專(zhuān)利名稱(chēng)：胡蘿卜素合酶基因及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及一種含有八氫番茄紅素脫氫酶(PD)，八氫番茄紅素合酶(PS)，和番茄紅素環(huán)化酶(LC)的生物學(xué)活性的新型胡蘿卜素合酶基因，和涉及由該基因編碼的蛋白質(zhì)，且涉及制備和使用由其編碼的胡蘿卜素合酶的方法。
背景技術(shù)：
大多數(shù)產(chǎn)胡蘿卜素的細(xì)菌在三個(gè)酶促步驟(PS，PD，和LC；見(jiàn)圖1)中從前體牻牛兒基牻牛兒焦磷酸(geranylgeranyl pyrophosphate(GGPP))合成β-胡蘿卜素，且這些酶由三個(gè)獨(dú)立且不同的基因編碼。有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)了在某些絲狀真菌中的編碼具有PS和LC活性的雙功能酶的單個(gè)基因(Verdoes，J.C.，等，Mol.Gen.Genet.262，453-461(1999)；Velayos，A.等，Eur.J.Biochem.267，5509-5519(2000)；Arrach，N.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98，1687-1692(2001)；Arrach，N.等，Mol.Genet.Genomics 266，914-921(2002))。在植物和一些細(xì)菌中，八氫番茄紅素向番茄紅素的生化轉(zhuǎn)化通過(guò)由兩個(gè)獨(dú)立的基因編碼的兩個(gè)獨(dú)立的酶進(jìn)行即僅將八氫番茄紅素轉(zhuǎn)化成ζ-胡蘿卜素的八氫番茄紅素脫氫酶和將ζ-胡蘿卜素轉(zhuǎn)化成番茄紅素的ζ-胡蘿卜素脫氫酶。另外，植物的該轉(zhuǎn)化還需要類(lèi)胡蘿卜素異構(gòu)酶。
在全球，許多人患有由其食物中低水平的維生素A引起的眼機(jī)能障礙。在最近幾年，一些研究小組改造了莊稼植物用于產(chǎn)生類(lèi)胡蘿卜素，且主要是β-胡蘿卜素，因?yàn)樵谝灾魇匙罱K提供該維生素的嘗試中它具有維生素A前體的活性。例如，已發(fā)表的成果(例如，Shewmaker等，Plant J.，20，401，(1999))證實(shí)了在發(fā)育的canola種子中表達(dá)細(xì)菌八氫番茄紅素合酶(PS)導(dǎo)致在那些種子中的類(lèi)胡蘿卜素產(chǎn)生明顯增加。作為另一例子，水稻胚乳的β-胡蘿卜素積累需要表達(dá)八氫番茄紅素脫氫酶(PD)和八氫番茄紅素合酶(PS)活性(Beyer等，J.Nutri.132，506S，(2002))。這些酶的基因來(lái)自不同的生物來(lái)源。然而，傳聞的信息表明后來(lái)繁殖這些水稻品系導(dǎo)致PD和PS基因分離。這些發(fā)育中的問(wèn)題阻礙了有效使用轉(zhuǎn)化的植物產(chǎn)生類(lèi)胡蘿卜素。
因此需要發(fā)現(xiàn)類(lèi)胡蘿卜素合酶途徑中的新型酶，特別是含有多種酶功能的酶，用于遺傳改造微生物和植物，以便通過(guò)生物合成方法產(chǎn)生類(lèi)胡蘿卜素。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及分離的胡蘿卜素合酶蛋白。該蛋白包含選自如下的氨基酸序列(a)選自由SEQ ID NO3，SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9，SEQ ID NO3的位置30至1268組成的氨基酸序列，和其生物活性片段組成的組中的氨基酸序列；(b)與SEQ ID NO3或者與SEQID NO3的位置30至1268組成的氨基酸序列具有至少大約40％相同性的氨基酸序列，其中該氨基酸序列具有下列生物學(xué)活性八氫番茄紅素脫氫酶(PD)活性，八氫番茄紅素合酶(PS)活性，和番茄紅素環(huán)化酶(LC)活性；(c)與SEQ ID NO5具有至少大約40％相同性的氨基酸序列，其中該氨基酸序列具有八氫番茄紅素脫氫酶(PD)活性；(d)與SEQ ID NO7具有至少大約40％相同性的氨基酸序列，其中該氨基酸序列具有八氫番茄紅素合酶(PD)活性；和(e)與SEQ ID NO9具有至少大約40％相同性的氨基酸序列，其中該氨基酸序列具有番茄紅素環(huán)化酶(LC)活性。在另一方面，該分離的蛋白質(zhì)包含與上面限定的氨基酸序列之一具有至少大約60％相同性，且在另一方面，與上面限定的氨基酸序列之一具有至少大約80％相同性，且在另一方面與上面限定的氨基酸序列之一具有至少大約95％相同性的氨基酸序列。優(yōu)選的是，該蛋白質(zhì)具有選自八氫番茄紅素脫氫酶(PD)活性，八氫番茄紅素合酶(PS)活性，和/或番茄紅素環(huán)化酶(LC)活性中的一種生物學(xué)活性。在一個(gè)方面，該蛋白質(zhì)包含選自SEQ ID NO3，SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQID NO9，由SEQ ID NO3的位置30至1268組成的氨基酸序列，和其生物活性片段中的氨基酸序列。在另一方面，該蛋白質(zhì)包含SEQ ID NO5，SEQ ID NO7和SEQ ID NO9。
胡蘿卜素合酶蛋白質(zhì)可從任何合適的生物中分離，該生物包括，但不限于，Thraustochytriales微生物(例如，Schizochytrium微生物)。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種分離的蛋白質(zhì)，它包含選自如下的氨基酸序列(a)包含SEQ ID NO5和SEQ ID NO7的氨基酸序列；和(b)與(a)的氨基酸序列具有至少大約40％相同性的氨基酸序列，其中該氨基酸序列具有下列生物學(xué)活性八氫番茄紅素脫氫酶(PD)活性和八氫番茄紅素合酶(PS)活性。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案涉及與選自SEQ ID NO3，SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，和SEQ ID NO9的氨基酸序列選擇性結(jié)合的分離的抗體。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案涉及含有選自如下的核酸序列的分離的核酸分子(a)編碼選自由SEQ ID NO3，SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQ IDNO9，SEQ ID NO3的位置30至1268組成的氨基酸序列，和任一氨基酸序列的生物活性片段組成的組中的氨基酸序列的核酸序列；(b)編碼與SEQ TD NO3或者與SEQ ID NO3的位置30至1268組成的氨基酸序列具有至少大約40％相同性的氨基酸序列的核酸序列，其中該氨基酸序列具有下列生物學(xué)活性八氫番茄紅素脫氫酶(PD)活性，八氫番茄紅素合酶(PS)活性，和番茄紅素環(huán)化酶(LC)活性；(c)編碼與SEQ ID NO5具有至少大約40％相同性的氨基酸序列的核酸序列，其中該氨基酸序列具有八氫番茄紅素脫氫酶(PD)活性；(d)編碼與SEQ ID NO7具有至少大約40％相同性的氨基酸序列的核酸序列，其中該氨基酸序列具有八氫番茄紅素合酶(PS)活性；(e)編碼與SEQ ID NO9具有至少大約40％相同性的氨基酸序列的核酸序列，其中該氨基酸序列具有番茄紅素環(huán)化酶(LC)活性；和(f)與(a)-(e)的核酸序列中的任意一種完全互補(bǔ)的核酸序列。
在一個(gè)方面，該分離的核酸分子包含編碼氨基酸序列的核酸序列，該氨基酸序列與任一上述氨基酸序列具有至少大約60％的相同性，且在另一方面，它與任一上面限定的氨基酸序列具有至少大約80％的相同性，且在另一方面，它與任一上面限定的氨基酸序列具有至少大約95％的相同性。優(yōu)選的是，該氨基酸序列具有選自如下的生物學(xué)活性八氫番茄紅素脫氫酶(PD)活性，八氫番茄紅素合酶(PS)活性，和/或番茄紅素環(huán)化酶(LC)活性。在本發(fā)明的一個(gè)方面，該核酸分子包含編碼氨基酸序列的核酸序列，該氨基酸序列選自SEQ ID NO3，SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9，和SEQ ID NO3的位置30至1268組成的氨基酸序列。在另一方面，該核酸序列選自SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，SEQ ID NO6和SEQ ID NO8。在另一方面，該核酸序列編碼選自由SEQ ID NO5，SEQ ID NO7和SEQ ID NO9組成的組中的任意兩種氨基酸序列，且在另一方面，該核酸序列編碼SEQ ID NO5，SEQ ID NO7和SEQ ID NO9。
本發(fā)明還包括重組核酸分子，它含有與轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列可操作地相連的任一上面限定的核酸分子。該轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列包括，但不限于，組織特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。該重組核酸分子在某些方面還可包含靶序列。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案涉及用本發(fā)明的任一重組核酸分子轉(zhuǎn)化的重組細(xì)胞。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案涉及用于通過(guò)生物合成過(guò)程產(chǎn)生類(lèi)胡蘿卜素的遺傳修飾的微生物或遺傳修飾的植物，該微生物或植物被本發(fā)明的任一重組核酸分子轉(zhuǎn)化。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案涉及用于通過(guò)生物合成過(guò)程產(chǎn)生類(lèi)胡蘿卜素的遺傳修飾的微生物。該微生物包含編碼胡蘿卜素合酶的核酸分子，該核酸分子被修飾以增加胡蘿卜素合酶的表達(dá)或生物學(xué)活性。該胡蘿卜素合酶可包含任一上述氨基酸序列。在本發(fā)明的另一方面，編碼胡蘿卜素合酶的核酸分子是該微生物中的內(nèi)源性基因。在另一方面，用編碼胡蘿卜素合酶的核酸分子轉(zhuǎn)化該微生物。在該實(shí)施方案中，該微生物可以是Thraustochytriales微生物(例如，Schizochytrium)。在另一方面，該微生物包含編碼胡蘿卜素合酶的內(nèi)源性基因且被編碼該胡蘿卜素合酶的重組核酸分子轉(zhuǎn)化。在該方面，該基因和重組核酸分子之一或兩者都被修飾以增加胡蘿卜素合酶的表達(dá)或生物學(xué)活性。該微生物可包括Thraustochytriales微生物(例如，Schizochytrium微生物)。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案涉及含有任一上述遺傳修飾的微生物的生物量(biomass)。本發(fā)明還包括含有該生物量的食品和藥品。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案涉及通過(guò)生物合成過(guò)程產(chǎn)生類(lèi)胡蘿卜素的方法。該方法包括在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)遺傳修飾的微生物的步驟，該微生物的上述胡蘿卜素合酶的表達(dá)或生物學(xué)活性增加。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是通過(guò)生物合成過(guò)程產(chǎn)生類(lèi)胡蘿卜素的方法，包括使用重組核酸分子轉(zhuǎn)化的遺傳修飾的植物生長(zhǎng)，該重組核酸分子編碼含有任一上述胡蘿卜素合酶蛋白的蛋白質(zhì)。在另一實(shí)施方案中，該重組核酸分子編碼具有八氫番茄紅素脫氫酶(PD)活性和八氫番茄紅素合酶(PS)活性，但沒(méi)有番茄紅素環(huán)化酶(LC)活性的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案涉及包含核酸序列的至少12個(gè)連續(xù)核苷酸的寡核苷酸，該核酸序列選自由SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，SEQ IDNO6，SEQ ID NO8，和與其完全互補(bǔ)的核酸序列組成的組中。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案涉及缺乏色素形成(pigmentation)的遺傳修飾的微生物，其中該微生物(例如，Thraustochytriales目的微生物)被遺傳修飾成選擇性缺失或失活胡蘿卜素合酶基因或其功能域編碼部分。該胡蘿卜素合酶基因選自(a)編碼SEQ ID NO3的核酸序列；和(b)編碼與SEQ ID NO3具有至少大約40％相同性的氨基酸序列的核酸序列，其中具有該氨基酸序列的蛋白質(zhì)具有選自由八氫番茄紅素脫氫酶(PD)活性，八氫番茄紅素合酶(PS)活性，和番茄紅素環(huán)化酶(LC)活性組成的組中的一種生物學(xué)活性。在一個(gè)方面，該胡蘿卜素合酶基因包含SEQ ID NO3所示的核酸序列。該微生物可選自，但不限于，Thraustochytriales微生物，例如Schizochytrium。在一個(gè)方面，該胡蘿卜素合酶基因的調(diào)控區(qū)被修飾以抑制該基因的表達(dá)。在另一方面，該胡蘿卜素合酶基因部分或完全缺失使得該微生物不能產(chǎn)生功能性胡蘿卜素合酶。在另一方面，用與胡蘿卜素合酶基因雜交且包含破壞胡蘿卜素合酶基因編碼區(qū)的異源性核酸序列的核酸序列通過(guò)定向同源重組來(lái)突變或失活該胡蘿卜素合酶基因。
本發(fā)明還包括包含與相同種類(lèi)的野生型微生物相比色素形成減少的遺傳修飾的微生物(例如，Thraustochytriales目的微生物)的生物量，其中該微生物遺傳修飾成選擇性缺失或失活上述胡蘿卜素合酶基因。本發(fā)明的另一方面涉及含有該生物量的食品。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案涉及從生物合成過(guò)程產(chǎn)生缺乏色素形成的脂類(lèi)的方法。該方法包括在有效產(chǎn)生該脂類(lèi)的條件下培養(yǎng)遺傳修飾的微生物(例如，Thraustochytriales目的微生物)的步驟，其中該微生物被遺傳修飾成選擇性缺失或失活上述胡蘿卜素合酶基因。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案涉及從生物合成過(guò)程回收缺乏色素形成的脂類(lèi)的方法，包括從遺傳修飾的微生物(例如，Thraustochytriales目的微生物)的培養(yǎng)物回收脂類(lèi)，其中該微生物被遺傳修飾成選擇性缺失或失活上述胡蘿卜素合酶基因。因此，本發(fā)明的另一方面涉及從上述遺傳修飾的微生物的培養(yǎng)物回收的缺乏色素形成的脂類(lèi)，其中該微生物被遺傳修飾成選擇性缺失或失活上述胡蘿卜素合酶基因，以及涉及含有該脂類(lèi)的產(chǎn)品(例如，食品或藥品)。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案涉及產(chǎn)生類(lèi)胡蘿卜素的方法，包括將底物與分離的胡蘿卜素合酶在足以產(chǎn)生類(lèi)胡蘿卜素的條件下接觸，其中該分離的胡蘿卜素合酶包含任一上述氨基酸序列。


圖1是顯示從GGPP生物合成β-胡蘿卜素的簡(jiǎn)圖。
圖2是顯示產(chǎn)生從β-胡蘿卜素衍生的類(lèi)胡蘿卜素的簡(jiǎn)圖。
發(fā)明詳述本發(fā)明描述了Schizochytrium sp.的新型三功能域基因，它編碼具有三種不同酶活性即八氫番茄紅素脫氫酶(PD)，八氫番茄紅素合酶(PS)，和番茄紅素環(huán)化酶(LC)的蛋白質(zhì)。該多功能蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn)提供了一種用于經(jīng)濟(jì)型產(chǎn)生類(lèi)胡蘿卜素的新方法。例如，現(xiàn)在可以克隆和表達(dá)具有三個(gè)關(guān)鍵連續(xù)酶功能的一個(gè)基因而不是從其它生物體的類(lèi)胡蘿卜素生物合成途徑克隆2，3或4個(gè)基因，這極大地方便了對(duì)產(chǎn)生型生物體的遺傳修飾。另外，可以單獨(dú)或以各種組合使用Schizoclaytriurn CS基因的酶結(jié)構(gòu)域來(lái)構(gòu)建表達(dá)一個(gè)，兩個(gè)，或所有三個(gè)結(jié)構(gòu)域的各種重組/合成基因。
