一種蛋氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶生物學活性測定方法及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物樣品檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一類蛋氨酸腺巧轉(zhuǎn)移酶生物學活性 測定方法及測定試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 除了依靠宿主為生的寄生物W外，所有物種的生物體細胞內(nèi)都存在蛋氨酸腺巧轉(zhuǎn) 移酶(MethinineAdenos}dtransferase,MAT，EC2.5.1.6)，又稱S-腺巧甲硫氨酸合成酶（S-adenosylmethioninesynthetase)dMAT序列具有非常高的保守性，在人類和大腸桿菌之間 MAT的基因序列有59%的同源性。在哺乳類，MAT存在由3個基因編碼的立種同工酶，MAT-巧口 MAT-III是由同一個基因（MATla)編碼的催化亞基α1組成，MAT-I為四聚體，MAT-III為二聚 體主要存在于成年肝細胞。ΜΑΤ-ΙΙ是由另外一個MAT基因（MAT2a)編碼的催化亞基α2組成， 存在于其它細胞，胚胎肝臟和肝癌細胞。ΜΑΤ2β基因編碼調(diào)節(jié)亞基β，主要調(diào)節(jié)ΜΑΤ-ΙΙdMT在 體內(nèi)的催化反應(yīng)分為二步：（1)催化蛋氨酸(Met)和Ξ憐酸腺巧(ATP)生成S-腺巧蛋氨酸(俗 稱活化蛋氨酸,S-adenosylmethionine,SAM,AdoMet)和Ξ聚憐酸(PPPi),SAM和PPPi仍然留 在MAT表面上；（2)MAT的憐酸酶活性將把PPPi進一步分解二聚憐酸（PPi)和無機單憐酸 (Pi)〇
[0003] MAT催化心甲硫氨酸或稱蛋氨酸化-Met)和Ξ憐酸腺巧(ATP)生成S-腺巧甲硫氨酸 或稱S-腺巧蛋氨酸，MAT具有Ξ憐酸酶活性，使Ξ憐酸分解成焦憐酸和憐酸。其酶活性依賴 于Mgh和K+，酶促反應(yīng)如下：
[0004]
[000引ATP和SAM是生物體內(nèi)最常見的中間代謝產(chǎn)物。在蛋氨酸循環(huán)中，首先必須活化Met,形成SAM，SAM把甲基提供給生命過程中重要物質(zhì)如DAN，RNA，脂蛋白，激素，神經(jīng)遞質(zhì)等 后變成同型半脫氨酸化CY)，最后通過四氨葉酸提供的甲基，變成蛋氨酸。在肝臟中，蛋氨酸 循環(huán)有個額外的功能，主要是在高蛋氨酸或高蛋白飲食后，用W迅速清除血液中過高的蛋 氨酸，最后通過同型半脫氨酸、半脫氨酸、脫硫酸、谷脫甘膚被轉(zhuǎn)運到其它器官。
[0006]SAM是自然界中僅有的幾個功能極其多樣而重要的含硫的生物活性物質(zhì)，是蛋氨 酸循環(huán)中的關(guān)鍵物質(zhì)，是人類至關(guān)重要的甲基化修飾過程中甲基的唯一供體。在轉(zhuǎn)甲基、轉(zhuǎn) 硫、轉(zhuǎn)氨丙基反應(yīng)中有重要的地位。對于甲基化相關(guān)的細胞功能、多胺合成、調(diào)節(jié)蛋氨酸與 同型半脫氨酸的比例等有直接的影響。在各種生命重要的代謝反應(yīng)和細胞的增殖分化等有 重要意義。依賴于SM的甲基轉(zhuǎn)移酶占人類基因組的基因總數(shù)的1%。