病毒誘導(dǎo)的石竹八氫番茄紅素脫氫酶基因高效沉默體系的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及花弁生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種病毒誘導(dǎo)的石竹八氨番茄紅素脫氨 酶基因高效沉默體系。
【背景技術(shù)】
[0002] 石竹為石竹科石竹屬植物，原產(chǎn)于，由于其具有耐寒、抗旱、抗鹽堿、花色眾多等優(yōu) 點(diǎn)，因此在花壇、地被等園林上廣泛應(yīng)用。研究石竹抗逆機(jī)理，獲得抗逆基因，進(jìn)而對(duì)同屬植 物進(jìn)行遺傳改良，可W增加北方園林用植物種類(lèi)，達(dá)到節(jié)約型綠化的目的。但目前缺乏對(duì) 控制運(yùn)些性狀基因功能進(jìn)行快速、有效驗(yàn)證的體系。VIGS(virus-in化cedgenesilence, VIG巧技術(shù)已應(yīng)用于多種植物進(jìn)行基因功能驗(yàn)證，但由于石竹抗逆性強(qiáng)，該體系目前在石竹 上尚無(wú)應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種病毒誘導(dǎo)的石竹八氨番茄紅素脫氨酶基因高 效沉默體系，可W獲得病毒誘導(dǎo)的基因沉默性狀，進(jìn)而解決有效驗(yàn)證石竹基因功能的問(wèn)題。
[0004] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：
[0005] 病毒誘導(dǎo)的石竹八氨番茄紅素脫氨酶基因高效沉默體系，包括如下步驟：
[0006] S1、采用八氨番茄紅素脫氨酶（PDS)的編碼基因序列設(shè)計(jì)特異引物，引物分別為
[0007] 4F：GATGAGGATGGGGACTGGTA
[0008] 4R：ATTTAGCGCCTTTGACATGG
[0009] S2、從石竹中克隆PDS基因，通過(guò)RT-PCR在石竹中擴(kuò)增出SOObp大小的PDS基因 片段，并將片段連接到pGEMT-easy載體上；
[0010] S3、將連接到載體PGEMT-easy上的PDS片段用酶切后連接到采用同樣酶切后的 TRV2載體上；
[0011] S4、將步驟S3所得的PTRV2-PDS5000轉(zhuǎn)入GV3101農(nóng)桿菌中，進(jìn)行陽(yáng)性克隆的PCR 鑒定；
[001引 S5、室溫下將含有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌在滲透緩沖液（MES+MgC12+Aceto)中活化4h 后，采用濃度為IOOum的乙酷下香酬對(duì)4葉期的石竹幼苗室溫下進(jìn)行高壓侵染，待葉片出現(xiàn) 水潰狀時(shí)，表明侵染完成；
[0013] S6、將侵染后的石竹幼苗先放在15°C下預(yù)培養(yǎng)2d后，10°C下繼續(xù)預(yù)培養(yǎng)5d;
[0014] S7、然后步驟S6處理后的石竹幼苗放在20°C，光照為4000LUX的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培 養(yǎng)，15-20d后，出現(xiàn)葉片漂白現(xiàn)象。
[001引其中，所述步驟S5中高壓侵染的壓力為0. 08MPa。
[0016] 本發(fā)明具有W下有益效果：
[0017] 根據(jù)八氨番茄紅素脫氨酶（PD巧的編碼基因序列設(shè)計(jì)特異引物，通過(guò)RT-PCR在石 竹中擴(kuò)增出大約50化P的CDNA片段。將獲得的PDSCDNA片段連接到TRV2上，通過(guò)優(yōu)化 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的病毒誘導(dǎo)基因沉默體系，根據(jù)植株出現(xiàn)光漂白的頻率、漂白的葉面積大小、漂 白的狀況，將乙酷下香酬濃度、苗齡、侵染后預(yù)培養(yǎng)的溫度W及預(yù)培養(yǎng)后植株的光照條件進(jìn) 行配套整合，建立了一套快速、有效的病毒誘導(dǎo)沉默體系，可W獲得病毒誘導(dǎo)的基因沉默性 狀，進(jìn)而解決有效驗(yàn)證石竹基因功能的問(wèn)題。
【附圖說(shuō)明】
[0018] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例病毒誘導(dǎo)的石竹八氨番茄紅素脫氨酶基因高效沉默體系的 流程框圖。