更具體地說(shuō)，本發(fā)明一般涉及一種分離的基因，本文稱(chēng)為胡蘿卜素合酶基因，且涉及其同源物，涉及由該基因編碼的酶或其生物活性部分及其同源物，涉及含有該基因的重組核酸分子，涉及用該基因轉(zhuǎn)化的微生物和植物及其后代，涉及遺傳修飾成增加或減少了該基因作用的Schizochytrium和其它Thraustochytrid生物，涉及通過(guò)在有效產(chǎn)生類(lèi)胡蘿卜素的條件下培養(yǎng)上述微生物或植物產(chǎn)生類(lèi)胡蘿卜素及其衍生物的方法。
本發(fā)明人鑒定了Schizochytrium sp.中與類(lèi)胡蘿卜素生物合成途徑相關(guān)的一個(gè)基因。該基因編碼含有三個(gè)不同區(qū)域(結(jié)構(gòu)域)的單個(gè)多肽。比較這三個(gè)結(jié)構(gòu)域推定的氨基酸序列與公開(kāi)獲得的數(shù)據(jù)庫(kù)表明這些結(jié)構(gòu)域具有下列酶活性(從推斷的N-末端到C-末端依次列出)八氫番茄紅素脫氫酶(PD)，八氫番茄紅素合酶(PS)和番茄紅素環(huán)化酶(LC)。根據(jù)確定的類(lèi)胡蘿卜素生物合成的代謝途徑系統(tǒng)，這三個(gè)酶活性可完成從牻牛兒基牻牛兒焦磷酸向β-胡蘿卜素的轉(zhuǎn)化(例如，見(jiàn)圖1)。這里，本發(fā)明人將本發(fā)明的胡蘿卜素合酶(CS)基因定義為編碼具有PD，PS和LC結(jié)構(gòu)域的酶的核酸序列。應(yīng)明白酶(活性)名稱(chēng)“八氫番茄紅素脫氫酶”和“八氫番茄紅素去飽和酶”可以互換且本文任何提及的“八氫番茄紅素脫氫酶”或“PD”均包括提及的稱(chēng)為“八氫番茄紅素去飽和酶”的酶和活性。
盡管已經(jīng)鑒定，克隆和測(cè)序了許多編碼類(lèi)胡蘿卜素途徑的酶的基因，但是據(jù)本發(fā)明人所知，從Schizochytrium-或Thraustochytriales目的任一成員克隆和鑒定與該途徑相關(guān)的基因還是首次。另外，據(jù)本發(fā)明人所知，在單個(gè)多肽中發(fā)現(xiàn)類(lèi)胡蘿卜素途徑的三個(gè)酶功能也是首次。在一個(gè)多肽中發(fā)現(xiàn)兩個(gè)類(lèi)胡蘿卜素合成途徑的酶功能(具體地說(shuō)，PS和LC)的例子確實(shí)存在，但是沒(méi)有三個(gè)酶功能的例子。
PS，PD和LC是類(lèi)胡蘿卜素生物合成途徑中的連續(xù)酶。在單個(gè)多肽中存在這三個(gè)酶功能表明中間產(chǎn)物在該系列反應(yīng)中的代謝通道作用。已有PS的量增加導(dǎo)致通過(guò)類(lèi)胡蘿卜素合成途徑的通量顯著增加的例子(例如，參見(jiàn)Shewmaker，等，“八氫番茄紅素合酶的種子特異性過(guò)表達(dá)增加類(lèi)胡蘿卜素和其它代謝產(chǎn)物”，The Plant Journal 20，401-412(1999))。在異源性宿主或者在Schizochytrium本身中導(dǎo)入(或者增加表達(dá))編碼PD，PS和LC酶結(jié)構(gòu)域的Schizochytrium胡蘿卜素合酶基因可允許同時(shí)提高這三種酶活性。這相對(duì)于導(dǎo)入編碼這三個(gè)功能的兩個(gè)或三個(gè)分離的基因具有明顯的優(yōu)勢(shì)。預(yù)期這些酶活性水平升高可導(dǎo)致在Schizochytrium或異源性宿主中β-胡蘿卜素的產(chǎn)量升高，事實(shí)上，本發(fā)明人表明與對(duì)照相比用本發(fā)明的胡蘿卜素合酶基因轉(zhuǎn)化的Schizochytrium產(chǎn)生的β-胡蘿卜素的量增加。這一β-胡蘿卜素量的增加本身是有用的，或者增加的β-胡蘿卜素水平可用作產(chǎn)生β-胡蘿卜素衍生的類(lèi)胡蘿卜素(例如，但不限于，角黃素，玉米黃質(zhì)或蝦青素；參見(jiàn)圖2)的底物。本發(fā)明人還表明用本發(fā)明的胡蘿卜素合酶基因轉(zhuǎn)化的Schizochytrium與對(duì)照相比產(chǎn)生的蝦青素量增加(見(jiàn)實(shí)施例)。另外，胡蘿卜素合酶基因的修飾可導(dǎo)致產(chǎn)生番茄紅素，而番茄紅素又可用作產(chǎn)生α-胡蘿卜素和葉黃素的底物。
因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及一種分離的胡蘿卜素合酶。本文所用的包括分離的胡蘿卜素合酶的分離的蛋白質(zhì)是指從其天然環(huán)境中取出(即，進(jìn)行了人工操作)的蛋白質(zhì)(包括多肽或肽)且可包括例如，純化的蛋白質(zhì)，部分純化的蛋白質(zhì)，重組產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，和合成產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。因此，“分離的”并不反映該蛋白質(zhì)被純化的程度。優(yōu)選的是，本發(fā)明的分離的胡蘿卜素合酶是重組產(chǎn)生的。另外，作為例子，“Schizochytrium胡蘿卜素合酶”是指來(lái)自Schizochytrium的胡蘿卜素合酶(一般包括天然存在的胡蘿卜素合酶的同源物)或者是指根據(jù)來(lái)自Schizochytrium的天然存在的胡蘿卜素合酶的結(jié)構(gòu)(例如，序列)和也許是功能的知識(shí)產(chǎn)生的胡蘿卜素合酶蛋白質(zhì)。換句話(huà)說(shuō)，Schizochytrium胡蘿卜素合酶包括具有與來(lái)自Schizochytrium的天然存在的胡蘿卜素合酶基本上相似的結(jié)構(gòu)和功能的任何胡蘿卜素合酶或者是本文詳細(xì)描述的來(lái)自Schizochytrium的天然存在的胡蘿卜素合酶的生物學(xué)活性(即，具有生物學(xué)活性的)同源物。因此，Schizochytrium胡蘿卜素合酶蛋白可包括純化的，部分純化的，重組，突變/修飾的和合成的蛋白質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)“修飾”和“突變”可交換使用，特別是對(duì)于本文所述的胡蘿卜素合酶的氨基酸序列(或核酸序列)的修飾/突變。
根據(jù)本發(fā)明，胡蘿卜素合酶的同源物(即，胡蘿卜素合酶同源物)包括這樣的胡蘿卜素合酶，即其中至少一個(gè)或幾個(gè)，但不限于一個(gè)或幾個(gè)，氨基酸缺失(例如，該蛋白質(zhì)的截短型式，例如肽或片段)，插入，顛倒，取代和/或衍生化(例如，通過(guò)糖基化，磷酸化，乙?；?，十四烷酰化，異戊二烯化，棕櫚酸化，法呢基化，酰胺化和/或添加糖基磷脂酰肌醇)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，胡蘿卜素合酶同源物具有可測(cè)量或可檢測(cè)的胡蘿卜素合酶活性(即，具有生物學(xué)活性)?？蓽y(cè)量的或可檢測(cè)的胡蘿卜素合酶活性包括只有一個(gè)，或者兩個(gè)或全部三個(gè)本發(fā)明的胡蘿卜素合酶上的酶結(jié)構(gòu)域(下文詳細(xì)討論)的酶活性。在另一實(shí)施方案中，胡蘿卜素合酶同源物可具有或者沒(méi)有可測(cè)量的胡蘿卜素合酶活性，但是用于制備抗體或者形成寡核苷酸用于鑒定其它的胡蘿卜素合酶。例如，在實(shí)施例中描述了抗胡蘿卜素合酶的抗體的產(chǎn)生和用于克隆胡蘿卜素合酶的探針和引物的產(chǎn)生。
胡蘿卜素合酶同源物可以是天然等位基因變異或天然突變的結(jié)果。本發(fā)明的胡蘿卜素合酶同源物也可使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)產(chǎn)生，包括，但不限于直接修飾該蛋白質(zhì)或者使用，例如傳統(tǒng)或重組DNA技術(shù)進(jìn)行隨機(jī)或定向誘變修飾編碼該蛋白質(zhì)的基因。編碼胡蘿卜素合酶的核酸的天然存在的等位基因變異體是在基因組上與編碼SEQ ID NO3所示氨基酸序列的基因在基本相同的基因座(或多個(gè)基因座)上存在，但是由于例如，突變或重組引起的天然變異而具有相似但不相同的序列的基因。天然等位基因變異體一般編碼與所比較的基因編碼的蛋白質(zhì)具有相似活性的蛋白質(zhì)。一類(lèi)等位基因變異體可編碼相同蛋白質(zhì)但由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而具有不同核酸序列。等位基因變異體也可在該基因5’或3’非翻譯區(qū)包含改變(例如，在調(diào)控區(qū))。等位基因變異體是本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的。同源物可使用本領(lǐng)域已知的用于產(chǎn)生蛋白質(zhì)的技術(shù)產(chǎn)生，包括，但不限于，直接修飾分離的，天然存在的蛋白質(zhì)，直接蛋白質(zhì)合成，或者使用，例如，傳統(tǒng)或重組DNA技術(shù)進(jìn)行隨機(jī)或定向誘變修飾編碼該蛋白質(zhì)的核酸序列。
與野生型蛋白質(zhì)相比，對(duì)胡蘿卜素合酶同源物的修飾可增加，減少，或者基本上不改變與天然存在的蛋白質(zhì)，即胡蘿卜素合酶相比，該胡蘿卜素合酶同源物的基本生物學(xué)活性。一般來(lái)說(shuō)，蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性或生物學(xué)作用是指體內(nèi)(即，在該蛋白質(zhì)的天然生理學(xué)環(huán)境中)或者體外(即，在實(shí)驗(yàn)室條件下)測(cè)量或觀(guān)察到的歸因于該蛋白質(zhì)的天然存在形式的由該蛋白質(zhì)表現(xiàn)或者完成的任何功能。在諸如同源物或模擬物(下文討論)中對(duì)蛋白質(zhì)的修飾可產(chǎn)生與天然存在的蛋白質(zhì)具有相同生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)，或者產(chǎn)生與天然存在的蛋白質(zhì)相比生物學(xué)活性降低或提高的蛋白質(zhì)。導(dǎo)致蛋白質(zhì)表達(dá)下降或者蛋白質(zhì)活性下降的修飾是指蛋白質(zhì)的失活(完全或者部分)，下調(diào)，或者作用下降。同樣，導(dǎo)致蛋白質(zhì)表達(dá)增加或者蛋白質(zhì)活性增加的修飾是指蛋白質(zhì)的擴(kuò)增，過(guò)度產(chǎn)生，活化，增強(qiáng)，上調(diào)或作用提高。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，包括生物學(xué)活性同源物或其片段的生物學(xué)活性胡蘿卜素合酶具有本文所述的野生型，或者天然存在胡蘿卜素合酶活性的至少一個(gè)特征性生物學(xué)活性。胡蘿卜素合酶的生物學(xué)活性包括上述將牻牛兒基牻牛兒焦磷酸轉(zhuǎn)化成β-胡蘿卜素的能力，可包括本文所述的胡蘿卜素合酶三個(gè)結(jié)構(gòu)域中的任意一種或多個(gè)酶活性。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的胡蘿卜素合酶具有至少一個(gè)，且優(yōu)選兩個(gè)，且最優(yōu)選三個(gè)酶活性。這些酶活性是(1)八氫番茄紅素脫氫酶(PD)酶活性，(2)八氫番茄紅素合酶(PS)酶活性，和(3)番茄紅素環(huán)化酶(LC)酶活性。一般提及的胡蘿卜素合酶生物學(xué)活性或酶活性一般是指所有三種酶活性，但是并不排除僅僅是指酶活性中的一種或兩種。測(cè)量這些酶活性的方法是本領(lǐng)域已知的(例如，參見(jiàn)Fraser和Bramley，Meth.Enzymol.214，365(1993)；Camara，Meth.Enzymol.214，352，(1993)；Hornero-Mendez和Britton，F(xiàn)EBS Lett.515，133，(2002))。本發(fā)明的分離的胡蘿卜素合酶也可通過(guò)其比活進(jìn)行鑒定。“比活”是指通過(guò)該酶將牻牛兒基牻牛兒焦磷酸轉(zhuǎn)化成β-胡蘿卜素的速率。更具體地說(shuō)，它是指每個(gè)時(shí)間單位每mg的酶將牻牛兒基牻牛兒焦磷酸轉(zhuǎn)化成β-胡蘿卜素的分子數(shù)。
根據(jù)本發(fā)明測(cè)量蛋白質(zhì)表達(dá)水平的方法，包括，但不限于western印跡，免疫細(xì)胞化學(xué)，流式細(xì)胞術(shù)或其它基于免疫學(xué)的測(cè)定法；基于包括，但不限于底物結(jié)合的蛋白質(zhì)特性的測(cè)定法。結(jié)合測(cè)定法也是本領(lǐng)域熟知的。例如，可使用BIAcore機(jī)器測(cè)定兩個(gè)蛋白質(zhì)之間的復(fù)合物的結(jié)合常數(shù)。該復(fù)合物的解離常數(shù)可通過(guò)監(jiān)測(cè)緩沖液通過(guò)晶片時(shí)折射率對(duì)時(shí)間的改變來(lái)測(cè)定(O′Shannessy等，Anal.Biochem.212457-468(1993)；Schuster等，Nature 365343-347(1993))。測(cè)量一個(gè)蛋白質(zhì)與另一蛋白質(zhì)結(jié)合的其它合適的測(cè)定法包括，例如，諸如酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)和放射免疫測(cè)定(RIA)的免疫測(cè)定法，或者通過(guò)熒光，紫外吸收，圓二色性，或核磁共振(NMR)監(jiān)測(cè)該蛋白質(zhì)的光譜學(xué)或光學(xué)特性的改變來(lái)測(cè)定結(jié)合。
在一個(gè)實(shí)施方案中，胡蘿卜素合酶(例如，包括從Schizochytrium分離且在本文中詳細(xì)描述的胡蘿卜素合酶的同源物)包括具有至少一種下列活性的蛋白質(zhì)(1)八氫番茄紅素脫氫酶(PD)酶活性，(2)八氫番茄紅素合酶(PS)酶活性，和(3)番茄紅素環(huán)化酶(LC)酶活性。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，分離的胡蘿卜素合酶包含選自如下的氨基酸序列(a)選自SEQ ID NO3，SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9，SEQ ID NO3的位置30至1268組成的氨基酸序列，和其生物活性片段中的氨基酸序列；(b)與SEQID NO3或者與SEQ ID NO3的位置30至1268組成的氨基酸序列具有至少大約40％相同性的氨基酸序列，其中該氨基酸序列具有下列生物學(xué)活性八氫番茄紅素脫氫酶(PD)活性，八氫番茄紅素合酶(PS)活性，和番茄紅素環(huán)化酶(LC)活性；(c)與SEQ ID NO5具有至少大約40％相同性的氨基酸序列，其中該氨基酸序列具有八氫番茄紅素脫氫酶(PD)活性；(d)與SEQ ID NO7具有至少大約40％相同性的氨基酸序列，其中該氨基酸序列具有八氫番茄紅素合酶(PD)活性；或(e)與SEQ ID NO9具有至少大約40％相同性的氨基酸序列，其中該氨基酸序列具有番茄紅素環(huán)化酶(LC)活性。