研究表明，肝臟中維持 一定濃度的SAM對于肝功能的發(fā)揮起著至關(guān)重要的作用。大約85%的甲基化反應(yīng)和約50% 的蛋氨酸代謝是在肝臟中進行的，不僅提示肝臟在調(diào)節(jié)血液蛋氨酸水平有重要的作用(通 過增強MAT-VIII的活性），而且提示SAM在調(diào)控肝細胞再生，分化W及對各種因素(酒精，化 學物質(zhì)，福射，病原微生物，病毒，寄生蟲等)造成的肝細胞損傷的敏感性的重大意義。因此 能夠精確、敏感、方便地測定MAT在不同情況下的生物活性和產(chǎn)物SAM的含量，對于加深人們 對蛋氨酸循環(huán)的深入了解，在不同組織和器官在不同生理和病理情況下的調(diào)控關(guān)系提供重 要的研究工具。
[0007] 在因肝臟炎癥或氧化應(yīng)激造成的肝損傷中觀察到MAT酶部分失活。MATla基因在肝 硬化和肝癌中完全不表達。在MATVIII缺失的小鼠中SAM水平下降;在甘氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶 (GNMT)缺失的小鼠中，SAM水平上升，運兩種情況下，小鼠出現(xiàn)肝癌的幾率明顯增加。
[0008] 很多研究表明MAT與其催化合成的SAM在人體生命活動的不同階段，如胚胎發(fā)生、 發(fā)育、成長、分化、健康、疾病中起著至關(guān)重要的作用，就是因為SAM在蛋氨酸循環(huán)和一碳代 謝中有非常重要的特殊作用，與人體新陳代謝狀況直接相關(guān)。體內(nèi)的SAM含量會因為年齡、 性別、種族、體重、飲食、用藥情況、健康和疾病狀況而有所波動。鑒于運一特性，我們應(yīng)該從 SAM的合成和分解代謝兩個方面來考察原因。因此，了解MAT在不同情況下生物活性的高低 對于我們研究許多至關(guān)重要的代謝與健康問題有很大的實際意義。
[0009] MAT酶活性中屯、有兩種構(gòu)型，第一種構(gòu)型利于SAM合成，第二種構(gòu)型具有Ξ憐酸水 解活性。第二種構(gòu)型的酶反應(yīng)明顯慢于第一種構(gòu)型的。第一種構(gòu)型到第二種構(gòu)型的轉(zhuǎn)換需 要一定的時間。兩種構(gòu)型的差別在于對Ξ憐酸酶和琉基亞硝基化的敏感性。
[0010] 目前有兩種辦法測定MAT活性:方法一:MAT在飽和底物蛋氨酸，Ξ憐酸腺巧和PPPi 存在條件下，最終生成Pi的。用孔雀綠和鋼酸錠直接染色法測定無機憐Pi的含量;方法二： 高壓液相化PLC)或質(zhì)譜化C-MS/MS)方法測定MAT催化合成的產(chǎn)物SAM的量。
[0011] 其中：方法一存在較大的局限性：（1)反應(yīng)體系中PPPi，PP巧日Pi，共存，孔雀綠和鋼 酸錠與PPPi和PPi也有一定的結(jié)合，測出的Pi值不準確；（2)靈敏度不高；（3)MT的Ξ憐酸酶 活性需要經(jīng)過構(gòu)型轉(zhuǎn)變才能發(fā)生，因此測定Ξ憐酸酶的反應(yīng)產(chǎn)物Pi有滯后效應(yīng)，遲滯生成 的Pi系間接法，因此變異性高；（4)MAT的Ξ憐酸酶活性受Met影響較大，使得該方法穩(wěn)定性 受到影響；（5)完全依靠MAT的Ξ憐酸酶活性來推測MAT的SAM合成能力(或活性)本身就有局 限性，因為很有可能MAT的運兩種酶活性不成比例，并極有可能不同的MAT酶活性（指SAM合 成能力和PPPi的水解能力)在不同因素作用下表現(xiàn)出不同程度的影響，因而很難用MAT的憐 酸酶水解活性準確地反映MAT的SAM合成活性。