[0019] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例中龍葵、煙草及石竹PDS核巧酸水平同源性比較。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 為了使本發(fā)明的目的及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，W下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步 詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用W解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā) 明。
[0021] 如圖1所示，本發(fā)明實(shí)施例提供了病毒誘導(dǎo)的石竹八氨番茄紅素脫氨酶基因高效 沉默體系，包括如下步驟：
[002引 S1、采用八氨番茄紅素脫氨酶（PDS)的編碼基因序列設(shè)計(jì)特異引物，引物分別為
[0023] 4F：GATGAGGATGGGGACTGGTA
[0024] 4R：ATTTAGCGCCTTTGACATGG
[00巧]S2、從石竹中克隆PDS基因，通過(guò)RT-PCR在石竹中擴(kuò)增出SOObp大小的PDS基因 片段，并將片段連接到pGEMT-easy載體上；
[0026]S3、將連接到載體pGEMT-easy上的PDS片段用酶切后連接到采用同樣酶切后的 TRV2載體上；
[0027]S4、將步驟S3所得的PTRV2-PDS5000轉(zhuǎn)入GV3101農(nóng)桿菌中，進(jìn)行陽(yáng)性克隆的PCR 鑒定；
[0028]S5、室溫下將含有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌在滲透緩沖液（MES+MgC12+Aceto)中活化 地后，采用濃度為IOOum的乙酷下香酬對(duì)4葉期的石竹幼苗室溫下進(jìn)行高壓侵染，壓力為 0. 08MPa，待葉片出現(xiàn)水潰狀時(shí)，表明侵染完成；
[0029]S6、將侵染后的石竹幼苗先放在15°C下預(yù)培養(yǎng)2d后，10°C下繼續(xù)預(yù)培養(yǎng)5d;
[0030]S7、然后步驟S6處理后的石竹幼苗放在20°C，光照為4000LUX的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培 養(yǎng)，15-20d后，出現(xiàn)葉片漂白現(xiàn)象。
[00引]實(shí)施例
[003引步驟一、設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增了不同大小的PDS片段，引物分別為
[0037]步驟二、通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增，W4F和4R為引物擴(kuò)增的500bp大小的片段；W6F和 6R為引物擴(kuò)增的260bp大小的片段；
[003引步驟S、獲得的片段連接到pGEMT-easy上測(cè)序，比對(duì)結(jié)果如下（圖2)。表明擴(kuò)增 的片段與PDS基因有高度同源性。
[0039] 步驟四、將連接到載體pGEMT-easy上的PDS片段用酶切后連接到采用同樣酶切 后的TRV2載體上，然后進(jìn)行酶切驗(yàn)證。PTRV2-PDS500和PTRV2-PDS260經(jīng)EcoRI剪切后，分 別獲得的10. 0化和50化P，W及10. 0化和26化P的酶切片段。
[0040] 步驟五、將連接了不同PDS片段大小的TRV2轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中，陽(yáng)性克隆進(jìn)行 PCR檢測(cè)，然后侵染石竹幼苗。經(jīng)農(nóng)桿菌侵染石竹幼苗后，連接了 26化PPDS大小的載體侵染 效果不好，未出現(xiàn)葉片漂白現(xiàn)象，而連接了 5(K)bpPDS大小的載體侵染效果好，出現(xiàn)葉片漂 白現(xiàn)象。
[0041] 步驟六、建立侵染體系
[0042] 分別采用不同濃度的乙酷下香酬配制侵染液，對(duì)不同苗齡的石竹幼苗進(jìn)行浸染處 理，而后在10°C、15°C低溫條件下處理一周，在正常溫度、不同光強(qiáng)的外界條件下培養(yǎng)石竹 幼苗兩周W上，觀察記錄侵染結(jié)果。