包含所有三個(gè)酶結(jié)構(gòu)域和信號(hào)序列的本發(fā)明的Schizochytrium胡蘿卜素合酶的全部氨基酸序列本文以SEQ ID NO3(由SEQ ID NO2或者SEQ IDNO1的位置1406-5212編碼)表示。不受理論的約束，本發(fā)明人相信SEQ IDNO3的氨基酸1-29是信號(hào)序列，它在某些情況下可裂解產(chǎn)生具有包含SEQID NO3的位置30至1268的氨基酸序列的胡蘿卜素合酶。現(xiàn)在提及的SEQID NO3，即CS蛋白的第一個(gè)結(jié)構(gòu)域，八氫番茄紅素脫氫酶(PD)結(jié)構(gòu)域，包含SEQ ID NO3的氨基酸53至521且本文以SEQ ID NO5表示。SEQID NO5由本文以SEQ ID NO4表示的核酸序列(SEQ ID NO2的位置157至1563)編碼。CS蛋白的第二個(gè)結(jié)構(gòu)域，即八氫番茄紅素合酶(PS)結(jié)構(gòu)域，包含SEQ ID NO3的氨基酸586至860且本文以SEQ ID NO7表示。SEQID NO7由本文以SEQ ID NO6表示的核酸序列(SEQ ID NO2的位置1756至2580)編碼。CS蛋白的第三個(gè)結(jié)構(gòu)域，即番茄紅素環(huán)化酶(LC)結(jié)構(gòu)域，包含SEQ ID NO3的氨基酸911至1132且本文以SEQ ID NO9表示。SEQ ID NO5由本文以SEQ ID NO8表示的核酸序列(SEQ ID NO2的位置2731至3396)編碼。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，胡蘿卜素合酶包含在SEQ ID NO3的至少大約325個(gè)氨基酸中與SEQ ID NO3所示的氨基酸序列具有至少大約40％相同性的氨基酸序列。在另一方面，本發(fā)明的胡蘿卜素合酶包含在至少大約325個(gè)氨基酸中與SEQ ID NO3具有至少45％相同性的氨基酸序列，且在另一方面在SEQ ID NO3的至少大約325個(gè)氨基酸中，且更優(yōu)選在SEQ ID NO3所示的氨基酸序列的至少大約350個(gè)氨基酸中，且更優(yōu)選在至少大約375個(gè)氨基酸中，且更優(yōu)選在至少大約400個(gè)氨基酸中，且更優(yōu)選在至少大約500個(gè)氨基酸中，且更優(yōu)選在至少大約600個(gè)氨基酸中，且更優(yōu)選在至少大約700個(gè)氨基酸中，且更優(yōu)選在至少大約800個(gè)氨基酸中，且更優(yōu)選在至少大約900個(gè)氨基酸中，且更優(yōu)選在至少大約1000個(gè)氨基酸中，且更優(yōu)選在至少大約1050個(gè)氨基酸中，且更優(yōu)選在全長(zhǎng)中，與SEQ ID NO3所示的氨基酸序列具有至少大約50％，且在另一方面至少大約55％，且在另一方面至少大約60％，且在另一方面至少大約65％，且在另一方面至少大約70％，且在另一方面至少大約75％，且在另一方面至少大約80％，且在另一方面至少大約85％，且在另一方面至少大約90％，且在另一方面至少大約95％的相同性。該蛋白質(zhì)優(yōu)選包含選自八氫番茄紅素脫氫酶(PD)活性，八氫番茄紅素合酶(PS)活性，和番茄紅素環(huán)化酶(LC)活性的本發(fā)明的胡蘿卜素合酶的至少一種，兩種或全部三種酶活性。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，胡蘿卜素合酶包含與SEQ ID NO5所示的氨基酸序列具有至少大約40％相同性的氨基酸序列。在另一方面，本發(fā)明的胡蘿卜素合酶包含與SEQ ID NO5具有至少45％的相同性，且在另一方面在SEQ ID NO5所示氨基酸序列的全長(zhǎng)上與SEQ ID NO5所示的氨基酸序列具有至少大約50％，且在另一方面至少大約55％，且在另一方面至少大約60％，且在另一方面至少大約65％，且在另一方面至少大約70％，且在另一方面至少大約75％，且在另一方面至少大約80％，且在另一方面至少大約85％，且在另一方面至少大約90％，且在另一方面至少大約95％相同性的氨基酸序列。該蛋白質(zhì)至少包含八氫番茄紅素脫氫酶(PD)活性。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，胡蘿卜素合酶包含與SEQ ID NO7所示的氨基酸序列具有至少大約40％相同性的氨基酸序列。在另一方面，本發(fā)明的胡蘿卜素合酶包含與SEQ ID NO7具有至少45％的相同性，且在另一方面在SEQ ID NO7所示氨基酸序列的全長(zhǎng)上與SEQ ID NO7所示的氨基酸序列具有至少大約50％，且在另一方面至少大約55％，且在另一方面至少大約60％，且在另一方面至少大約65％，且在另一方面至少大約70％，且在另一方面至少大約75％，且在另一方面至少大約80％，且在另一方面至少大約85％，且在另一方面至少大約90％，且在另一方面至少大約95％相同性的氨基酸序列。該蛋白質(zhì)至少包含八氫番茄紅素合酶(PS)活性。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，胡蘿卜素合酶包含與SEQ ID NO9所示的氨基酸序列具有至少大約40％相同性的氨基酸序列。在另一方面，本發(fā)明的胡蘿卜素合酶包含與SEQ ID NO9具有至少45％的相同性，且在另一方面在SEQ ID NO9所示氨基酸序列的全長(zhǎng)上與SEQ ID NO9所示的氨基酸序列具有至少大約50％，且在另一方面至少大約55％，且在另一方面至少大約60％，且在另一方面至少大約65％，且在另一方面至少大約70％，且在另一方面至少大約75％，且在另一方面至少大約80％，且在另一方面至少大約85％，且在另一方面至少大約90％，且在另一方面至少大約95％相同性的氨基酸序列。該蛋白質(zhì)至少包含番茄紅素環(huán)化酶(LC)活性。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的胡蘿卜素合酶同源物具有與SEQ ID NO3，SEQ ID NO5，SEQ ID NO7或SEQ ID NO9中任一個(gè)有至少大約100％相同性的氨基酸序列。在本發(fā)明的另一方面，根據(jù)本發(fā)明的胡蘿卜素合酶同源物具有與任一上面限定的氨基酸序列有至少大約99％相同性，且在另一實(shí)施方案中，與任一上面限定的氨基酸序列有至少98％相同性，且在另一實(shí)施方案中，與任一上面限定的氨基酸序列有至少97％相同性，且在另一實(shí)施方案中，與任一上面限定的氨基酸序列有至少96％相同性，且在另一實(shí)施方案中，與任一上面限定的氨基酸序列有至少95％相同性，且在另一實(shí)施方案中，與任一上面限定的氨基酸序列有至少94％相同性，且在另一實(shí)施方案中，與任一上面限定的氨基酸序列有至少93％相同性，且在另一實(shí)施方案中，與任一上面限定的氨基酸序列有至少92％相同性，且在另一實(shí)施方案中，與任一上面限定的氨基酸序列有至少91％相同性，且在另一實(shí)施方案中，與任一上面限定的氨基酸序列有至少90％相同性，等等以所有整數(shù)增加的相同性的氨基酸序列。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，胡蘿卜素合酶包含選自SEQ ID NO5(PD)，SEQ ID NO7(PS)，或SEQ ID NO9(LC)(或其同源物)的任意兩種氨基酸序列，但不必包含第三個(gè)序列。例如，可產(chǎn)生僅包含野生型CS的八氫番茄紅素脫氫酶(PD)和八氫番茄紅素合酶(PS)結(jié)構(gòu)域(即從合成的構(gòu)建體缺失或省去(omit)番茄紅素環(huán)化酶(LC)結(jié)構(gòu)域)的本發(fā)明的胡蘿卜素合酶(即，天然存在的Schizochytrium CS的同源物)。缺失LC結(jié)構(gòu)域的構(gòu)建體的例子在實(shí)施例中描述。該蛋白質(zhì)可用于例如，產(chǎn)生類(lèi)胡蘿卜素番茄紅素。了解本發(fā)明的完整胡蘿卜素合酶的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)允許本領(lǐng)域的技術(shù)人員選擇一個(gè)或兩個(gè)結(jié)構(gòu)域來(lái)產(chǎn)生僅具有一種或兩種酶功能，而不是所有三種酶功能的新型蛋白質(zhì)。
除非另有說(shuō)明，本文使用的提及的相同性百分?jǐn)?shù)(％)是指使用(1)以標(biāo)準(zhǔn)默認(rèn)參數(shù)使用blastp進(jìn)行氨基酸檢索和blastn進(jìn)行核酸檢索的BLAST 2.0Basic BLAST同源性檢索，其中查詢(xún)序列通過(guò)默認(rèn)值過(guò)濾低復(fù)雜性區(qū)域(lowcomplexity regions)(在A(yíng)ltschul，S.F.，Madden，T.L.，Schaaffer，A.A.，Zhang，J.，Zhang，Z.，Miller，W.& Lipman，D.J.(1997)“有間隔的BLAST和PSI-BLAST新一代蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索程序”，Nucleic Acids Res.253389-3402中描述，本文以其整體引用以供參考)；(2)BLAST 2序列對(duì)比(使用下文所述的參數(shù))；(3)和/或用標(biāo)準(zhǔn)默認(rèn)參數(shù)的PSI-BLAST(位點(diǎn)特異性重復(fù)的BLAST)進(jìn)行的同源性評(píng)估。應(yīng)注意由于在BLAST 2.0 Basic BLAST和BLAST 2之間的標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)的一些差異，兩個(gè)特定序列使用BLAST 2程序可能認(rèn)為具有明顯同源性，而使用其中一個(gè)序列作為查詢(xún)序列在BLAST 2.0Basic BLAST中進(jìn)行的檢索可能在最高匹配序列中不能鑒定出第二條序列。另外，PSI-BLAST提供了一種自動(dòng)的，便于使用的“profile”檢索類(lèi)型，它是一種尋找序列同源性的靈敏方法。該程序首先進(jìn)行有間隔的BLAST數(shù)據(jù)庫(kù)檢索。PSI-BLAST程序使用來(lái)自任何有意義的序列對(duì)比的信息返回構(gòu)建位點(diǎn)特異性記分矩陣，它代替查詢(xún)序列用于下一輪數(shù)據(jù)庫(kù)檢索。因此，應(yīng)明白使用這些程序中的任一種都可測(cè)定相同性百分?jǐn)?shù)。
兩個(gè)具體序列可使用在Tatusova和Madden，(1999)，“Blast 2序列-比較蛋白質(zhì)和核苷酸序列的一種新工具”，F(xiàn)EMS Microbiol Lett.174247-250(本文以其整體引用以供參考)中所述的BLAST 2序列互相進(jìn)行序列對(duì)比。BLAST 2序列對(duì)比在blastp或blastn中進(jìn)行，使用BLAST 2.0算法在兩個(gè)序列之間進(jìn)行有間隔的BLAST檢索(BLAST 2.0)，它允許在所得的序列對(duì)比中導(dǎo)入間隔(缺失和插入)。本文為了清楚，使用如下標(biāo)準(zhǔn)默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行BLAST 2序列對(duì)比。
對(duì)于blastn，使用0 BLOSUM62矩陣匹配得分(reward for match)＝1錯(cuò)配罰分(penalty for mismatch)＝-2open gap(5)和extension gap(2)罰分gap x_dropoff(50)expect(10)word size(11)filter(on)對(duì)于blastp，使用0 BLOSUM62矩陣open gap(11)和extension gap(1)罰分gap L_dropoff(50)expect(10)word size(3)filter(on)。
胡蘿卜素合酶也可包括具有包含SEQ ID NO3的至少10個(gè)連續(xù)氨基酸殘基(即，與SEQ ID NO3所示氨基酸序列的10個(gè)連續(xù)氨基酸具有100％相同性的10個(gè)連續(xù)氨基酸殘基)的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。在另一方面，胡蘿卜素合酶氨基酸序列的同源物包括含有SEQ ID NO3所示氨基酸序列的至少20，或至少大約30，或至少大約40，或至少大約50，或至少大約75，或至少大約100，或至少大約115，或至少大約130，或至少大約150，或至少大約200，或至少大約250，或至少大約300，或至少大約350，或至少大約400，或至少大約500，或至少大約600，或至少大約700，或至少大約800，或至少大約900，或至少大約1000，或至少大約1100，或至少大約1200個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基的氨基酸序列。胡蘿卜素合酶同源物可包括由包含SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所示核酸序列的至少大約30，或至少大約60，或至少大約90，或至少大約150，或至少大約225，或至少大約300，或至少大約750，或至少大約900，或至少大約1050，或至少大約1200，或至少大約1500，或至少大約1800，或至少大約2100，或至少大約2400，或至少大約2700，或至少大約3000個(gè)連續(xù)核苷酸的核酸序列編碼的蛋白質(zhì)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，胡蘿卜素合酶同源物具有可測(cè)量的上述胡蘿卜素合酶生物學(xué)活性(即，具有生物學(xué)活性)，包括本發(fā)明的胡蘿卜素合酶所述的一種，兩種或所有三種酶活性。
根據(jù)本發(fā)明，對(duì)于本文所述的核酸或氨基酸序列，術(shù)語(yǔ)“相鄰的”或“連續(xù)的”是指在不中斷的序列中相連。例如，對(duì)于第一個(gè)序列包含第二個(gè)序列的30個(gè)相鄰(或連續(xù))的氨基酸，是指第一個(gè)序列包含與第二個(gè)序列中30個(gè)氨基酸殘基的不中斷序列具有100％相同性的30個(gè)氨基酸殘基的不中斷序列。同樣，對(duì)于第一個(gè)序列與第二個(gè)序列具有“100％相同性(identity)”是指第一個(gè)序列與第二個(gè)序列在核苷酸或氨基酸之間無(wú)間隔的完全匹配。
在另一實(shí)施方案中，包括胡蘿卜素合酶同源物的胡蘿卜素合酶包括具有這樣的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，該氨基酸序列與天然胡蘿卜素合酶的氨基酸序列足夠相似以致于編碼該同源物的核酸序列在中度，高度或極高嚴(yán)格條件(在下文描述)下與編碼天然胡蘿卜素合酶的核酸分子(即，與編碼天然胡蘿卜素合酶氨基酸序列的核酸鏈的互補(bǔ)鏈)能夠雜交。優(yōu)選的是，胡蘿卜素合酶的同源物由這樣的核酸分子編碼，該核酸分子包含在中度，高度或極高嚴(yán)格條件下與編碼包含SEQ ID NO3，SEQ ID NO5，SEQ ID NO7或SEQ ID NO9的蛋白質(zhì)的核酸序列的互補(bǔ)鏈雜交的核酸序列。甚至更優(yōu)選的是，胡蘿卜素合酶的同源物由這樣的核酸分子編碼，該核酸分子包含在中度，高度或極高嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ IDNO4，SEQ ID NO6或SEQ ID NO8所示的核酸序列的互補(bǔ)鏈雜交的核酸序列。
編碼本發(fā)明的胡蘿卜素合酶的核酸序列的核酸序列互補(bǔ)鏈?zhǔn)侵概c編碼胡蘿卜素合酶的鏈互補(bǔ)的核酸鏈的核酸序列。可預(yù)料到編碼給定氨基酸序列的雙鏈DNA包含單鏈DNA及其具有與該單鏈DNA互補(bǔ)的序列的互補(bǔ)鏈。因此，本發(fā)明的核酸分子可以是雙鏈或單鏈的，且包括在嚴(yán)格雜交條件下與編碼SEQ ID NO3的氨基酸序列的核酸序列，和/或與編碼SEQ IDNO3的氨基酸序列的核酸序列的互補(bǔ)序列形成穩(wěn)定雜交體的那些核酸分子。推定互補(bǔ)序列的方法是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的。應(yīng)注意由于核酸測(cè)序技術(shù)不是完全無(wú)差錯(cuò)的，因此本文提供的序列最多代表本發(fā)明的胡蘿卜素合酶表觀(guān)序列。
本文使用時(shí)，提及的雜交條件是指使用核酸分子鑒定相似核酸分子的標(biāo)準(zhǔn)雜交條件。該標(biāo)準(zhǔn)條件在例如，Sambrook等，Molecular CloningALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Labs Press，1989中公開(kāi)。Sambrook等，出處同上，在此以其整體引用以供參考(特別是參見(jiàn)，第9.31-9.62頁(yè))。另外，計(jì)算完成允許不同程度的核苷酸錯(cuò)配的雜交的合適的雜交和洗滌條件的公式在例如，Meinkoth等，1984，Anal.Biochem.138，267-284中公開(kāi)；Meinkoth等，出處同上，在本文中以其整體引用以供參考。
