鑒別鴨坦布蘇病毒感染動物和滅活苗免疫動物的elisa檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及檢測試劑盒領(lǐng)域，特別設(shè)及一種鑒別鴨坦布蘇病毒感染動物和滅活苗 免疫動物的化ISA檢測試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 自2010年4月份W來，我國浙江、福建、廣東、廣西、江蘇、江西、安徽、河南、河北、 山東和北京等地相繼暴發(fā)一種新鴨病，中東部地區(qū)的大部分鴨場均出現(xiàn)。該病主要導(dǎo)致產(chǎn) 蛋嚴重下降，且傳播迅速、設(shè)及范圍廣，發(fā)病前期為持續(xù)高熱，發(fā)病后期出現(xiàn)一定比例的神 經(jīng)癥狀，表現(xiàn)為擁痕、翻滾、站立不穩(wěn)及共濟失調(diào)。該病病程約為1-2個月，耐過種鴨群可逐 漸恢復(fù)產(chǎn)蛋，淘汰率一般為10%-30%，給全國養(yǎng)鴨業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。
[0003] 經(jīng)過各地專家學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，從發(fā)病鴨體組織分離出一種新型黃病毒，根據(jù)地域 命名原則命名為BYD(Bai化ngDian)病毒。2011年中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會第一屆水禽疫病防控 研討會上，將該病統(tǒng)一命名為"鴨坦布蘇病毒"，是一種新型鴨黃病毒。
[0004] 自然條件下，該病毒可感染除番鴨外的所有品種產(chǎn)蛋鴨（如紹興鴨、山麻鴨、纏云 麻鴨、金定鴨等）、肉種鴨（如樓桃谷鴨和北京鴨)及野鴨等。從單場來看，一旦染病，全場產(chǎn) 蛋期種鴨幾無幸免，且發(fā)病時間迅速，多在3~7d內(nèi)波及全群。病毒核酸為不分節(jié)段的感染 性的單股正鏈RNA，全長約10990核巧酸，包含單個開放閱讀框(0RF)、5'非編碼區(qū)(UTR)和3' 非編碼區(qū)（UTR)。基因組結(jié)構(gòu)順序依次是 5'-UTR-Cv-Ci-PrM-M-E-NSl-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-UTR-3'。
[000引E蛋白是主要抗原蛋白，具有良好的免疫原性，具有血凝活性，可激發(fā)機體產(chǎn)生中 和抗體和免疫應(yīng)答，對抵抗病毒感染和增殖具有重要意義。是未來疫苗研究和診斷抗原的 首選。NS1蛋白是病毒感染過程的主要免疫原，高度保守，是唯一能夠在感染細胞中產(chǎn)生的 非結(jié)構(gòu)蛋白，能夠誘導(dǎo)細胞免疫和體液免疫，可用于出現(xiàn)臨床癥狀之前病毒感染早期的血 清學(xué)診斷。
[0006] 該病近年來在我國大部分省、市、自治區(qū)均有流行，給養(yǎng)禽業(yè)造成很大的經(jīng)濟損 失。國內(nèi)外用于坦布蘇病毒病血清學(xué)檢測方法主要有中和試驗和ELISA，中和試驗由于操作 繁瑣、時間冗長，給及時的診斷和預(yù)防檢測帶來不便。而化ISA方法具有特異性強、敏感性 高、操作簡便、快速準確等優(yōu)點，更適合短時間內(nèi)檢測大批量的血清樣品，適用范圍更廣?，F(xiàn) 有間接化ISA檢測方法，有的W全病毒作為抗原包被酶標板，此方法具有潛在散毒的危險， 同時成本高;有的僅WE蛋白作為抗原包被酶標板，運種方法不能區(qū)別動物是野毒感染還是 滅活疫苗免疫帶毒，同時也不利于及時了解鴨群感染情況，無法對野毒感染早期的動物進 行診斷防控。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為了彌補現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種可W區(qū)分野毒感染還是滅活疫苗免 疫帶毒，同時可w對動物進行早期診斷防控的鑒別鴨坦布蘇病毒感染動物和滅活苗免疫動 物的化ISA檢測試劑盒。
[0008] 本發(fā)明的技術(shù)方案為： 一種鑒別鴨坦布蘇病毒感染動物和滅活苗免疫動物的化ISA檢測試劑盒，包括:鴨坦布 蘇病毒E重組蛋白包被酶標板、NS1重組蛋白包被酶標板、標準陽性對照血清、標準陰性對照 血清、兔抗鴨酶標二抗、樣品稀釋液、濃縮洗液、TMB底物顯色液和終止液。
