一種鴨瘟組織滅活苗、制備方法及應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種鴨瘟組織滅活苗、制備方法及其應用，其制備方法包括采集樣品，通過繼代感染保存毒株，配制PBS緩沖液，加入甲醛溶液處理。本發(fā)明方法制備的鴨瘟組織滅活苗具有制備方法簡單，使用操作方便，免疫效率高，保存時間長等特點，適用于規(guī)?；可a(chǎn)和應用。
【專利說明】—種鴨瘟組織滅活苗、制備方法及應用

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及動物組織滅活苗的制備方法，特別是鴨瘟組織滅活苗的制備方法。

【背景技術】
[0002]鴨瘟(Duck Plague)是由一種皰疹病毒引起的鴨急性、熱性、敗血性傳染病，感染各種不同年齡的游禽(如鵝、鴨、天鵝等)。具有流行廣泛，傳播迅速，發(fā)病率和死亡率高等特點。鴨子感染鴨瘟后表現(xiàn)的病理癥狀有:出血管損傷導至組織出血，體腔溢血，消化道粘膜壞死性病變，淋巴器管受損以及實質器管的退行性變化等。組織滅活苗和疫苗是鴨飼養(yǎng)行業(yè)中常用的生物制劑。目前，使用鴨瘟凍干疫苗來避免大規(guī)模鴨瘟的流行，具有免疫效果不理想，接種后保護率低等問題，因此提供一種高效的鴨瘟組織滅活苗的制備方法具有重要意義。


【發(fā)明內容】

[0003]本發(fā)明所要解決的技術問題是:鑒于目前所使用的凍干疫苗具有免疫效果不理想的問題，提供一種高效的鴨瘟組織滅活苗的制備方法，從而為發(fā)展鴨用組織滅活苗開辟新的有效途徑。
[0004]本發(fā)明解決上述技術問題的技術方案如下:一種鴨瘟組織滅活苗的制備方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0005]I)樣品采集:
[0006]將患有鴨瘟的鴨子消毒處理，采集病變組織(心臟、肝臟、肺部、腎臟等組織器官)，置于滅菌缸；將所述病變組織，分成兩份，一份用于直接制備鴨瘟組織滅活苗，一份冷凍保存；
[0007]2)通過繼代感染保存毒株:
[0008]將步驟I)所述冷凍保存的病變組織取出解凍后，將其制備成組織過濾漿液，所述組織過濾漿液接種至健康的鴨子使其感染鴨瘟，采集病變組織(心臟、肝臟、肺部、腎臟等組織器官)，冷凍保存；
[0009]3)稱取步驟I)所述用于直接制備鴨瘟組織滅活苗的病變組織或步驟2)所述冷凍保存的病變組織，搗爛，收集組織漿液；
[0010]4)配制PBS緩沖液，包括以下步驟:
[0011]稱取170g分析純氯化鈉置于燒杯中，加入適量去離子水或蒸餾水溶解，加入13.6g分析純磷酸二氫鉀,3.0g分析純氫氧化鈉,不斷攪拌直至全部溶解,轉移至100ml的容量瓶中，定容至1000ml，將定容后的溶液分裝到高溫瓶(插上針頭)中用高壓滅菌鍋進行高壓菌處理，所述高溫滅菌條件為0.15mpa保溫30min，待溶液冷卻后，置于5°C保存，使用時將所述溶液稀釋20倍，即為PBS緩沖液；所述PBS緩沖液含有8.5g/L氯化鈉、0.68g/L磷酸二氫鉀、0.15g/L氫氧化鈉；
[0012]5)向步驟3)所述組織漿液中加入步驟4)配制的900ml PBS緩沖液，混合均勻，30001-/111111,離心 2111111，收集上清液；
[0013]6)向步驟5)所述上清液中加入1001質量分數(shù)36%的甲醛溶液，加入？83緩沖液，使終體積為100001，得到混合均勻的溶液；甲醛占所述混合均勻的溶液的質量的1% ；
[0014]7)將所述制備好的溶液分裝，貼標簽，51保存。
[0015]本發(fā)明所述的冷凍溫度為01至-51。
[0016]本發(fā)明的有益效果是:制備方法簡單，短時間內可制備完；使用操作方便，使用時取出組織滅活苗注射即可；適于規(guī)?；可a(chǎn)和應用；免疫效率高，接種后保護率可至100%；保質期長(可達12個月)；組織滅活苗的病毒株可以通過本發(fā)明的制備方法長期保存，循環(huán)利用。