更具體地說(shuō)，本文提及的中等嚴(yán)格雜交和洗滌條件是指允許分離這樣的核酸分子的條件，即該核酸分子與在雜交反應(yīng)中用于探測(cè)的核酸分子具有至少大約70％的核酸序列相同性(即，允許大約30％或更少的核苷酸錯(cuò)配的條件)。本文提及的高度嚴(yán)格雜交和洗滌條件是指允許分離這樣的核酸分子的條件，即該核酸分子與在雜交反應(yīng)中用于探測(cè)的核酸分子具有至少大約80％的核酸序列相同性(即，允許大約20％或更少的核苷酸錯(cuò)配的條件)。本文提及的極高嚴(yán)格雜交和洗滌條件是指允許分離這樣的核酸分子的條件，即該核酸分子與在雜交反應(yīng)中用于探測(cè)的核酸分子具有至少大約90％的核酸序列相同性(即，允許大約10％或更少的核苷酸錯(cuò)配的條件)。如上所述，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可使用Meinkoth等，出處同上，中的公式計(jì)算達(dá)到這些具體核苷酸錯(cuò)配水平的合適的雜交和洗滌條件。該條件依賴(lài)于形成的是DNA∶RNA還是DNA∶DNA雜交體而變化。計(jì)算的DNA∶DNA雜交體的解鏈溫度比DNA∶RNA雜交體低10℃。在具體實(shí)施方案中，DNA∶DNA雜交體的嚴(yán)格雜交條件包括在離子強(qiáng)度為6X SSC(0.9M Na+)，溫度在大約20℃和大約35℃之間(低度嚴(yán)格)，更優(yōu)選的是，在大約28℃至大約40℃之間(更嚴(yán)格)，且甚至更優(yōu)選的是，在大約35℃至大約45℃之間(甚至更嚴(yán)格)，以合適的洗滌條件進(jìn)行的雜交。在具體實(shí)施方案中，DNA∶RNA雜交體的嚴(yán)格雜交條件包括在離子強(qiáng)度為6X SSC(0.9M Na+)，溫度在大約30℃和大約45℃之間，更優(yōu)選的是，在大約38℃至大約50℃之間，且甚至更優(yōu)選的是，在大約45℃至大約55℃之間，以相似的嚴(yán)格洗滌條件進(jìn)行的雜交。這些值以計(jì)算分子大于大約100個(gè)核苷酸，0％的甲酰胺且G+C含量為大約40％時(shí)的解鏈溫度為基礎(chǔ)。作為選擇，Tm可按Sambrook等，出處同上，第9.31至9.62頁(yè)所述憑經(jīng)驗(yàn)計(jì)算。一般來(lái)說(shuō)，洗滌條件應(yīng)當(dāng)盡可能?chē)?yán)格，且應(yīng)當(dāng)適合于選定的雜交條件。例如，雜交條件可包括鹽與在計(jì)算的具體雜交體的Tm之下大約20-25℃的溫度條件的結(jié)合，且洗滌條件一般包括鹽與在計(jì)算的具體雜交體的Tm之下大約12-20℃的溫度條件的結(jié)合。適用于DNA∶DNA雜交體的一個(gè)雜交條件的例子包括在大約42℃下在6XSSC(50％甲酰胺)中雜交2-24小時(shí)，接著是包括在大約2X SSC中室溫下洗滌一次或多次的洗滌步驟，接著在更高溫度和更低離子強(qiáng)度下再洗滌(例如，在大約37℃下在大約0.1X-0.5X SSC中洗滌至少一次，接著在大約68℃下在大約0.1X-0.5X SSC中洗滌至少一次)。
胡蘿卜素合酶還包括基因融合體(例如，用于過(guò)量表達(dá)重組蛋白的可溶性，活性形式)的，誘變基因(例如，具有增強(qiáng)基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的密碼子修飾的基因)的，和截短基因(例如，為產(chǎn)生膜蛋白的可溶性形式而去掉了膜結(jié)合區(qū)的基因，或去掉了在特定重組宿主中耐受性差的信號(hào)序列的基因)的表達(dá)產(chǎn)物。應(yīng)注意本發(fā)明的胡蘿卜素合酶和蛋白質(zhì)同源物包括沒(méi)有胡蘿卜素合酶活性的蛋白質(zhì)。該蛋白質(zhì)可用于例如，產(chǎn)生抗體，或者用于產(chǎn)生缺乏產(chǎn)生一種或多種類(lèi)胡蘿卜素的能力的遺傳修飾的生物體。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)和/或同源物的最小大小是足以具有胡蘿卜素合酶生物學(xué)活性的大小，或者當(dāng)該蛋白質(zhì)不需具有該酶活性時(shí)，是指足以用于與本發(fā)明的胡蘿卜素合酶相關(guān)的另一目的的大小，例如用于產(chǎn)生結(jié)合天然存在的胡蘿卜素合酶的抗體。因此，本發(fā)明的胡蘿卜素合酶或同源物的最小大小是指適合于形成可被抗體識(shí)別的至少一個(gè)表位的大小，且一般至少8個(gè)氨基酸長(zhǎng)，且優(yōu)選10個(gè)，且更優(yōu)選15個(gè)，且更優(yōu)選20個(gè)，且更優(yōu)選25個(gè)，且甚至更優(yōu)選30個(gè)氨基酸長(zhǎng)，且以從1到1268的任一整數(shù)增加至達(dá)到1268個(gè)氨基酸長(zhǎng)，優(yōu)選的大小依賴(lài)于是需要該蛋白質(zhì)的全長(zhǎng)，多價(jià)(即，具有一個(gè)以上結(jié)構(gòu)域的融合蛋白，每個(gè)結(jié)構(gòu)域具有一種功能)，還是需要該蛋白質(zhì)的功能部分。除了實(shí)用性限制外，對(duì)于該蛋白質(zhì)的最大大小沒(méi)有限制，該蛋白質(zhì)可包含胡蘿卜素合酶(包括胡蘿卜素合酶同源物)的一部分或全長(zhǎng)胡蘿卜素合酶。
同樣，本發(fā)明的核酸分子的最小大小是指足以編碼具有胡蘿卜素合酶活性的蛋白質(zhì)，足以編碼包含與抗體結(jié)合的至少一個(gè)表位的蛋白質(zhì)，或足以形成能夠與編碼天然胡蘿卜素合酶的核酸分子的互補(bǔ)序列形成穩(wěn)定雜交體(例如，在低度，中等或高度嚴(yán)格條件下)的探針或寡核苷酸引物的大小。因此，編碼該蛋白質(zhì)的核酸分子的大小可依賴(lài)于核酸組成，該核酸分子與互補(bǔ)序列之間的同源性或相同性百分?jǐn)?shù)以及雜交條件本身(例如，溫度，鹽濃度，和甲酰胺濃度)。用作寡核苷酸引物或作為探針的核酸分子的最小大小一般是如果該核酸分子富含GC則為至少大約12至大約15個(gè)核苷酸長(zhǎng)且如果它們富含AT則為至少大約15至大約18個(gè)堿基長(zhǎng)。除了實(shí)用性限制外，對(duì)于本發(fā)明的核酸分子的最大大小沒(méi)有限制，該核酸分子可包含胡蘿卜素合酶編碼序列的一部分，編碼全長(zhǎng)胡蘿卜素合酶的核酸序列(包括胡蘿卜素合酶基因)，或多基因，或其部分。
本發(fā)明還包括融合蛋白，該融合蛋白包含與一個(gè)或多個(gè)融合片段連接的含有胡蘿卜素合酶的結(jié)構(gòu)域(包括胡蘿卜素合酶的同源物或功能結(jié)構(gòu)域)。用于本發(fā)明的合適的融合片段包括，但不限于，可增強(qiáng)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性，提供其它需要的生物學(xué)活性(例如，細(xì)胞因子或者與類(lèi)胡蘿卜素生物合成相關(guān)的另一活性)；和/或幫助純化胡蘿卜素合酶(例如，通過(guò)親和色譜法)的片段。合適的融合片段可以是具有所需功能(例如，賦予增強(qiáng)的穩(wěn)定性，可溶性，作用或生物學(xué)活性；和/或簡(jiǎn)化蛋白質(zhì)的純化)的任意大小的結(jié)構(gòu)域。融合片段可連接到該蛋白質(zhì)含有胡蘿卜素合酶的結(jié)構(gòu)域的氨基和/或羧基末端且容易裂解以便能夠直接回收胡蘿卜素合酶。融合蛋白優(yōu)選通過(guò)培養(yǎng)用融合核酸分子轉(zhuǎn)化的重組細(xì)胞產(chǎn)生，該融合核酸分子編碼包含連接到含有胡蘿卜素合酶的結(jié)構(gòu)域的羧基和/或氨基末端的融合片段的蛋白質(zhì)。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本文所述的任一氨基酸序列可在該特定氨基酸序列的C-和/或N-末端的側(cè)翼分別含有從至少一個(gè)，到多達(dá)20個(gè)添加的異源性氨基酸來(lái)產(chǎn)生。所得的蛋白質(zhì)或多肽可稱(chēng)為“基本上由該特定氨基酸序列組成”。根據(jù)本發(fā)明，該異源性氨基酸是這樣的氨基酸序列，即該氨基酸序列在天然狀態(tài)下在特定氨基酸序列側(cè)翼未發(fā)現(xiàn)(即，在體內(nèi)在天然情況下未發(fā)現(xiàn))，或者與特定氨基酸序列的功能不相關(guān)，或者如果使用產(chǎn)生該給定氨基酸序列的生物體的標(biāo)準(zhǔn)密碼子用法來(lái)翻譯天然存在的序列中的該核苷酸的話(huà)，它在該基因中出現(xiàn)時(shí)，不是由編碼特定氨基酸序列的天然存在的核酸序列側(cè)翼的核苷酸編碼。同樣，提及核酸序列時(shí)，本文使用的術(shù)語(yǔ)“基本上由其組成”是指在編碼特定氨基酸序列的核酸序列5’和/或3’端側(cè)翼可分別具有從至少一個(gè)，到多至60個(gè)添加的異源性核苷酸的編碼特定氨基酸序列的核酸序列。該異源性核苷酸在天然基因中出現(xiàn)時(shí)，不是在編碼特定氨基酸序列的核酸序列側(cè)翼天然發(fā)現(xiàn)的(即，體內(nèi)天然未發(fā)現(xiàn)的)或者不編碼賦予該蛋白質(zhì)任何其它的功能或改變具有特定氨基酸序列的蛋白質(zhì)的功能的蛋白質(zhì)。
胡蘿卜素合酶可從包括Thraustochytriales目的成員的各種微生物中分離。例如，獲得本發(fā)明的胡蘿卜素合酶的優(yōu)選的微生物包括來(lái)自這樣一個(gè)屬的微生物，該屬包括，但不限于破囊壺菌屬(Thraustochytrium)，Labyrinthuloides，Japonochytrium，和Schizochytrium。這些屬中優(yōu)選的種包括，但不限于任何Schizochytrium種，包括Schizochytrium aggregatum，Schizochytrium limacinum，Schizochytrium minutum；任何破囊壺菌屬的種(包括以前的Ulkenia種，例如U.Visurgensis，U.amoeboida，U.sarkariana，U.Profunda，U.radiata，U.minuta和Ulkenia sp.BP-5601)，且包括Thraustochytrium striatum，Thraustochytrium aureum，Thraustochytriumroseum；和任何Japonochytrium種。特別優(yōu)選的Thraustochytriales菌株包括，但不限于Schizochytrium sp.(S31)(ATCC 20888)；Schizochytriumsp.(S8)(ATCC 20889)；Schizochytrium sp.(LC-RM)(ATCC 18915)；Schizochytrium sp.(SR21)；Schizochytrium aggregatum(Goldstein etBelsky)(ATCC 28209)；Schizochytrium limacinum(Honda et Yokochi)(IFO32693)；破囊壺菌屬菌種(23B)(ATCC 20891)；Thraustochytriumstriatum(Schneider)(ATCC 24473)；Thraustochytrium aureum(Goldstein)(ATCC34304)；Thraustochytrium roseum(Goldstein)(ATCC 28210)；和Japonochytriumsp.(L1)(ATCC 28207)。
開(kāi)發(fā)導(dǎo)致了對(duì)Thraustochytrids分類(lèi)學(xué)的修正。分類(lèi)學(xué)理論工作者將Thraustochytrids與藻類(lèi)或藻狀原生生物放在一起。然而，由于分類(lèi)學(xué)的不確定性，為了本發(fā)明的目的最好將本發(fā)明所述的菌株當(dāng)作Thraustochytrids(目Thraustochytriales；科破囊壺菌科；屬破囊壺菌屬，Schizochytrium，Labyrinthuloides，或Japonochytrium)。對(duì)于本發(fā)明，認(rèn)為labrinthulids的成員包括在Thraustochytrids中。分類(lèi)學(xué)變化在下文中概述。本文公開(kāi)的某些單細(xì)胞微生物的菌株是Thraustochytriales目(也稱(chēng)為T(mén)hraustochytrids)的成員。Thraustochytrids是分類(lèi)史上進(jìn)化的海洋真核生物。Thraustochytrids的分類(lèi)學(xué)地位問(wèn)題由Moss(1986)，Bahnweb和Jackle(1986)以及Chamberlain和Moss(1988)進(jìn)行了綜述。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)“Thraustochytrid”，“Thraustochytriales微生物”和“Thraustochytriales目的微生物”可交換使用。
為了方便，分類(lèi)學(xué)家首先將Thraustochytrids與藻狀菌綱(Phycomycetes)(藻狀真菌)中的其它無(wú)色游動(dòng)孢子真核生物放在一起。然而，藻狀菌綱的名稱(chēng)最后在分類(lèi)學(xué)上的地位下降了，且將Thraustochytrids保留在卵菌綱(雙鞭毛游動(dòng)孢子真菌)中。起初假定卵菌綱與異鞭毛藻類(lèi)相關(guān)，且由Barr(Barr，1981，Biosystems 14359-370)總結(jié)的廣泛的超微結(jié)構(gòu)和生化研究最終支持了該假定。卵菌綱事實(shí)上被Leedale(Leedale，1974，Taxon 23261-270)和其它藻類(lèi)學(xué)家作為異鞭毛藻類(lèi)部分所接受。然而，由于其異樣特性帶來(lái)的便利性，卵菌綱和Thraustochytrids由真菌學(xué)家(研究真菌的科學(xué)家)而不是藻類(lèi)學(xué)家(研究藻類(lèi)的科學(xué)家)進(jìn)行了大量的研究。
從另一分類(lèi)學(xué)角度，進(jìn)化生物學(xué)家對(duì)于真核生物如何進(jìn)化形成了兩個(gè)總的思想學(xué)派。一種理論提出有膜邊界的細(xì)胞器通過(guò)一系列內(nèi)共生的外源性起源(Margulis，1970，Origin of Eukaryotic Cells.Yale University Press，NewHaven)；例如，線(xiàn)粒體起源于細(xì)菌性細(xì)胞內(nèi)共生生物，葉綠體起源于藍(lán)藻，鞭毛起源于螺旋體。另一理論認(rèn)為有膜邊界的細(xì)胞器從原核生物祖先的無(wú)膜邊界系統(tǒng)通過(guò)自生過(guò)程逐漸進(jìn)化(Cavalier-Smith，1975，Nature(Lond.)256462-468)。然而，兩組進(jìn)化生物學(xué)家都從真菌中去掉了卵菌綱和Thraustochytrids并將它們與chromophyte藻類(lèi)一起放在Chromophyta界中(Cavalier-Smith，1981，BioSystems 14461-481)(這一個(gè)界最近擴(kuò)展到包含其它原生生物且該界中的成員現(xiàn)在稱(chēng)為Stramenopiles)或者與所有藻類(lèi)一起放在Protoctista界中(Margulis和Sagen，1985，Biosystems 18141-147)。
隨著電子顯微鏡學(xué)的發(fā)展，對(duì)Thraustochytrids的兩個(gè)屬，即破囊壺菌屬和Schizochytrium的游動(dòng)孢子超微結(jié)構(gòu)的研究(Perkins，1976，第279-312頁(yè)，見(jiàn)“Recent Advances in Aquatic Mycology”(ed.E.B.G Jones)，John Wiley& Sons，New York；Kazama，1980，Can.J.Bot.582434-2446；Barr，1981，Biosystems 14359-370)提供了破囊壺菌科僅與卵菌綱具有較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系的有力證據(jù)。另外，代表5S核糖體RNA序列對(duì)應(yīng)分析的遺傳數(shù)據(jù)(多元統(tǒng)計(jì)形式)表明Thraustochytriales明顯是一個(gè)獨(dú)特的真核生物群體，完全獨(dú)立于真菌，且與紅和褐藻，和與卵菌綱的成員具有最近的親緣關(guān)系(Mannella，等，1987，Mol.Evol.24228-235)。大多數(shù)分類(lèi)學(xué)家同意從卵菌綱去掉Thraustochytrids(Bartnicki-Garcia，1987，第389-403頁(yè)，見(jiàn)“EvolutionaryBiology of the Fungi”(eds.Rayner，A.D.M.，Brasier，C.M.& Moore，D.)，Cambridge University Press，Cambridge)。