[0009] 作為優(yōu)選，所述鴨坦布蘇病毒E重組蛋白包被酶標板通過用在原核表達系統(tǒng)中重 組表達的鴨坦布蘇病毒E蛋白包被化ISA板制得;所述NS1重組蛋白包被酶標板通過用在原 核表達系統(tǒng)中重組表達的鴨坦布蘇病毒NS1蛋白包被化ISA板制得。
[0010] 作為優(yōu)選，所述標準陽性對照血清為鴨坦布蘇病毒滅活疫苗免疫若干次SPF鴨后 分離得到的鴨血清。
[0011] 進一步地，所述標準陰性對照血清為未感染鴨坦布蘇病毒的鴨血清。
[0012] 作為優(yōu)選，所述兔抗鴨酶標二抗為HRP標記的兔抗鴨二抗。
[0013] 所述鑒別鴨坦布蘇病毒感染動物和滅活苗免疫動物的化ISA檢測試劑盒的檢測方 法，包括步驟： 1) 將待測鴨血清樣品、標準陽性對照血清和標準陰性對照血清分別加入所述鴨坦布蘇 病毒E重組蛋白包被酶標板和NS1重組蛋白包被酶標板的獨立孔中，37°C反應(yīng)1-化后，4°C過 夜； 2) 將每孔洗涂后，分別加入所述兔抗鴨酶標二抗，37°C反應(yīng)0.5-化； 3) 將每孔洗涂后，分別加入TMB底物顯色液進行顯色反應(yīng)； 4) 加入終止液，終止顯色反應(yīng)，在酶標儀上讀數(shù)； 5) 判斷:E-ELISA待測樣品0D值大于等于0.348時，待測樣品為陽性，否則為陰性;NS1-ELISA待測樣品0D值大于等于0.416時，待測樣品為陽性，否則為陰性;若E-ELISA檢測陽性 而NS1-化ISA檢測陰性，明待測血清樣品為滅活疫苗免疫動物血清;若E-ELISA檢測陰性而 NS1-ELISA檢測陽性，待測血清樣品為臨床癥狀出現(xiàn)前的早期感染動物血清;若E-化ISA和 NS1-ELISA檢測均陽性，待測血清樣品為野毒自然感染動物血清;若E-ELISA和NS1-化ISA檢 測均陰性，待測血清樣品沒有感染坦布蘇病毒。
[0014] 本發(fā)明制備的E-化ISA檢測試劑盒用于鴨坦布蘇病毒感染后的抗體檢測，檢測的 樣品為鴨血清。NS1-ELISA檢測試劑盒用于出現(xiàn)臨床癥狀前的早期感染的血清抗體檢測，同 時使用E-化ISA和NS1-化ISA檢測試劑盒用于野毒感染動物和滅活疫苗免疫動物的區(qū)別檢 測。
[0015] 將自行分離的鴨坦布蘇病毒La株，感染Vero(非洲綠猴腎，病毒培養(yǎng)常用細胞)細 胞，待病變后收獲細胞毒保存?zhèn)溆?。從細胞毒提取病毒核酸RNA，反轉(zhuǎn)錄后獲得cDNA，利用特 異性引物（引物序列見表1)擴增分別得到E基因片段和NS1基因片段，經(jīng)過雙酶切方法，將其 分別克隆至相應(yīng)的原核表達載體中，在原核宿主細胞中進行表達并純化，得到重組E蛋白和 重組NS1蛋白。經(jīng)過定量后可作為抗原包被化ISA板。
[0016] 為便于純化，經(jīng)原核表達的重組E蛋白和重組NS1蛋白的N末端均帶有化S標簽，可 用儀柱進行純化。 利用鴨坦布蘇病毒重組E蛋白和重組NS1蛋白包被化ISA板可W按照本領(lǐng)域的常規(guī)方法 進行。
[0017]重組E蛋白包被的化ISA板可w按照w下過程操作得到： 用包被液(pH9.6)將已純化的重組E蛋白稀釋為1.2yg/mL，將混合液加入到96孔酶 標板中，100μL孔，37°C2h后置于4°C過夜;傾盡96孔板中液體，利用PBST(pH7.4)洗涂， 250μL孔，每次5m，洗3次;傾盡96孔板中的液體，加入封閉液，250μL孔，置于4°C封閉 過夜;傾盡96孔板中的液體，加入PBST(pH7.4)，250μL孔，洗3次，每次5m。傾盡96孔板 中的液體，將板置于37°C，干燥化，放入有干燥劑塑料袋中，-20°保存?zhèn)溆谩?br>[0018] 重組NS1蛋白包被的化ISA板可W按照W下過程操作得到： 用包被液(pH9.6)將已純化的重組NS1蛋白稀釋為35yg/mL，將混合液加入到96孔 酶標板中，100μL孔，37°C2h后置于4°C過夜;傾盡96孔板中液體，利用PBST(pH7.4)洗 涂，250μL孔，每次5m，洗3次;傾盡96孔板中的液體，加入封閉液，250μL孔，置于4°C 封閉過夜;傾盡96孔板中的液體，加入PBST(pH7.4)，250μL孔，洗3次，每次5m。傾盡96 孔板中的液體，將板置于37°C，干燥化，放入有干燥劑塑料袋中，-20°保存?zhèn)溆谩?br>[0019] 標準陰性對照血清為未感染坦布蘇病毒的鴨血清，標準陽性對照血清為鴨坦布蘇 病毒滅活疫苗免疫5次SPF鴨后分離得到的鴨血清。
[0020] 兔抗鴨酶標二抗可W商購得到，例如，可從EadhOX公司購買HRP標記的兔抗鴨二 抗。
[0021 ]所述試劑盒中的樣品稀釋液，20X濃縮洗液，TMB底物顯色液，終止液。其成分及 配制方法如下： 1)樣品