂的引物,該引物序列為: 上游引物 SPE2-up(5'-3'): CATATAGTGTCTTACGCAAATAGGCGGACCATAGAATGACTGTCACCATACAGCTGAAGCTTCGTACGC 下游引物SPE2-down (5 ' -3 '): ACAAGCGGGTTAAACTACATTAGTTATGAGTGCTAGAAAGCAAGCGAAGGGCATAGGCCACTAGTGGATCTG; PCR驗(yàn)證的引物序列為: 上游引物 SPE2-A: 5 ' -CGCTCCTTGCATCAACTCTT-3 ' 下游引物SPE2-D: 5 ' -GCGGCTAAACTCCCTTAGCT-3 '。
[0011] 為實(shí)現(xiàn)上述目的,本發(fā)明還可采用以下技術(shù)方案: 釀酒酵母代謝工程改造提高S-腺苷-L-蛋氨酸生產(chǎn)水平的方法,其特征在于,在同一釀 酒酵母菌株中對(duì)糖原合成途徑和腺苷蛋氨酸脫羧途徑兩個(gè)途徑進(jìn)行敲除。
[0012] 進(jìn)一步地,在同一釀酒酵母菌株中將糖原支鏈酶基因 GLC3和腺苷蛋氨酸脫羧酶基 因 SPE2兩個(gè)基因進(jìn)行敲除。
[0013] 進(jìn)一步地,所述釀酒酵母菌株采用釀酒酵母雙倍體菌株,以在釀酒酵母雙倍體中 先進(jìn)行GLC3敲除然后進(jìn)行SPE2敲除,敲除米用以下步驟: 步驟1:以pUG6為模版PCR模版,構(gòu)建GLC3敲除框,轉(zhuǎn)化至釀酒酵母雙倍體菌株中,經(jīng)過(guò) G418平板篩選出一條GLC3等位基因被替換的雜合子; 步驟2:將步驟1得到的雜合子經(jīng)過(guò)產(chǎn)孢培養(yǎng)基培養(yǎng)大量生成子囊孢子,所得子囊孢子 經(jīng)過(guò)溶壁處理,得到分散孢子;分散孢子置于G418平板篩選,即可得到GLC3被敲除的純合子 單菌落; 步驟3:將步驟2得到的GLC3被敲除的純合子進(jìn)行標(biāo)記回收; 步驟4:在標(biāo)記回收了的GLC3敲除純合子上繼續(xù)進(jìn)行SPE2敲除和標(biāo)記回收,最終得到 GLC3和SPE2兩個(gè)基因都敲除掉的純合子。
[0014] 進(jìn)一步地,上述步驟3中將步驟2得到的進(jìn)行標(biāo)記回收,該步驟具體包含以下步驟: 步驟1:將PSH65質(zhì)粒通過(guò)LiAC/PEG轉(zhuǎn)化到GLC3被敲除的純合子中,用博來(lái)霉素抗性進(jìn) 行篩選; 步驟2:將步驟1所得到的博來(lái)霉素抗性菌株接種到Y(jié)PG中,半乳糖存在條件下誘導(dǎo)菌株 合成Cre重組酶,從而導(dǎo)致染色體上G418抗性基因脫落; 步驟3:將步驟3所得菌液在YPD平板上劃線,待菌落長(zhǎng)出后挑同一單菌落分別轉(zhuǎn)接到 Yro和含有G418 Yro平板的對(duì)應(yīng)位置上,30°C下恒溫培養(yǎng)兩天; 步驟4:將YPD上生長(zhǎng)而G418 YPD上不生長(zhǎng)的菌落挑出來(lái),提基因組,進(jìn)行PCR驗(yàn)證; 上述步驟4中的標(biāo)記回收具體包含以下步驟: 步驟1:將PSH65質(zhì)粒通過(guò)LiAC/PEG轉(zhuǎn)化到GLC3和SPE2被敲除的純合子中,用博來(lái)霉素 抗性進(jìn)行篩選; 步驟2:將步驟1所得到的博來(lái)霉素抗性菌株接種到Y(jié)PG中,半乳糖存在條件下誘導(dǎo)菌株 合成Cre重組酶,從而導(dǎo)致染色體上G418抗性基因脫落; 步驟3:將步驟3所得菌液在YPD平板上劃線,待菌落長(zhǎng)出后挑同一單菌落分別轉(zhuǎn)接到 Yro和含有G418 Yro平板的對(duì)應(yīng)位置上,30°C下恒溫培養(yǎng)兩天; 步驟4:將YPD上生長(zhǎng)而G418 YPD上不生長(zhǎng)的菌落挑出來(lái),提基因組,進(jìn)行PCR驗(yàn)證。
[0015] 本發(fā)明中,先進(jìn)行GLC3敲除然后標(biāo)記回收,再進(jìn)行SPE2敲除和標(biāo)記回收,得到GLC3 和SPE2都敲除的菌株,或者,先敲除SPE2基因后進(jìn)行標(biāo)記回收,再敲除GLC3基因后進(jìn)行標(biāo)記 回收,得到的GLC3和SPE2都敲除的菌株,對(duì)提高釀酒酵母菌株生產(chǎn)腺苷蛋氨酸產(chǎn)量都有效。
[0016] 腺苷蛋氨酸合成的直接底物只有蛋氨酸和三磷酸腺苷ATP,添加外源蛋氨酸能快 速加劇釀酒酵母合成SAM,是最直接最有效率的提高SAM產(chǎn)量的方法。然而,SAM在胞內(nèi)大量 合成的同時(shí),也被大量消耗,只有一部分被轉(zhuǎn)移到液泡中存儲(chǔ)起來(lái)。已有大量研究報(bào)道,過(guò) 量表達(dá)腺苷蛋氨酸合成酶也是提高SAM合成效率的有效手段,可通過(guò)代謝改造降低SAM消耗 的研究報(bào)道卻幾乎沒(méi)有。事實(shí)上,減少胞內(nèi)SAM的損耗,對(duì)提高釀酒酵母胞內(nèi)積累SAM效率也 是十分重要的。
[0017]腺苷蛋氨酸胞內(nèi)降解途徑主要有兩條:一條是去甲基途徑,細(xì)胞依賴此途徑對(duì) DNA、蛋白質(zhì)等分子進(jìn)行甲級(jí)修飾,是無(wú)可取代的必需途徑;另一條是脫羧基途徑,細(xì)胞利用 此途徑合成精胺、亞精胺以及聚胺,這一類胺類物質(zhì)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)代謝有調(diào)節(jié)作用。研究報(bào) 道,敲除了 SAM脫羧途徑的關(guān)鍵酶類,細(xì)胞不能在沒(méi)有外源添加胺類物質(zhì)的培養(yǎng)基上生存, 卻能在此胺類物質(zhì)少量補(bǔ)充的培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)。由此啟發(fā),敲掉SAM脫羧酶