總之，采用Cavalier-Smith的分類(lèi)系統(tǒng)(Cavalier-Smith，1981，BioSystems14461-481，1983；Cavalier-Smith，1993，Microbiol Rev.57953-994)，將Thraustochytrids與chromophyte藻類(lèi)一起分類(lèi)進(jìn)Chromophyta(Stramenopiles)界中。該分類(lèi)學(xué)位置最近由Cavalier-Smith等使用Heterokonta的18s rRNA標(biāo)記證實(shí)Thraustochytrids是chromists而不是真菌再次得到確認(rèn)(Cavalier-Smith等，1994，Phil.Tran.Roy.Soc.London Series BioSciences 346387-397)。這樣將它們放在與真菌完全不同的界中，即都放在Eufungi界中。因此Tluaustochytrids的分類(lèi)學(xué)地位總結(jié)如下界Chromophyta(Stramenopiles)門(mén)Heterokonta目Thraustochytriales科破囊壺菌科屬破囊壺菌屬，Schizochytrium，Labyrinthuloides，或Japonochytrium。
一些早期的分類(lèi)學(xué)家將破囊壺菌屬的一些原始成員(具有變形蟲(chóng)狀生活期的成員)分進(jìn)一個(gè)稱(chēng)為Ulkenia的獨(dú)立屬中。然而，現(xiàn)在知道如果不是全部的話(huà)，大多數(shù)的Thraustochytrids(包括破囊壺菌屬和Schizochytrium)表現(xiàn)出變形蟲(chóng)狀生活期，因此，一些人認(rèn)為Ulkenia不是一個(gè)正確的屬。本文所用的破囊壺菌屬將包括Ulkenia。
盡管在門(mén)和界的高級(jí)分類(lèi)中的分類(lèi)學(xué)地位不確定，但是Thraustochytrids仍然是一個(gè)與眾不同的和有特色的群體，其成員仍然可分進(jìn)Thraustochytriales目中。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案包括編碼胡蘿卜素合酶的核酸分子。本發(fā)明的分離的核酸分子包括含有這樣核酸序列的核酸分子，即該核酸序列編碼任一分離的胡蘿卜素合酶，包括上述的胡蘿卜素合酶同源物或片段。
在一個(gè)實(shí)施方案中，該核酸分子包含在中等嚴(yán)格條件，且甚至更優(yōu)選在高度嚴(yán)格條件，且甚至更優(yōu)選在極高嚴(yán)格條件下與編碼天然存在的胡蘿卜素合酶的核酸序列(即，包括編碼胡蘿卜素合酶的天然存在的等位基因變異體)的互補(bǔ)鏈雜交的分離的核酸分子。優(yōu)選的是，編碼本發(fā)明的胡蘿卜素合酶的分離的核酸分子包含在中等，高度，或極高嚴(yán)格條件下與編碼含有SEQ ID NO3，SEQ ID NO5，SEQ ID NO7或SEQ ID NO9所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的核酸序列的互補(bǔ)鏈雜交的核酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，分離的核酸分子包含在中等，高度，或極高嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，SEQ ID NO6或SEQ ID NO8所示的核酸序列的互補(bǔ)鏈雜交的核酸序列。該條件在上文中進(jìn)行了詳細(xì)描述。
根據(jù)本發(fā)明，分離的核酸分子是從其天然環(huán)境中分離的核酸分子(即，進(jìn)行了人工操作)且可包括DNA，RNA，或者DNA或RNA的衍生物，包括cDNA。因此，“分離的”并不反映該核酸分子被純化的程度。本發(fā)明的分離的胡蘿卜素合酶核酸分子可從其天然來(lái)源分離或者使用重組DNA技術(shù)(例如，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增，克隆)或化學(xué)合成產(chǎn)生。分離的胡蘿卜素合酶核酸分子可包括例如，胡蘿卜素合酶基因，胡蘿卜素合酶基因的天然等位基因變異體，胡蘿卜素合酶編碼區(qū)或其部分，和以修飾基本上不干擾核酸分子編碼本發(fā)明的胡蘿卜素合酶蛋白的能力或者在嚴(yán)格條件下與天然基因分離物形成穩(wěn)定雜交體的方式通過(guò)核苷酸插入，缺失，取代，和/或倒位修飾的胡蘿卜素合酶編碼和/或調(diào)控區(qū)。分離的胡蘿卜素合酶核酸分子可包括簡(jiǎn)并序列。本文使用的核苷酸簡(jiǎn)并性是指一個(gè)氨基酸可被不同核苷酸密碼子編碼的的現(xiàn)象。因此，編碼本發(fā)明的胡蘿卜素合酶蛋白質(zhì)的核酸分子的核酸序列可由于簡(jiǎn)并性而變化。應(yīng)注意本發(fā)明的分離的胡蘿卜素合酶的核酸分子不需編碼具有胡蘿卜素合酶活性的蛋白質(zhì)。胡蘿卜素合酶核酸分子可編碼例如，截短的，突變的或無(wú)活性的蛋白質(zhì)。該核酸分子和由該核酸分子編碼的蛋白質(zhì)可用作探針和引物用于鑒定其它胡蘿卜素合酶。
根據(jù)本發(fā)明，提及的胡蘿卜素合酶基因包括與天然(即，野生型)胡蘿卜素合酶基因相關(guān)的所有核酸序列，例如調(diào)控由該基因編碼的胡蘿卜素合酶的產(chǎn)生的調(diào)控區(qū)(例如，但不限于，轉(zhuǎn)錄，翻譯或翻譯后調(diào)控區(qū))以及編碼區(qū)本身。在另一實(shí)施方案中，胡蘿卜素合酶基因可以是天然存在的等位基因變異體，包括與編碼給定胡蘿卜素合酶的核酸序列相似但不相同的序列。等位基因變異體已經(jīng)在上文中描述。當(dāng)核酸分子包含上述基因時(shí)，術(shù)語(yǔ)“核酸分子”和“基因”可交換使用。
使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的許多方法(參見(jiàn)，例如，Sambrook等)可產(chǎn)生胡蘿卜素合酶核酸分子同源物(即，編碼胡蘿卜素合酶同源物)。例如，核酸分子可使用各種技術(shù)進(jìn)行修飾，該技術(shù)包括，但不限于，通過(guò)傳統(tǒng)誘變和重組DNA技術(shù)(例如，定點(diǎn)誘變，化學(xué)處理，限制性酶裂解，連接核酸片段和/或PCR擴(kuò)增)，或者合成寡核苷酸混合物并連接混合物組以“構(gòu)建”核酸分子的混合物及其組合。修飾編碼胡蘿卜素合酶的重組核酸分子的另一方法是基因改組(即，分子育種)(參見(jiàn)，例如，Stemmer的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,605,793；Minshull和Stemmer，1999，Curr.Opin.Chem.Biol.3284-290；Stemmer，1994，P.N.A.S.USA 9110747-10751，所有這些文獻(xiàn)在本文中以其整體引用以供參考)。該技術(shù)可用于在胡蘿卜素合酶作用中有效導(dǎo)入多個(gè)同時(shí)發(fā)生的改變。核酸分子同源物可通過(guò)與胡蘿卜素合酶基因雜交或者通過(guò)篩選核酸分子編碼的蛋白質(zhì)的功能(即，酶活性)來(lái)選擇。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及一個(gè)寡核苷酸，它含有選自SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，和與其完全互補(bǔ)的核酸序列中的核酸序列的至少12個(gè)連續(xù)的核苷酸。用作寡核苷酸引物或作為探針的核酸分子的最小大小一般是如果該核酸分子富含GC則為至少大約12至大約15個(gè)核苷酸長(zhǎng)且如果它們富含AT則為至少大約15至大約18個(gè)堿基長(zhǎng)。除了實(shí)用性限制外，對(duì)于本發(fā)明的寡核苷酸探針或引物的最大大小沒(méi)有限制，該探針或引物可包含適用于該目的用途的本發(fā)明的胡蘿卜素合酶基因的任一部分，且探針一般比引物更大。因此，本發(fā)明的寡核苷酸可包括以所有整數(shù)(例如，12，13，14，15，16……3799，3800)的在大約12和大約3800個(gè)核苷酸之間的任何長(zhǎng)度的片段或者甚至更大的探針。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案包括一個(gè)重組核酸分子，它包含插入適合于克隆，測(cè)序，和/或操作該核酸分子，例如表達(dá)和/或?qū)⒃摵怂岱肿觽鬟f進(jìn)宿主細(xì)胞以形成重組細(xì)胞的任何核酸載體(例如，重組載體)中的本發(fā)明的至少一個(gè)分離的核酸分子。該載體含有異源性核酸序列，即核酸序列不是天然發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明的核酸分子相鄰的，盡管該載體也可含有天然發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明的核酸分子相鄰的調(diào)控核酸序列(例如，啟動(dòng)子，非翻譯區(qū))(下文詳細(xì)討論)。該載體可以是RNA或DNA，是原核的或者真核的，且一般是病毒或質(zhì)粒。該載體可作為染色體外元件(例如，質(zhì)粒)維持或者可整合進(jìn)染色體中。完整載體可在宿主細(xì)胞內(nèi)的適當(dāng)位置維持，或者在某些情況下，質(zhì)粒DNA可能缺失，留下本發(fā)明的核酸分子。整合的核酸分子可在染色體啟動(dòng)子控制下，在本身或質(zhì)粒啟動(dòng)子控制下，或者在一些啟動(dòng)子的組合控制下。單個(gè)或多個(gè)拷貝的核酸分子可整合進(jìn)染色體中。載體可設(shè)計(jì)成在宿主細(xì)胞中進(jìn)行組織特異性表達(dá)，例如通過(guò)使用組織特異性啟動(dòng)子。用于本發(fā)明的一些重組核酸分子，包括一些重組載體，在實(shí)施例中有詳細(xì)描述。
一般來(lái)說(shuō)，重組分子包含與一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列(例如，啟動(dòng)子，操縱子，阻遏物，增強(qiáng)子，終止子)可操作地相連的本發(fā)明的核酸分子。本文使用的術(shù)語(yǔ)“重組分子”或“重組核酸分子”主要是指與轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列可操作地相連的核酸分子或核酸序列，但是當(dāng)核酸分子是本文所述的重組分子時(shí)，與術(shù)語(yǔ)“核酸分子”可交換使用。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)“可操作地相連”是指以該分子轉(zhuǎn)化(即，轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)導(dǎo)，轉(zhuǎn)染，或接合)進(jìn)宿主細(xì)胞時(shí)能夠表達(dá)的方式連接核酸分子與轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列是控制轉(zhuǎn)錄開(kāi)始，延長(zhǎng)，或終止的序列。特別重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列是控制轉(zhuǎn)錄開(kāi)始的那些序列，例如啟動(dòng)子，增強(qiáng)子，操縱子和阻遏物序列。合適的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列包括在用于表達(dá)本發(fā)明的胡蘿卜素合酶的至少一種重組細(xì)胞中起作用的任何轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。各種轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的。優(yōu)選的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列包括在Thraustochytriales微生物，細(xì)菌，真菌(例如，酵母)，或植物細(xì)胞中起作用的那些序列。用于植物的特別優(yōu)選的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列是在特異性組織(例如，葉，莖，根，花，種子)中啟動(dòng)基因表達(dá)的那些序列且本文稱(chēng)為組織特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。該序列是本領(lǐng)域熟知的。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，合適的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列包括在本發(fā)明的胡蘿卜素合酶基因中天然發(fā)現(xiàn)的調(diào)控序列。例如，包括胡蘿卜素合酶啟動(dòng)子的Schizochytrium胡蘿卜素合酶的調(diào)控序列見(jiàn)SEQ ID NO1的核苷酸1-1405或SEQ ID NO1的核苷酸346-1405。
本發(fā)明的重組分子可以是DNA或RNA，也可含有其它調(diào)控序列，例如轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，翻譯調(diào)控序列，復(fù)制起點(diǎn)，和與重組細(xì)胞相容的其它調(diào)控序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組分子，包括整合進(jìn)宿主細(xì)胞染色體中的那些重組分子，還含有使得表達(dá)的胡蘿卜素合酶能夠從產(chǎn)生該蛋白的細(xì)胞分泌出去或者靶向特定細(xì)胞器或膜的信號(hào)(靶向)(即，信號(hào)片段核酸序列)。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，合適的信號(hào)片段包括與本發(fā)明的胡蘿卜素合酶天然相連的信號(hào)片段(例如，SEQ ID NO3的氨基酸1-29)或者能夠指導(dǎo)根據(jù)本發(fā)明的胡蘿卜素合酶分泌的任何異源性信號(hào)片段。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組分子包含使得表達(dá)的胡蘿卜素合酶能夠傳遞到并插入進(jìn)宿主細(xì)胞膜中的信號(hào)序列。合適的信號(hào)序列包括與本發(fā)明的胡蘿卜素合酶天然相連的信號(hào)序列，或者能夠指導(dǎo)胡蘿卜素合酶?jìng)鬟f并插入進(jìn)細(xì)胞膜的任何異源性信號(hào)序列。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組分子包含將胡蘿卜素合酶特異性靶向傳遞到特定亞細(xì)胞器或區(qū)室，例如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，葉綠體，色質(zhì)體，其它質(zhì)體，或細(xì)胞質(zhì)的信號(hào)序列。
本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)重組分子可用于產(chǎn)生本發(fā)明的編碼產(chǎn)物(例如，胡蘿卜素合酶)。在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼產(chǎn)物可通過(guò)在有效產(chǎn)生該蛋白的條件下表達(dá)本文所述的核酸分子來(lái)產(chǎn)生。產(chǎn)生編碼的蛋白質(zhì)的優(yōu)選方法是通過(guò)用一個(gè)或多個(gè)重組分子轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞以形成重組細(xì)胞。用于轉(zhuǎn)化的合適的宿主細(xì)胞包括，但不限于，任何顯微藻類(lèi)細(xì)胞，包括Thraustochytriales微生物，或任何細(xì)菌細(xì)胞，真菌(例如，酵母)細(xì)胞，其它微生物細(xì)胞，或可被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或者已經(jīng)用至少一個(gè)核酸分子轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