[0012] Fern自ndez-Irigoyen報道不同變異株的MAT-巧日ΜΑΤ-ΙΠ酶活性跟野生型MAT-巧口 MAT-III相比，其Ξ憐酸水解酶活性和SAM合成活性所受的影響各不一致，一些變異株Ξ憐 酸酶活性不變，而SAM合成活性有非常明顯的降低;一些變異株SAM合成能力增強而Ξ憐酸 水解酶活性降低;還有一些是兩種酶活性不同程度地都降低，總之，各種可能性都會存在。
[0013] SanxhezdelPino等發(fā)現(xiàn)MAT-III在121位半脫氨酸殘基引入NO基團（亞硝基化）， 使得MAT的SAM和成活性明顯降低，而對Ξ憐酸酶活性沒有抑制。因此，用測定Pi的方法衡量 MAT活性只能反映SAM合成酶活性W及Ξ憐酸酶活性的總體結(jié)果，不能很好地反應(yīng)MAT的SAM 合成能力，結(jié)果很不準確，因而有很大的局限性。
[0014] 那么，F(xiàn)ern自ndez-Irigoyen的報道SAM合成活性是使用上述的方法二，即高壓液相 化PLC)方法測定SAM的生成量。其實無論是HPLC或LC-MS/MS哪種方法測定SAM含量，對于評 估MAT活性都是很不準確的。我們知道SAM合成后一段時間都是結(jié)合在MAT上的，而HPLC和 LC-MS/MS方法（1)只能測定游離狀態(tài)的SAM分子；（2)HPLC和LC-MS/MS的樣品，需要特殊處 理，經(jīng)過較長時間、較多步驟后SAM的含量必然有丟失；（3)不能及時測定SAM的量(SAM分子 自身很不穩(wěn)定，需要及時測定SAM)，所有運些因素都會造成所測的SAM值很不準確，更不用 說試圖達到反映酶動力學反應(yīng)的目的。
[0015] 因此，研發(fā)出一種能準確、快速、直接測定蛋氨酸腺巧轉(zhuǎn)移酶生物學活性的檢測方 法是非常必要的。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0016] 本發(fā)明的目的在于提供一種能準確、快速、直接測定蛋氨酸腺巧轉(zhuǎn)移酶生物學活 性的方法W及利用該方法得到的試劑盒。本發(fā)明中設(shè)及的一步法或同時法直接測定其合成 的SM產(chǎn)物含量，是MAT活性測定領(lǐng)域的創(chuàng)新。MAT是SAM合成的唯一的酶，無論體內(nèi)還是體外 方法測定MAT酶活性，本發(fā)明都可W最直接地第一時間地快速地測定SAM的含量，W推算MAT 活性的高低，可W同時測定樣品中SAM含量和MAT活性。本發(fā)明把MAT催化的生化反應(yīng)與測定 SAM的免疫反應(yīng)同時進行，把運兩個過程有機地結(jié)合起來，對于準確地測定分子性狀及其不 穩(wěn)定的SAM尤其具有重大的意義。本發(fā)明的創(chuàng)新之處是利用抗S-腺巧蛋氨酸特異性抗體測 定蛋氨酸腺巧轉(zhuǎn)移酶生物學活性。該蛋氨酸腺巧轉(zhuǎn)移酶生物學活性測定方法，有W下部分 組成：（1)在保證蛋氨酸腺巧轉(zhuǎn)移酶有生物學活性的緩沖體系中，含有酶的樣品和底物進行 反應(yīng)W便產(chǎn)生一定量的S-腺巧蛋氨酸產(chǎn)物；（2)利用免疫學方法檢測S-腺巧蛋氨酸的含量， 來決定反應(yīng)體系中蛋氨酸腺巧轉(zhuǎn)移酶是否有活性，W及活性高低。