【具體實施方式】
[0017]以下對本發(fā)明的原理和特征進行描述，所舉實例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。
[0018]本發(fā)明提供的一種高效的鴨瘟組織滅活苗的制備方法，包括以下步驟:
[0019]1)樣品采集:
[0020]將患有鴨瘟的鴨子消毒處理，采集病變組織(心臟、肝臟、肺部、腎臟等組織器官)，置于滅菌缸；將所述病變組織，分成兩份，一份用于直接制備鴨瘟組織滅活苗，一份冷凍保存；
[0021]2)通過繼代感染保存毒株:
[0022]將步驟1)所述冷凍保存的病變組織取出解凍后，將其制備成組織過濾漿液，所述組織過濾漿液接種至健康的鴨子使其感染鴨瘟，采集病變組織(心臟、肝臟、肺部、腎臟等組織器官)，冷凍保存；
[0023]3)稱取步驟1)所述用于直接制備鴨瘟組織滅活苗的病變組織或步驟2)所述冷凍保存的病變組織，搗爛，收集組織漿液；
[0024]4)配制？83緩沖液，包括以下步驟:
[0025]稱取1708分析純氯化鈉置于燒杯中，加入適量去離子水或蒸餾水溶解，加入
13.68分析純磷酸二氫鉀，3.08分析純氫氧化鈉，不斷攪拌直至全部溶解，轉移到10001111的容量瓶，定容至10001111，將定容后的溶液分裝到高溫瓶(插上針頭)中用高壓滅菌鍋進行高壓菌處理，所述高溫滅菌條件為0.15,21保溫30111111，待溶液冷卻后，置于51保存，使用時將所述溶液稀釋20倍，即為？83緩沖液；所述？83緩沖液含有8.5^/1氯化鈉、0.68^/1磷酸二氫鉀、0.158/1氫氧化鈉；
[0026]5)向步驟3)所述組織漿液中加入步驟4)配制的90001 ？88緩沖液，混合均勻，30001-/111111,離心 2111111，收集上清液；
[0027]6)向步驟5)所述上清液中加入1001質量分數(shù)36%的甲醛溶液，加入？83緩沖液，使終體積為100001，得到混合均勻的溶液；甲醛質量占所述混合均勻的溶液的質量的1% ；
[0028]7)將所述制備好的溶液分裝，貼標簽，51保存。
[0029]本發(fā)明所涉及的高效制備鴨瘟組織滅活苗的方法獲得的鴨瘟組織滅活苗不僅限用于鴨子對鴨瘟病毒的免疫，也適用于其他禽類(如鵝、天鵝等)對鴨瘟病毒的免疫。
[0030]下面結合實施例對上述制備方法進一步說明。
[0031]實施例
[0032]貴州省凱里市某養(yǎng)鴨場于2010年5月至7月養(yǎng)騾鴨1000羽，15日齡時接種鴨瘟凍干疫苗，25日齡時爆發(fā)鴨瘟，5天內共死亡896羽，死亡率90%。
[0033]發(fā)明人收集上述因患有鴨瘟已死亡的鴨子，利用常規(guī)的方法進行消毒處理，采集病變嚴重的肝臟和肺部，置于滅菌缸；一部分病變組織用于直接制備鴨瘟組織滅活苗，一部分病變組織置于冰箱中冷凍保存，用于保存毒株。
[0034]稱取200g病變組織，用搗漿機將其搗爛，收集組織漿液置于200ml的燒杯中。
[0035]采取以下步驟配制PBS緩沖液:
[0036]稱取170g分析純氯化鈉置于燒杯中，加入適量去離子水或蒸餾水溶解，加入13.6g分析純磷酸二氫鉀,3.0g分析純氫氧化鈉,不斷攪拌直至全部溶解,轉移到100ml的容量瓶，定容至1000ml，將定容后的溶液分裝到高溫瓶(插上針頭)中用高壓滅菌鍋進行高壓菌處理，使用的高溫滅菌條件為0.15mpa保溫30min，待溶液冷卻后，置于5°C保存，使用時將所述溶液用水稀釋20倍，即為PBS緩沖液。
[0037]向收集的組織漿液中加入配制的PBS緩沖液900ml，充分混合均勻后置于沉降式實驗離心機離心管內，將離心管對稱放入離心機的套管中，把離心機的轉速調至3000r/min，離心2min，收集上清液置于100ml的容量瓶中，加入1ml質量分數(shù)36%的甲醛溶液，加入PBS緩沖液，使終體積為1000ml，混合均勻，溶液中甲醛的質量分數(shù)為1%。將制備好的溶液分裝，貼標簽，5°C保存，可以保存12個月。每年每批鴨在20-25日齡時用本發(fā)明制備的鴨瘟組織滅活苗進行免疫接種。組織苗在使用時按照每1000只份的劑量加入80萬單位青霉素和100萬單位鏈霉素的比例使用，混勻溶解后,每羽肌肉注射0.5ml。