用于本發(fā)明的優(yōu)選的宿主細(xì)胞包括適合于表達(dá)本發(fā)明的胡蘿卜素合酶的任何微生物細(xì)胞或植物細(xì)胞，包括，但不限于(1)植物，包括，但不限于，莊稼植物(例如，canola-Brassica napus，水稻，玉米，亞麻，紅花，大豆，向日葵，油菜籽，亞麻籽)，番茄，和胡蘿卜；(2)真菌，包括，但不限于，須霉屬(Phycomyces)，鏈孢霉屬(Neurospora)，白霉屬(Mucor)，布拉霉屬(Blakeslea)，和酵母(例如，啤酒糖酵母，Phaffia rhodozyma，Xanthophyllomyces dendrohous，產(chǎn)朊假絲酵母(Candida utilus))；(3)藻類(lèi)，包括但不限于，綠藻(例如，Haematococcus pluvialus，Chlorococcum，Spongiococcum，Neospongiococcum，Dunaliella)；(4)細(xì)菌，包括，但不限于，藍(lán)細(xì)菌(例如，螺旋藻屬(Spirulina)，聚球藍(lán)細(xì)菌屬(synechococcus)，集胞藍(lán)細(xì)菌屬(Synechocystis))，大腸桿菌，黃桿菌屬Flavobacterium)，副球菌屬(Paracoccus)，歐文氏菌屬(Erwinia)，土壤桿菌屬(Agrobacterium)，紅球菌屬(Rhodococcus)；和(5)Thraustochytriales目的成員，包括但不限于，破囊壺菌屬種類(lèi)(例如，包括以前的Ulkenia種類(lèi)，例如U.visurgensis，U.amoeboida，U.sarkariana，U.profunda，U.radiata，U.minuta和Ulkenia sp.BP-5601，且包括Thraustochytrium striatum，Thraustochytrium aureum，和Thraustochytrium roseum)；Labyrinthuloides，Japonochytrium(例如，Japonochytrium sp.)，和Schizochytrium(例如，Schizochytrium sp.，Schizochytrium aggregatum，Schizochytrium limacinum，Schizochytriumminutum)。
根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化的”或“轉(zhuǎn)化”用于指將外源性核酸分子(即，重組核酸分子)插入細(xì)胞的任何方法。在微生物系統(tǒng)中，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化”用于描述由于微生物獲得外源性核酸的遺傳改變且與術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)染”基本上同義，“轉(zhuǎn)染”更常用于涉及動(dòng)物細(xì)胞的相似方法。術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化”在本文中優(yōu)選用于指將核酸分子導(dǎo)入微生物細(xì)胞，例如細(xì)菌和酵母，或者導(dǎo)入植物細(xì)胞。因此，轉(zhuǎn)化技術(shù)包括，但不限于，轉(zhuǎn)染，電穿孔，顯微注射，脂轉(zhuǎn)染，生物彈(biolistic)方法(粒子轟擊)，吸附，土壤桿菌屬-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，感染和原生質(zhì)體融合。轉(zhuǎn)化原核和真核宿主細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域熟知的。參見(jiàn)，例如，Maniatis等，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY(1982)，Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold SpringHarbor，NY(1989)，本文以其整體引用以供參考。轉(zhuǎn)化Thraustochytriales目成員的優(yōu)選方法在2002年4月16日申請(qǐng)的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)流水號(hào)10/124,807中描述，以其整體引用以供參考。
已經(jīng)形成了許多用于植物轉(zhuǎn)化的方法，包括生物學(xué)和物理轉(zhuǎn)化方法。參見(jiàn)，例如，Miki等，“將外源DNA導(dǎo)入植物的方法”，見(jiàn)Methods in PlantMolecular Biology and Biotechnology，Glick，B.R.和Thompson，J.E.Eds.(CRCPress，Inc.，Boca Raton，1993)，第67-88頁(yè)。另外，用于植物細(xì)胞的載體和體外培養(yǎng)方法或組織轉(zhuǎn)化和植物再生是可獲得的。參見(jiàn)，例如，Gruber等，“植物轉(zhuǎn)化的載體”，見(jiàn)Methods in Plant Molecular Biology andBiotechnology，Glick，B.R.和Thompson，J.E.Eds.(CRC Press，Inc.，Boca Raton，1993)第89-119頁(yè)。
用于將表達(dá)載體導(dǎo)入植物的最廣泛使用的方法以土壤桿菌屬的自然轉(zhuǎn)化系統(tǒng)為基礎(chǔ)。參見(jiàn)，例如，Horsch等，Science 2271229(1985)。根癌土壤桿菌和發(fā)根土壤桿菌是可遺傳轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的植物病原性土壤細(xì)菌。根癌土壤桿菌和發(fā)根土壤桿菌的Ti和Ri質(zhì)粒分別攜帶負(fù)責(zé)植物遺傳轉(zhuǎn)化的基因。參見(jiàn)，例如，Kado，C.I.，Crit.Rev.Plant.Sci.101(1991)。對(duì)土壤桿菌屬載體系統(tǒng)和土壤桿菌屬-介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移方法的描述在許多文獻(xiàn)中提供，包括Gruber等，出處同上，Miki等，出處同上，Moloney等，Plant Cell Reports8238(1989)，和美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,940,838和5,464,763，本文分別以其整體引用以供參考。
植物轉(zhuǎn)化的一般適用方法是微粒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，其中在微粒的表面攜帶DNA。用可將微粒加速到足以穿透植物細(xì)胞壁和膜的速度的生物彈裝置將表達(dá)載體導(dǎo)入植物組織。Sanford等，Part.Sci.Technol.527(1987)，Sanford，J.C.，Trends Biotech.6299(1988)，Sanford，J.C.，Physiol.Plant 79206(1990)，Klein等，Biotechnology 10268(1992)，本文分別以其整體引用以供參考。
將DNA物理傳遞到植物的另一方法是超聲處理靶細(xì)胞。Zhang等，Bio/Technology 9996(1991)。另外，脂質(zhì)體或原生質(zhì)球融合已經(jīng)用于將表達(dá)載體導(dǎo)入植物。Deshayes等，EMBO J.，42731(1985)，Christou等，Proc Natl.Acad.Sci.USA 843962(1987)，本文分別以其整體引用以供參考。也有報(bào)導(dǎo)使用CaCl2沉淀，聚乙烯醇或聚-L-鳥(niǎo)氨酸將DNA直接吸收進(jìn)原生質(zhì)體。Hain等，Mol.Gen.Genet.199161(1985)和Draper等，Plant Cell Physiol.23451(1982)，本文分別以其整體引用以供參考。對(duì)原生質(zhì)體和完整細(xì)胞和組織的電穿孔也有描述。Donn等，見(jiàn)第VII屆國(guó)際植物細(xì)胞和組織培養(yǎng)物IAPTC會(huì)議摘要，A2-38，第53頁(yè)(1990)；D′Halluin等，Plant Cell 41495-1505(1992)和Spencer等，Plant Mol.Biol.2451-61(1994)，本文分別以其整體引用以供參考。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離的胡蘿卜素合酶通過(guò)在有效產(chǎn)生該蛋白的條件下培養(yǎng)表達(dá)該蛋白的細(xì)胞，并回收該蛋白來(lái)產(chǎn)生。培養(yǎng)的優(yōu)選細(xì)胞是本發(fā)明的重組細(xì)胞。有效培養(yǎng)條件包括，但不限于，允許該蛋白質(zhì)產(chǎn)生的有效培養(yǎng)基，生物反應(yīng)器，溫度，pH和氧條件。有效培養(yǎng)基是指培養(yǎng)細(xì)胞以產(chǎn)生本發(fā)明的胡蘿卜素合酶的任何培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基一般包含具有可同化的碳，氮和磷酸來(lái)源，和合適的鹽，無(wú)機(jī)物，金屬和其它營(yíng)養(yǎng)成分，例如維生素的含水培養(yǎng)基。本發(fā)明的細(xì)胞可在常規(guī)發(fā)酵生物反應(yīng)器，搖瓶，試管，微量滴定培養(yǎng)皿，和培養(yǎng)板上培養(yǎng)。培養(yǎng)可在適合于重組細(xì)胞的溫度，pH和氧含量下進(jìn)行。該培養(yǎng)條件在本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員的知識(shí)范圍內(nèi)。
取決于用于產(chǎn)生的載體和宿主系統(tǒng)，本發(fā)明所得的蛋白質(zhì)可保留在重組宿主細(xì)胞內(nèi)；分泌進(jìn)培養(yǎng)基中；分泌進(jìn)兩個(gè)細(xì)胞膜之間的間隙，例如大腸桿菌的壁膜間隙；或者保留在細(xì)胞膜的外表面。術(shù)語(yǔ)“回收該蛋白質(zhì)”是指收集含有該蛋白質(zhì)的全部培養(yǎng)基且不必隱含著另外的分離或純化步驟。如果需要，本發(fā)明的蛋白質(zhì)可使用各種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)純化技術(shù)進(jìn)行純化，例如，但不限于，親和色譜法，離子交換色譜法，過(guò)濾，電泳，疏水相互作用色譜法，凝膠過(guò)濾色譜法，反相色譜法，伴刀豆球蛋白A色譜法，色譜聚焦和差別溶解。如果純化本發(fā)明的蛋白質(zhì)，它們優(yōu)選以“基本上純”的形式回收。本文使用的“基本上純”是指允許該蛋白質(zhì)有效用作生物催化劑或其它試劑的純度。
為了用本發(fā)明的方法產(chǎn)生明顯高產(chǎn)的類(lèi)胡蘿卜素，可遺傳修飾微生物或植物(或植物的部分，例如，種子，花粉，胚，花，果實(shí)，芽，葉，根，莖，外植體，等)以提高胡蘿卜素合酶的作用，且優(yōu)選增強(qiáng)胡蘿卜素合酶的產(chǎn)生，從而提高類(lèi)胡蘿卜素終產(chǎn)物的產(chǎn)量。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，可遺傳修飾含有本發(fā)明的內(nèi)源性胡蘿卜素合酶的微生物(例如，Schizochytrium)以增加或減少胡蘿卜素合酶的表達(dá)和活性。
本文使用的遺傳修飾的微生物，例如遺傳修飾的細(xì)菌，原生生物，顯微藻類(lèi)，真菌，或其它微生物，且特別是本文所述的Thraustochytriales目(例如，Thraustochytrid)的各屬中的任一成員(例如，Schizochytrium，破囊壺菌屬，Japonochytrium，Labyrinthuloides)，具有從其正常(即，野生型或天然存在)的形式修飾(即，突變或改變)的基因組以便實(shí)現(xiàn)所需的結(jié)果(即，增強(qiáng)或修飾的胡蘿卜素合酶表達(dá)和/或活性和/或使用胡蘿卜素合酶產(chǎn)生所需的產(chǎn)物)。使用傳統(tǒng)的菌株開(kāi)發(fā)和/或分子遺傳技術(shù)可實(shí)現(xiàn)對(duì)微生物的遺傳修飾。用于微生物的該技術(shù)是普遍公開(kāi)的，例如，參見(jiàn)Sambrook等，1989，出處同上，本文以其整體引用以供參考。遺傳修飾的微生物可包括以該修飾賦予微生物所需效果的方式插入，缺失或修飾(即，突變；例如通過(guò)核苷酸的插入，缺失，取代，和/或倒位)了其核酸分子的微生物。
根據(jù)本發(fā)明修飾的優(yōu)選微生物宿主細(xì)胞包括，但不限于，任何細(xì)菌，原生生物，顯微藻類(lèi)，真菌，或原生動(dòng)物。在一個(gè)方面，遺傳修飾的優(yōu)選微生物包括，但不限于，Thraustochytriales目的任何微生物。用于本發(fā)明的特別優(yōu)選的宿主細(xì)胞包括來(lái)自這樣一個(gè)屬的微生物，該屬包括，但不限于破囊壺菌屬，Labyrinthuloides，Japonochytrium，和Schizochytrium。這些屬中優(yōu)選的種類(lèi)包括，但不限于任何Schizochytrium種類(lèi)，包括Schizochytriumaggregatum，Schizochytrium limacinum，Schizochytrium minutum；任何破囊壺菌屬種類(lèi)(包括以前的Ulkenia種類(lèi)，例如U.visurgensis，U.amoeboida，U.sarkariana，U.profunda，U.radiata，U.minuta和Ulkenia sp.BP-5601)，且包括Thraustochytrium stratum，Thraustochytrium aueum，Thraustochytriumroseum；和任何Japonochytrium種類(lèi)。特別優(yōu)選的Thraustochytriales菌株包括，但不限于Schizochytrium sp.(S31)(ATCC 20888)；Schizochytriumsp.(S8)(ATCC 20889)；Schizochytrium sp.(LC-RM)(ATCC 18915)；Schizochytrium sp.(SR21)；Schizochytrium aggregatum(Goldstein etBelsky)(ATCC 28209)；Schizochytrium limacinum(Honda et Yokochi)(IFO32693)；破囊壺菌屬種類(lèi)(23B)(ATCC 20891)；Thraustochytriumstriatum(Schneider)(ATCC 24473)；Thraustochytrium aureum(Goldstein)(ATCC34304)；Thraustochytrium roseum(Goldstein)(ATCC 28210)；和Japonochytriumsp.(L1)(ATCC 28207)。用于遺傳修飾的合適宿主微生物的其它例子包括，但不限于，包括啤酒糖酵母，卡爾斯伯糖酵母(Saccharomyces carlsbergensis)的酵母，或諸如假絲酵母屬(Candida)，克魯維氏酵母屬(Kluyieromyces)的其它酵母，或者其它真菌，例如，絲狀真菌，例如曲霉屬(Aspergillus)，鏈孢霉屬(Neurospora)，青霉屬(Penicillium)，等。細(xì)菌細(xì)胞也可用作宿主。它包括可用于發(fā)酵過(guò)程的大腸桿菌。另外，諸如乳芽孢桿菌屬(Lactobacillus)種類(lèi)或芽孢桿菌屬(Bacillus)種類(lèi)的宿主也可用作宿主。