其中：底物含有蛋氨酸， Ξ憐酸腺巧，儀離子和鐘離子等適當酸堿性的緩沖體系;樣品可W來源于基因工程表達的 產(chǎn)物、生物組織細胞內(nèi)被純化出的樣品、組織細胞內(nèi)的蛋氨酸腺巧轉(zhuǎn)移酶，生物體液或組織 細胞培養(yǎng)液，生物體液如血液，血漿，血清，唾液，尿液，腦脊液，腹腔或胸腔滲出液，組織液； 免疫檢測方法包含抗S-腺巧蛋氨酸特異性抗體，包括多種示蹤物偶聯(lián)的該抗體，S-腺巧蛋 氨酸或其類似物，和偶聯(lián)的S-腺巧蛋氨酸或其類似物;蛋氨酸腺巧轉(zhuǎn)移酶的催化反應(yīng)和所 生成的產(chǎn)物S-腺巧蛋氨酸與包被的S-腺巧蛋氨酸抗原或示蹤物標記的S-腺巧蛋氨酸抗原， 競爭結(jié)合示蹤物標記的抗S-腺巧蛋氨酸抗體或包被的抗S-腺巧蛋氨酸抗體的免疫反應(yīng)是 基于可W同時進行的一步法原理。
[0017] 為解決現(xiàn)有技術(shù)(用孔雀綠和鋼酸錠直接染色法測定無機憐Pi的含量;HPLC或LC-MS/MS)方法測定MAT催化合成的產(chǎn)物SAM的量)存在的問題，本發(fā)明提供了測定樣品中蛋氨 酸腺巧轉(zhuǎn)移酶生物學活性的方法，方案之一包括如下步驟：
[0018] (1)不同濃度標準品的配制:取試劑盒中的S-腺巧蛋氨酸標準品，用緩沖液配制成 不同濃度的標準曲線樣品；
[0019] (2)在包被有蛋白（或多聚體)-SAM抗原偶聯(lián)物或的蛋白（或多聚體)-SAM類似物抗 原偶聯(lián)物的微孔板中，標準曲線孔中加入配制好的不同濃度梯度的標準品，在待檢測樣品 孔中加入待檢測樣品；
[0020] (3)加入辣根過氧化物酶或堿性憐酸酶標記的抗S-腺巧蛋氨酸單克隆抗體，蛋氨 酸、Ξ憐酸腺巧、W及待測蛋氨酸腺巧轉(zhuǎn)移酶的樣品，混勻后37°C反應(yīng)60分鐘，反應(yīng)結(jié)束后 洗板；
[0021 ] (4)加入辣根過氧化物酶或堿性憐酸酶的底物，37°C顯色15min，加入終止液終止 反應(yīng)，在酶標儀上選擇450nm波長讀取每孔的吸光度讀數(shù)0D450;
[0022] (5)在同一酶聯(lián)板中用配制的一系列梯度已知量的SAM作為標準品，作為標準曲 線，據(jù)其0D450與已知標準品濃度獲得曲線方程，再將樣本0D450代入方程求得其對應(yīng)的反 應(yīng)產(chǎn)物SAM的生成量；
[0023] (6)根據(jù)一定質(zhì)量的含有MAT的樣品在單位時間內(nèi)催化生成產(chǎn)物SAM的濃度來計算 MAT酶活性。
[0024] 所述步驟(2)中的待檢測樣品可W來源于基因工程表達的樣品、生物組織細胞內(nèi) 被純化出的樣品、生物體液或組織培養(yǎng)液。
[002引所述步驟（3)中37°C反應(yīng)的時間為20min、30min、40min、50min、60min、70min、 80min、90min。
[0026] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于：
[0027] 1、可W直接測定產(chǎn)物SAM的含量而不是Pi,能直接反映了MAT的合成SAM的能力，不 受MAT構(gòu)型轉(zhuǎn)變的影響；
[0028] 2、本發(fā)明中SAM生成和測定在同一個體系內(nèi)一步完成，不存在滯后，結(jié)果準確及 時；
[0029] 3、用免疫學方法測定SAM，不僅特異