[0038]由于鴨瘟組織滅活苗超過保存期后免疫效率降低，所以需要通過繼代感染將毒株保存。具體方法是將采集到的病變組織，除了用于制取組織滅活苗外，剩于的部分用滅菌袋裝好貼上標簽放入冰箱冷凍層于0°c以下的條件下保存(保存時間不超過12個月)。在保存期內可隨時將病變組織取出，將其制成組織過濾漿液裝入滅菌瓶中，選擇至少I只健康的鴨子，將其嚴格隔離后肌肉注射組織過濾液0.1ml，待其發(fā)病死亡后再取出病變的肺部和肝臟按上述方法保存于冰箱冷凍層中，如此循環(huán)往復即可把該病毒株保存下來。因此，可以獲得高效的鴨瘟組織滅活苗。
[0039]發(fā)明人通過上述方法，采集死鴨病變嚴重的肝臟和肺部經(jīng)過搗爛、稀釋、離心，力口入終濃度1% (質量分數(shù))的甲醛溶液處理后制成組織滅活苗，接種于上述爆發(fā)鴨瘟后剩余的鴨子，同時對圈舍進行徹底的清洗和消毒，使剩余的100只鴨子免于鴨瘟病毒的感染，在接下來飼養(yǎng)的幾批騾鴨中，發(fā)明人使用本發(fā)明的高效鴨瘟組織滅活苗制備方法制備的鴨瘟組織滅活苗，對全部騾鴨進行接種預防，并沒有發(fā)生過鴨瘟。從2010年至2014年，該養(yǎng)殖場每年每批騾鴨全部用本發(fā)明所述的鴨瘟組織滅活苗制備的組織滅活苗進行接種，并未發(fā)生過鴨瘟，保護率達100%。
[0040]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。
【權利要求】
1.一種鴨瘟組織滅活苗的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)米集樣品: 將患有鴨瘟的鴨子消毒處理，采集病變組織置于滅菌缸；將所述病變組織，分成兩份，一份用于直接制備鴨瘟組織滅活苗，一份冷凍保存； 2)通過繼代感染保存毒株: 將步驟1)所述冷凍保存的病變組織取出解凍后，將其制備成組織過濾漿液，所述組織過濾漿液接種至健康的鴨子使其感染鴨瘟，采集感染鴨瘟鴨子的病變組織，冷凍保存； 3)稱取步驟1)所述用于直接制備鴨瘟組織滅活苗的病變組織或步驟2)所述冷凍保存的病變組織，搗爛，收集組織漿液； 4)配制PBS緩沖液； 5)向步驟3)所述組織漿液中加入步驟4)配制的PBS緩沖液，混合均勻，離心，收集上清液； 6)向步驟5)所述上清液中加入甲醛溶液和PBS緩沖液，混合均勻； 7)將所述制備好的溶液分裝，貼標簽，冷藏保存。
2.根據(jù)權利要求1所述一種鴨瘟組織滅活苗的制備方法，其特征在于，步驟1)中，所述病變組織選自感染鴨瘟的鴨子的心臟、肝臟、肺部、腎臟中的一種或幾種。
3.根據(jù)權利要求1所述一種鴨瘟組織滅活苗的制備方法，其特征在于，步驟4)中，所述配制PBS緩沖液，包括以下步驟:稱取170g分析純氯化鈉置于燒杯中，加入去離子水或蒸餾水溶解，加入13.6g分析純磷酸二氫鉀，3.0g分析純氫氧化鈉，不斷攪拌直至全部溶解，轉移至1000ml的容量瓶中，定容至1000m 1，將所述定容后的溶液分裝到高溫瓶中用高壓滅菌鍋進行高壓菌處理，所述高溫滅菌條件為0.15mpa保溫30min，待溶液冷卻后，置于5°C保存，使用時將所述溶液稀釋20倍，即為PBS緩沖液。
4.根據(jù)權利要求3所述PBS緩沖液，其特征在于，所述PBS緩沖液含有8.5g/L氯化鈉、0.68g/L磷酸二氫鉀和0.15g/L氫氧化鈉。
5.根據(jù)權利要求1所述一種鴨瘟組織滅活苗的制備方法，其特征在于，步驟5)中，所述離心的條件為3000r/min,離心2min。
6.根據(jù)權利要求1所述一種鴨瘟組織滅活苗的制備方法，其特征在于，步驟6)中，所述混合均勻的溶液含有質量分數(shù)1%的甲醛。
7.根據(jù)權利要求1所述一種鴨瘟組織滅活苗的制備方法，其特征在于，步驟7)中，所述冷藏保存為在5°C條件下保存。
8.—種如權利要求1至7任一項所述的制備方法制備出的鴨瘟組織滅活苗。
9.一種如權利要求8所述鴨瘟組織滅活苗在鴨飼養(yǎng)行業(yè)中的應用。
【文檔編號】A61K39/255GK104306966SQ201410543011
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年10月14日 優(yōu)先權日:2014年10月14日
【發(fā)明者】龍明珠, 楊茂生 申請人:龍明珠