本文使用的遺傳修飾的植物可包括任何遺傳修飾的植物，包括高等植物且特別是任何可消費(fèi)的植物或者用于產(chǎn)生本發(fā)明的所需產(chǎn)物(例如，類(lèi)胡蘿卜素或任何其它脂類(lèi)產(chǎn)品)的植物。該遺傳修飾的植物具有從其正常(即，野生型或天然存在)的形式修飾(即，突變或改變)的基因組以便實(shí)現(xiàn)所需的結(jié)果(即，增強(qiáng)或修飾的胡蘿卜素合酶表達(dá)和/或活性和/或使用胡蘿卜素合酶產(chǎn)生所需的產(chǎn)物)。使用傳統(tǒng)的品系開(kāi)發(fā)和/或分子遺傳技術(shù)可實(shí)現(xiàn)對(duì)植物的遺傳修飾。產(chǎn)生在植物基因組中插入了編碼所需氨基酸序列的重組核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物的方法是本領(lǐng)域已知的且上文進(jìn)行了簡(jiǎn)要描述。根據(jù)本發(fā)明遺傳修飾的優(yōu)選植物優(yōu)選是適合于動(dòng)物，包括人消費(fèi)的植物。
根據(jù)本發(fā)明遺傳修飾的優(yōu)選植物(即，植物宿主細(xì)胞)包括，但不限于任何高等植物，且特別是可消費(fèi)的植物，包括莊稼植物且特別是使用其油類(lèi)的植物。該植物可包括，例如，canola，大豆，油菜籽，亞麻籽，玉米，紅花，亞麻，向日葵，煙草，水稻，番茄和胡蘿卜。其它優(yōu)選的植物包括已知產(chǎn)生用作藥劑，調(diào)味劑，中和劑(neutraceutical agents)，功能性食品成份或化妝活性劑的化合物的那些植物或遺傳改造成產(chǎn)生這些化合物/試劑的植物。
根據(jù)本發(fā)明，遺傳修飾的微生物或植物包括使用重組技術(shù)修飾的微生物或植物。本文使用的導(dǎo)致基因表達(dá)，基因功能，或基因產(chǎn)物(即該基因編碼的蛋白質(zhì))功能下降的遺傳修飾是指基因的失活(全部或部分)，缺失，中斷，阻斷或下調(diào)。例如，導(dǎo)致該基因編碼的蛋白質(zhì)的功能下降的基因遺傳修飾可由該基因的完全缺失(即，該基因不存在，且因此該蛋白質(zhì)不存在)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)不完整或不翻譯(例如，該蛋白質(zhì)不表達(dá))的基因突變，或者降低或消除該蛋白質(zhì)的天然功能(例如，表達(dá)降低或沒(méi)有酶活性或作用的蛋白質(zhì))的基因突變引起。導(dǎo)致基因表達(dá)或功能提高的遺傳修飾是指基因的擴(kuò)增，過(guò)量產(chǎn)生，過(guò)量表達(dá)，活化，增強(qiáng)，增加，或上調(diào)。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，微生物或植物的遺傳修飾提高或者降低了本發(fā)明的胡蘿卜素合酶的表達(dá)和/或活性。該遺傳修飾包括任何類(lèi)型的修飾且特別是包括以重組技術(shù)和/或通過(guò)傳統(tǒng)誘變作出的修飾。應(yīng)注意提及的提高胡蘿卜素合酶的作用(活性)是指在所述微生物或植物中和/或用于轉(zhuǎn)化該生物體的含有胡蘿卜素合酶編碼DNA的重組核酸中導(dǎo)致該酶的功能提高的任何遺傳修飾，且包括該酶活性(例如，比活或體內(nèi)酶活性)更高，該酶的抑制或降解減少，和酶的過(guò)量表達(dá)。例如，可增加基因拷貝數(shù)，通過(guò)使用比天然啟動(dòng)子產(chǎn)生更高表達(dá)水平的啟動(dòng)子可提高表達(dá)水平，或者通過(guò)遺傳改造或傳統(tǒng)誘變來(lái)改變基因以提高酶的作用。在一個(gè)方面，胡蘿卜素合酶活性或表達(dá)可通過(guò)修飾與胡蘿卜素合酶基因或蛋白質(zhì)相互作用且正常情況下調(diào)控胡蘿卜素合酶基因或蛋白質(zhì)的表達(dá)或活性的核酸或蛋白質(zhì)來(lái)修飾。該修飾可通過(guò)重組或傳統(tǒng)誘變技術(shù)完成。
同樣，提及的降低胡蘿卜素合酶的作用(活性)是指在所述微生物或植物中和/或在用于轉(zhuǎn)化該生物體的含有胡蘿卜素合酶編碼DNA的重組核酸中導(dǎo)致該酶功能降低的任何遺傳修飾，且包括酶活性(例如，比活)降低。酶的抑制或降解增加，和酶表達(dá)的減少或消除。例如，本發(fā)明的胡蘿卜素合酶的作用可通過(guò)抑制或降低酶的產(chǎn)生，“敲除”全部或部分編碼該酶的基因，降低酶活性，或抑制酶活性(本發(fā)明的胡蘿卜素合酶的任意一種，兩種或三種酶活性)被降低。抑制或降低酶的產(chǎn)生包括將編碼該酶的基因放在需要在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中存在誘導(dǎo)化合物的啟動(dòng)子的控制下。通過(guò)建立在培養(yǎng)基中排除誘導(dǎo)劑的條件，可關(guān)閉編碼該酶的基因的表達(dá)(且從而關(guān)閉酶合成)。抑制或降低酶活性也可包括使用類(lèi)似于美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,743,546中所述的切除技術(shù)方案，本文以其整體引用以供參考。為了使用該方案，可將編碼目的酶的基因克隆到允許從該基因組特異性地，受控地切除該基因的特異性遺傳序列之間。通過(guò)例如，按美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,743,546所述轉(zhuǎn)換培養(yǎng)物的培養(yǎng)溫度，或者通過(guò)一些其它物理或營(yíng)養(yǎng)信號(hào)可啟動(dòng)切除。實(shí)施例中描述了使用同源重組技術(shù)刪除全部或部分本發(fā)明的胡蘿卜素合酶基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，可敲除本發(fā)明的CS的一個(gè)或兩個(gè)酶結(jié)構(gòu)域(例如，PD，PS，LC)以產(chǎn)生所需產(chǎn)物。例如，敲除CS酶的LC結(jié)構(gòu)域可導(dǎo)致產(chǎn)生番茄紅素。該基因可有效產(chǎn)生PD/PS雙功能酶，即一種本發(fā)明人以前未知的組合。番茄紅素本身可以是目的產(chǎn)物。另外，番茄紅素可用作諸如α-胡蘿卜素和葉黃素的其它潛在的目的產(chǎn)物的底物。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，它涉及將誘變程序與選擇性篩選過(guò)程相結(jié)合以獲得感興趣的微生物。該誘變方法包括，但不限于化學(xué)誘變，基因改組，交換編碼特異性酶結(jié)構(gòu)域的基因區(qū)域，或者局限于該基因特定區(qū)域的誘變，以及其它方法。例如，可使用高通量誘變方法影響或優(yōu)化所需類(lèi)胡蘿卜素或其它脂類(lèi)產(chǎn)物的產(chǎn)生。該方法可與通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)胡蘿卜素合酶的選擇性(即，靶向或定向)修飾相結(jié)合。例如，可使用選擇性修飾技術(shù)修飾微生物，例如，通過(guò)將編碼本發(fā)明的胡蘿卜素合酶的重組核酸分子導(dǎo)入包括含有內(nèi)源性胡蘿卜素合酶的宿主細(xì)胞的任何合適的宿主細(xì)胞中，然后使用誘變技術(shù)優(yōu)化類(lèi)胡蘿卜素產(chǎn)生并產(chǎn)生類(lèi)胡蘿卜素合成活性提高的菌株或者選擇具有其它改進(jìn)的或所需的品質(zhì)的微生物。篩選方法也可用于鑒定具有與Schizochytrium的胡蘿卜素合酶同源的胡蘿卜素合酶基因的其它生物體。在該生物體中鑒定的同源性CS基因可用于類(lèi)似于本文所述的方法中。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，遺傳修飾的微生物或植物包括總體上合成類(lèi)胡蘿卜素的能力增強(qiáng)或合成特定類(lèi)胡蘿卜素的能力增強(qiáng)(即，改變?cè)撋矬w產(chǎn)生的特定類(lèi)胡蘿卜素的分布)的微生物或植物。根據(jù)本發(fā)明，“合成某產(chǎn)物的能力增強(qiáng)”是指在與該產(chǎn)物合成相關(guān)的途徑中使得該微生物或植物與在相同條件下培養(yǎng)或生長(zhǎng)的野生型微生物或植物相比產(chǎn)生的該產(chǎn)物量增加的任何增強(qiáng)，或上調(diào)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，微生物或植物合成類(lèi)胡蘿卜素的能力增強(qiáng)可通過(guò)擴(kuò)增該胡蘿卜素合酶基因的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)。擴(kuò)增胡蘿卜素合酶的表達(dá)可在任何合適的宿主細(xì)胞(例如，Thraustochytriales細(xì)胞，細(xì)菌細(xì)胞，酵母細(xì)胞，植物細(xì)胞)中通過(guò)例如，導(dǎo)入編碼胡蘿卜素合酶基因的重組核酸分子，或者對(duì)于Thraustochytriales，通過(guò)修飾天然胡蘿卜素合酶基因的調(diào)控區(qū)來(lái)實(shí)現(xiàn)。
根據(jù)本發(fā)明，生物體或核酸分子的“選擇性修飾”是指靶向或定向修飾，其中所作的修飾是通過(guò)例如，對(duì)本發(fā)明的胡蘿卜素合酶的基因結(jié)構(gòu)的知識(shí)預(yù)先確定和設(shè)計(jì)的。例如，生物體的選擇性修飾可通過(guò)導(dǎo)入編碼胡蘿卜素合酶的重組核酸分子(例如，過(guò)量表達(dá))，或者通過(guò)定向修飾內(nèi)源性基因，例如通過(guò)同源重組來(lái)完成。選擇性修飾不同于隨機(jī)誘變技術(shù)，其中在后一種方法中，突變是通過(guò)非靶向特異性方法隨機(jī)產(chǎn)生的且隨后通過(guò)篩選突變體的表型選擇需要的表型。在本發(fā)明中可結(jié)合選擇性修飾技術(shù)和傳統(tǒng)隨機(jī)誘變和篩選技術(shù)以產(chǎn)生各種遺傳修飾的生物體。
因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是提供用含有編碼胡蘿卜素合酶的核酸序列的重組核酸分子轉(zhuǎn)化的微生物或植物。優(yōu)選的含有該核酸序列的重組核酸分子包括含有本文前面所述的任一胡蘿卜素合酶核酸序列的重組核酸分子。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是提供用含有編碼突變的，或同源的胡蘿卜素合酶的核酸序列的遺傳修飾的重組核酸分子轉(zhuǎn)化的微生物或植物。該胡蘿卜素合酶本文稱(chēng)為胡蘿卜素合酶同源物，且包含本文所述的天然胡蘿卜素合酶的任意一種，兩種或三種酶活性。蛋白質(zhì)同源物在本文已經(jīng)進(jìn)行了詳細(xì)描述。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是提供通過(guò)生物合成法產(chǎn)生類(lèi)胡蘿卜素的遺傳修飾的微生物，其中該微生物包含編碼胡蘿卜素合酶的核酸分子且其中編碼胡蘿卜素合酶的該核酸分子進(jìn)行了修飾以提高胡蘿卜素合酶的表達(dá)或生物學(xué)活性。該胡蘿卜素合酶可以是本文所述的任何胡蘿卜素合酶，包括本文所述的同源物和生物學(xué)活性片段。在本發(fā)明的一個(gè)方面，該微生物含有內(nèi)源性胡蘿卜素合酶(例如，Thraustochytriales的一個(gè)成員)，且該內(nèi)源性基因進(jìn)行了修飾以提高胡蘿卜素合酶的表達(dá)或活性(例如，通過(guò)導(dǎo)入比天然啟動(dòng)子產(chǎn)生的表達(dá)水平更高的啟動(dòng)子，通過(guò)遺傳突變?cè)搩?nèi)源性基因以提高該酶的活性，等等)。在另一實(shí)施方案中，通過(guò)用編碼本發(fā)明的胡蘿卜素合酶的重組核酸分子轉(zhuǎn)化可遺傳修飾該微生物。該微生物可以是任何合適的宿主微生物且在一個(gè)實(shí)施方案中，它是Thraustochytriales微生物(例如，Schizochytrium)，以便該微生物可同時(shí)包含內(nèi)源性胡蘿卜素合酶和重組胡蘿卜素合酶。在該方案中的胡蘿卜素合酶不必相同，因?yàn)榕c本文公開(kāi)的野生型Schizochytrium胡蘿卜素合酶相比，該內(nèi)源性和重組胡蘿卜素合酶之一或兩者可進(jìn)行修飾以產(chǎn)生胡蘿卜素合酶同源物。例如，可修飾該內(nèi)源性和重組胡蘿卜素合酶之一或兩者以提高胡蘿卜素合酶的表達(dá)或活性。
因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是含有本文所述的任一微生物的生物量，其中該微生物含有編碼胡蘿卜素合酶的核酸分子，該核酸分子如上所述進(jìn)行了修飾以提高胡蘿卜素合酶的表達(dá)或生物學(xué)活性。本文使用的生物量是指從發(fā)酵或培養(yǎng)過(guò)程中收獲的微生物細(xì)胞群體。用于接種，生長(zhǎng)和回收微生物生物量的各種發(fā)酵參數(shù)在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,130,242中詳細(xì)討論，本文以其整體引用以供參考?？筛稍?例如，噴霧干燥，洞道干燥(tunnel drying)，真空干燥，或類(lèi)似方法)從發(fā)酵過(guò)程回收的生物量并用于任何食品，藥品或其它所需產(chǎn)品。另外，收獲并洗滌的生物量可在各種產(chǎn)品中直接使用(不經(jīng)干燥)。為了延長(zhǎng)其貨架壽命，該潮濕的生物量可進(jìn)行酸化(大約pH＝3.5-4.5)和/或巴氏消毒或急速加熱以滅活酶，然后在真空或非氧化空氣(例如N2或CO2)中裝罐，裝瓶或者包裝。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是通過(guò)生物合成過(guò)程產(chǎn)生類(lèi)胡蘿卜素的方法，包括在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)如上所述提高了胡蘿卜素合酶的表達(dá)或生物學(xué)活性的遺傳修飾的微生物。例如，該微生物可具有提高的本文所述的任何胡蘿卜素合酶蛋白，包括同源物和其酶活性部分的表達(dá)或生物學(xué)活性。該胡蘿卜素合酶可以是根據(jù)本發(fā)明的內(nèi)源性胡蘿卜素合酶和/或重組胡蘿卜素合酶。該微生物可在合適的培養(yǎng)基中，在有效產(chǎn)生所需類(lèi)胡蘿卜素或其它脂類(lèi)產(chǎn)物的條件下培養(yǎng)或生長(zhǎng)。合適的，或有效的培養(yǎng)基是指本發(fā)明的遺傳修飾的微生物在其中培養(yǎng)時(shí)，能夠產(chǎn)生所需產(chǎn)物的任何培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基一般是含有可同化的碳，氮和磷酸鹽來(lái)源的含水培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基也可包含合適的鹽，無(wú)機(jī)物，金屬和其它營(yíng)養(yǎng)成分。本發(fā)明的微生物可在常規(guī)發(fā)酵生物反應(yīng)器中培養(yǎng)。該微生物可通過(guò)任何發(fā)酵方法培養(yǎng)，該發(fā)酵方法包括，但不限于，分批，補(bǔ)料分批，細(xì)胞再循環(huán)，和連續(xù)發(fā)酵。根據(jù)本發(fā)明的潛在宿主微生物的優(yōu)選生長(zhǎng)條件是本領(lǐng)域熟知的。該遺傳修飾的微生物產(chǎn)生的目的產(chǎn)物可使用常規(guī)的分離和純化技術(shù)從發(fā)酵培養(yǎng)基中回收。例如，可過(guò)濾或離心該發(fā)酵培養(yǎng)基以去掉微生物，細(xì)胞碎片和其它顆粒性物質(zhì)，且該產(chǎn)物可通過(guò)常規(guī)方法，例如，離子交換，色譜法，提取，溶劑萃取，膜分離，電透析，逆向滲透，蒸餾，化學(xué)衍生化和結(jié)晶，從無(wú)細(xì)胞上清中回收。另外，產(chǎn)生所需產(chǎn)物的微生物，或提取物及其各種分離成份不需從諸如本發(fā)明的生物量的產(chǎn)物中去掉微生物成份就可使用。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是通過(guò)生長(zhǎng)或培養(yǎng)本文前面所述的本發(fā)明的遺傳修飾的植物產(chǎn)生類(lèi)胡蘿卜素的方法。該方法包括在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)或在合適的環(huán)境，例如土壤中生長(zhǎng)具有遺傳修飾以提高胡蘿卜素合酶的作用的植物的步驟。優(yōu)選的是，該遺傳修飾包括用表達(dá)具有胡蘿卜素合酶生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)的重組核酸分子轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染該植物。該蛋白質(zhì)可包括本文所述的任一胡蘿卜素合酶，包括天然存在的具有生物學(xué)活性的胡蘿卜素合酶的任何同源物。