[0043] 表1不同濃度的乙酷下香酬的侵染效果比較
[0044]
[0045]表2不同苗齡的石竹幼苗的侵染效果比較
[0046]
[0047] 表3侵染后不同溫度預(yù)處理與20°C培養(yǎng)下不同光照強(qiáng)度協(xié)同作用對(duì)PDS漂白效果 的影響
[0048]
[0049] 如表1-3可知，侵染體系為：濃度為IOOum的乙酷下香酬的侵染四片真葉的石竹幼 苗，侵染后在15°C下預(yù)培養(yǎng)2d后，10°C下繼續(xù)預(yù)培養(yǎng)5山然后放在20°C、光照為4000LUX下 進(jìn)行培養(yǎng)，侵染效率最高，植株侵染率20 %。
[0050] W上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可W作出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，運(yùn)些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng) 視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 病毒誘導(dǎo)的石竹八氫番茄紅素脫氫酶基因高效沉默體系，其特征在于，包括如下步 驟： 51、 采用八氫番茄紅素脫氫酶（ros)的編碼基因序列設(shè)計(jì)特異引物，引物分別為 4F：GATGAGGATGGGGACTGGTA 4R：ATTTAGCGCCTTTGACATGG 52、 從石竹中克隆PDS基因，通過(guò)RT-PCR在石竹中擴(kuò)增出500bp大小的PDS基因片段， 并將片段連接到pGEMT-easy載體上； 53、 將連接到載體pGEMT-easy上的PDS片段用酶切后連接到采用同樣酶切后的TRV2 載體上； 54、 將步驟S3所得的pTRV2-PDS5000轉(zhuǎn)入GV3101農(nóng)桿菌中，進(jìn)行陽(yáng)性克隆的PCR鑒 定； 55、 室溫下將含有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌在滲透緩沖液（MES+MgC12+Aceto)中活化4h后， 采用濃度為l〇〇um的乙酰丁香酮對(duì)4葉期的石竹幼苗室溫下進(jìn)行高壓侵染，待葉片出現(xiàn)水 漬狀時(shí)，表明侵染完成； 56、 將侵染后的石竹幼苗先放在15°C下預(yù)培養(yǎng)2d后，10°C下繼續(xù)預(yù)培養(yǎng)5d; 57、 然后步驟S6處理后的石竹幼苗放在20°C，光照為4000LUX的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)， 15-20d后，出現(xiàn)葉片漂白現(xiàn)象。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的病毒誘導(dǎo)的石竹八氫番茄紅素脫氫酶基因高效沉默體系，其 特征在于，所述步驟S5中高壓侵染的壓力為0. 08MPa。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種病毒誘導(dǎo)的石竹八氫番茄紅素脫氫酶基因高效沉默體系，根據(jù)八氫番茄紅素脫氫酶(PDS)的編碼基因序列設(shè)計(jì)特異引物，通過(guò)RT-PCR在石竹中擴(kuò)增出大約500bp的cDNA片段。將獲得的PDS？cDNA片段連接到TRV2上，通過(guò)優(yōu)化農(nóng)桿菌介導(dǎo)的病毒誘導(dǎo)基因沉默體系，根據(jù)植株出現(xiàn)光漂白的頻率、漂白的葉面積大小、漂白的狀況，將乙酰丁香酮濃度、苗齡、侵染后預(yù)培養(yǎng)的溫度以及預(yù)培養(yǎng)后植株的光照條件進(jìn)行配套整合，建立了一套快速、有效的病毒誘導(dǎo)沉默體系，可以獲得病毒誘導(dǎo)的基因沉默性狀，進(jìn)而解決有效驗(yàn)證石竹基因功能的問(wèn)題。
【IPC分類(lèi)】C12N15/84, A01H5/00
【公開(kāi)號(hào)】CN105296535
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510559160
【發(fā)明人】賀學(xué)勤, 張婧
【申請(qǐng)人】?jī)?nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開(kāi)日】2016年2月3日
【申請(qǐng)日】2015年8月30日