在產(chǎn)生本發(fā)明的類(lèi)胡蘿卜素的方法中，具有遺傳修飾以增強(qiáng)胡蘿卜素合酶作用的植物在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)或者在諸如土壤的合適培養(yǎng)基中生長(zhǎng)以產(chǎn)生胡蘿卜素合酶。合適的，或有效的發(fā)酵培養(yǎng)基在上文中進(jìn)行了詳細(xì)討論。高等植物合適的生長(zhǎng)培養(yǎng)基包括任何植物生長(zhǎng)培養(yǎng)基，包括，但不限于，土壤，沙土，支持根生長(zhǎng)的任何其它顆粒性培養(yǎng)基(例如，蛭石，perlite，等)或者水培培養(yǎng)基，以及合適的光照，水和優(yōu)化高等植物生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)添加劑。通過(guò)增強(qiáng)胡蘿卜素合酶的作用可改造本發(fā)明的遺傳修飾的植物以產(chǎn)生有效量的類(lèi)胡蘿卜素。通過(guò)從植物中提取類(lèi)胡蘿卜素的純化過(guò)程可回收該類(lèi)胡蘿卜素。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)收獲植物或植物部分(例如，種子)回收該類(lèi)胡蘿卜素。在該實(shí)施方案中，該植物或植物部分可以其天然狀態(tài)被消費(fèi)或者進(jìn)一步加工成可消費(fèi)的產(chǎn)品。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案涉及缺乏色素形成的遺傳修飾的微生物，其中該微生物進(jìn)行了遺傳修飾以選擇性缺失或失活胡蘿卜素合酶基因或其功能域編碼部分(例如，任意一種，兩個(gè)或三個(gè)本發(fā)明的胡蘿卜素合酶的功能性酶結(jié)構(gòu)域，即PD，PS和/或LC)。胡蘿卜素合酶基因包括本文前面所述的編碼胡蘿卜素合酶的核酸分子。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該微生物是顯微藻類(lèi)，且在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，它是Thraustochytriales微生物(例如，Schizochytrium)。通過(guò)修飾胡蘿卜素合酶基因的編碼區(qū)或者胡蘿卜素合酶基因的調(diào)控區(qū)可修飾胡蘿卜素合酶基因，以便降低，且優(yōu)選抑制該胡蘿卜素合酶基因的表達(dá)和/或生物學(xué)活性，使得該微生物缺乏色素形成。在一個(gè)實(shí)施方案中，該胡蘿卜素合酶基因被部分或完全缺失或失活，包括通過(guò)用無(wú)CS的核酸序列取代該基因，例如通過(guò)同源重組進(jìn)行基因破壞。在該方面，通過(guò)用與胡蘿卜素合酶基因雜交的包含破壞胡蘿卜素合酶基因編碼區(qū)的異源性核酸序列的核酸序列進(jìn)行靶向同源重組可突變或失活(或缺失)該胡蘿卜素合酶基因(見(jiàn)實(shí)施例)。
無(wú)色(缺乏色素形成)微生物的產(chǎn)生具有商業(yè)效益。首先，含有胡蘿卜素合酶的微生物包括Thraustochytriales成員，它是已知有價(jià)值的生物體，用于產(chǎn)生含有高水平的多不飽和脂肪酸(PUFAs)的脂類(lèi)，包括諸如ω-3脂肪酸的高度不飽和脂肪酸。PUFAs包括帶有三個(gè)或更多雙鍵的任何ω-3或ω-6多不飽和脂肪酸。ω-3 PUFAs是最終烯鍵從脂肪酸的末端甲基基團(tuán)且包括該基團(tuán)有三個(gè)碳的聚乙烯脂肪酸且包括例如，二十二碳六烯酸C226(n-3)(DHA)，二十碳五烯酸C205(n-3)(EPA)，ω-3鯡油酸C225(n-3)(DPAn-3)，十八碳四烯酸C184(n-3)(SDA)，和亞麻酸C183(n-3)(LNA)。ω-6 PUFAs是最終烯鍵從脂肪酸末端甲基基團(tuán)且包括該基團(tuán)有6個(gè)碳的聚乙烯脂肪酸且包括，例如，花生四烯酸C204(n-6)(ARA)，C224(n-6)，ω-6鯡油酸C225(n-6)(DPAn-6)，γ亞麻酸C183(n-6)(GLA)和二高γ亞麻酸(dihomogammalinolenic acid)C203(n-6)(二高GLA)。PUFAs可以是在包括游離脂肪酸的天然脂類(lèi)和含有PUFA殘基的化合物，包括磷脂；脂肪酸的酯；三酰甘油；二酰甘油酯；單甘油酯；溶血磷脂；磷脂；等中發(fā)現(xiàn)的任一共有形式。多不飽和脂肪酸(PUFAs)認(rèn)為可用于營(yíng)養(yǎng)，制藥，工業(yè)，和其它目的。來(lái)自天然來(lái)源和從化學(xué)合成的PUFAs的廣闊供應(yīng)仍不足以滿(mǎn)足商業(yè)需要。Thraustochytriales的成員，例如Schizochytrium積聚大量富含PUFAs的三酰甘油。例如，可培養(yǎng)Schizochytrium以產(chǎn)生大量的二十二碳六烯酸(DHA；226ω3)和鯡油酸(DPA；225ω-6)；例如，占干重30％的DHA+DPA(Barclay等，J.Appl.Phycol.6，123(1994))。其它PUFAs，包括有價(jià)值的ω-3脂肪酸，可使用諸如Thraustochytriales成員的生物體，通過(guò)遺傳修飾該微生物的PUFA產(chǎn)量分布(profile)來(lái)產(chǎn)生，這是2002年4月16日申請(qǐng)的，發(fā)明名稱(chēng)為“PUFA聚酮化合物合酶系統(tǒng)及其用途”的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)流水號(hào)10/124,800的主題，本文以其整體引用以供參考。
由于存在類(lèi)胡蘿卜素合成途徑，諸如Thraustochytriales成員的微生物的脂類(lèi)產(chǎn)品一般是有色的。由于脂類(lèi)產(chǎn)品用于各種食品和其它商品，因此產(chǎn)生無(wú)色，或缺乏色素形成的微生物和脂類(lèi)產(chǎn)品是有用的，它在某些應(yīng)用中可能是審美需要的。另外，不受理論的約束，有公開(kāi)的報(bào)導(dǎo)表明諸如β-胡蘿卜素的類(lèi)胡蘿卜素在某些情況下可充當(dāng)氧化劑前體(例如，Beutner等，J.Sci.Food Agric.81，559(2001))。因此，用于商品產(chǎn)生的微生物產(chǎn)生的β-胡蘿卜素和其它類(lèi)胡蘿卜素減少可提高從其產(chǎn)生的脂類(lèi)產(chǎn)品的穩(wěn)定性。
因此，本發(fā)明的另一實(shí)施方案涉及含有遺傳修飾的微生物(例如，Thraustochytriales目的微生物(例如，Schizochytrium，破囊壺菌屬))的生物量，該微生物與同種的野生型微生物相比色素形成減少，如上所述。本發(fā)明還包括從遺傳修飾的微生物(例如，Thraustochytriales目的微生物)的培養(yǎng)物中回收的缺乏色素形成的脂類(lèi)，其中該微生物如上所述進(jìn)行了遺傳修飾以選擇性缺失或失活胡蘿卜素合酶基因。應(yīng)明白可發(fā)現(xiàn)含有與本文所述的胡蘿卜素合酶同源的胡蘿卜素合酶的非Thraustochytriales的生物體。也可修飾該微生物以降低胡蘿卜素合酶的表達(dá)或活性，特別是如果該微生物或由該微生物產(chǎn)生的產(chǎn)品在例如，商品中有用的話(huà)。本發(fā)明還包括含有缺乏色素形成的生物量或脂類(lèi)的產(chǎn)品，例如，食品或藥品以及利用本發(fā)明產(chǎn)生的脂類(lèi)的其它產(chǎn)品。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“脂類(lèi)”包括磷脂；游離脂肪酸；脂肪酸的酯；單-，雙-和三酰甘油；固醇和固醇酯；類(lèi)胡蘿卜素；葉黃素(例如，oxycarotenoids)；碳?xì)浠衔?例如，蠟)；類(lèi)異戊二烯衍生的化合物和本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的其它脂類(lèi)。本文使用的食品包括任何食品成份(例如，作為另一食品的一部分的食品，例如油)，且還包括，但不限于精制面包商品，面包卷，早餐谷類(lèi)食品，加工和未加工的乳酪，調(diào)味品(番茄醬，蛋黃醬，等)，乳制品(乳，酸乳)，布丁和膠質(zhì)甜點(diǎn)，碳酸飲料，茶，粉末狀飲料混合物，加工的魚(yú)類(lèi)產(chǎn)品，水果飲料，口香糖，硬甜食，冷凍乳制品，加工的肉產(chǎn)品，堅(jiān)果和堅(jiān)果涂布品(spreads)，意大利面食，加工的禽類(lèi)產(chǎn)品，肉汁和醬油，馬鈴薯片和其它薄片或脆片，巧克力和其它甜食，湯和湯混合物，豆制品(奶，飲料，奶油，增白劑)，植物油涂布品，和蔬菜飲料。其它產(chǎn)品包括食譜添加劑，藥物配制品，人源化動(dòng)物奶，和嬰兒配方。合適的藥物配制品包括，但不限于，抗炎癥配制品，化療劑，活性賦形劑，骨質(zhì)疏松癥藥品，抗抑郁劑，抗驚厥劑，抗-幽門(mén)螺桿菌(Heliobactor pylori)的藥物，治療神經(jīng)變性疾病的藥物，治療肝臟變性疾病的藥物，抗生素，降膽固醇配制品，用于治療選自由如下組成的組中的一種病癥的產(chǎn)品慢性炎癥，急性炎癥，胃腸道紊亂，癌癥，惡病質(zhì)，心臟再狹窄，神經(jīng)變性疾病，肝臟變性疾病，血脂病癥，骨質(zhì)疏松癥，骨關(guān)節(jié)炎，自體免疫疾病，驚厥前期，早產(chǎn)，老年相關(guān)性黃斑病，肺病，和過(guò)氧化物酶體病癥。
因此，本發(fā)明的另一實(shí)施方案涉及從生物合成過(guò)程產(chǎn)生缺乏色素形成的脂類(lèi)的方法，包含按本文前面所述在有效產(chǎn)生該脂類(lèi)的條件下培養(yǎng)遺傳修飾的微生物(例如，Thraustochytriales目的微生物)，其中該微生物按上述進(jìn)行了遺傳修飾以選擇性缺失或失活胡蘿卜素合酶基因。使用本領(lǐng)域已知的各種回收技術(shù)中的任一種可回收該脂類(lèi)或者可回收該完整的微生物或其提取物。本發(fā)明的一個(gè)方面涉及從生物合成過(guò)程回收缺乏色素形成的脂類(lèi)的方法，包括從遺傳修飾的微生物(例如，Thraustochytriales目的微生物)的培養(yǎng)物中回收脂類(lèi)，其中該微生物按上述進(jìn)行了遺傳修飾以選擇性缺失或失活胡蘿卜素合酶基因。從培養(yǎng)物中回收脂類(lèi)的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，且包括，但不限于，離子交換，色譜法，提取，溶劑萃取，相分離，膜分離，電透析，逆向滲透，蒸餾，化學(xué)衍生化和結(jié)晶。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是使用分離的胡蘿卜素合酶，包括本文所述的胡蘿卜素合酶的同源物，產(chǎn)生類(lèi)胡蘿卜素或其衍生物的方法。該方法可分批或者以連續(xù)的方式使用攪拌箱，活塞流柱反應(yīng)器或本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的其它裝置進(jìn)行操作。
在一個(gè)實(shí)施方案中，該胡蘿卜素合酶與固相支持物結(jié)合，即，固定化酶。本文使用的與固相支持物結(jié)合的胡蘿卜素合酶(即，固定化胡蘿卜素合酶)包括固定的分離的胡蘿卜素合酶，固定的含有胡蘿卜素合酶的細(xì)胞(包括固定的Thraustochytriales，細(xì)菌，真菌(例如，酵母)，顯微藻類(lèi)，或植物細(xì)胞)，穩(wěn)定的完整細(xì)胞和穩(wěn)定的細(xì)胞/膜勻漿產(chǎn)物。穩(wěn)定的完整細(xì)胞和穩(wěn)定的細(xì)胞/膜勻漿產(chǎn)物包括來(lái)自天然存在的表達(dá)胡蘿卜素合酶的微生物或來(lái)自本文它處公開(kāi)的遺傳修飾的微生物或植物的細(xì)胞和勻漿產(chǎn)物。因此，盡管下文討論了固定化胡蘿卜素合酶的方法，但是可預(yù)期該方法同樣適用于固定化細(xì)胞且在這樣一個(gè)實(shí)施方案中，可裂解細(xì)胞。
固定化酶的各種方法在Industrial Enzymology，第二版，Godfrey，T.和West，S.Eds.，Stockton Press，New York，N.Y.，1996，第267-272頁(yè)；Immobilized Enzymes，Chibara，I.Ed.，Halsted Press，New York，N.Y.，1978；Enzymes and Immobilized Cells in Biotechnology，Laskin，A.Ed.，Benjamin/Cummings Publishing Co.，Inc.，Menlo Park，California，1985；和Applied Biochemistry and Bioengineering，Vol.4，Chibata，I.和Wingard，Jr.，L.Eds，Academic Press，NewYork，N.Y.，1983中公開(kāi)，本文以其整體引用。
簡(jiǎn)單的說(shuō)，固相支持物是指與胡蘿卜素合酶(或細(xì)胞)形成鍵而不明顯影響分離的胡蘿卜素合酶的活性的任何固相有機(jī)支持物，人工膜，生物聚合物支持物，或無(wú)機(jī)支持物。舉例性的有機(jī)固相支持物包括多聚體，例如聚苯乙烯，尼龍，酚-醛樹(shù)脂，丙烯酸共聚物(例如，聚丙烯酰胺)，穩(wěn)定的完整全細(xì)胞，和穩(wěn)定的粗制全細(xì)胞/膜勻漿產(chǎn)物。舉例性的生物聚合物支持物包括纖維素，多聚葡聚糖(polydextrans)(例如，Sephadex)，瓊脂糖，膠原和幾丁質(zhì)。舉例性的無(wú)機(jī)支持物包括玻璃珠(多孔或無(wú)孔)，不銹鋼，金屬氧化物(例如，多孔陶瓷，例如ZrO2，TiO2，Al2O3，和NiO)和沙子。優(yōu)選的是，該固相支持物選自由穩(wěn)定的完整細(xì)胞和/或粗制的細(xì)胞勻漿產(chǎn)物組成的組中。該支持物的制備需要操作和花費(fèi)最少。另外，該支持物給該酶提供優(yōu)良的穩(wěn)定性。
例如，通過(guò)使用雙功能交聯(lián)劑(例如，戊二醛)穩(wěn)定細(xì)胞和細(xì)胞勻漿產(chǎn)物可產(chǎn)生穩(wěn)定的完整細(xì)胞和/或細(xì)胞/膜勻漿產(chǎn)物。在完整細(xì)胞和細(xì)胞膜中，細(xì)胞壁和膜充當(dāng)固定化支持物。在該系統(tǒng)中，整合的膜蛋白在“最佳”脂類(lèi)膜環(huán)境中。無(wú)論以完整細(xì)胞還是以勻漿產(chǎn)物開(kāi)始，在該系統(tǒng)中細(xì)胞不再是“活的”或者“有新陳代謝的”，或者作為選擇，細(xì)胞是“靜息的”(即，該細(xì)胞維持代謝潛力和有活性的胡蘿卜素合酶，但在培養(yǎng)條件下不生長(zhǎng))；在任一情況下，固定化細(xì)胞或膜可用作生物催化劑。
胡蘿卜素合酶可通過(guò)各種方法結(jié)合到固相支持物上，包括吸附，交聯(lián)(包括共價(jià)鍵)，和包埋。吸附可通過(guò)范德華力，氫鍵，離子鍵，或疏水鍵。用于吸附固定化的舉例性固相支持物包括聚合物吸附劑和離子交換樹(shù)脂。小珠形式的固相支持物是特別合適的?？蛇x擇吸附固相支持物的顆粒大小以便該固定化酶可被網(wǎng)孔濾器留在反應(yīng)器中而底物(例如，用作起始原料以產(chǎn)生所需類(lèi)胡蘿卜素的前體或底物)以所需速率流過(guò)反應(yīng)器。對(duì)于多孔顆粒支持物，可控制吸附過(guò)程以允許胡蘿卜素合酶或微生物細(xì)胞包埋在該顆粒的空穴中，從而提供保護(hù)而無(wú)不可接受的活性損失。
胡蘿卜素合酶與固相支持物的交聯(lián)包括在固相支持物和胡蘿卜素合酶之間形成化學(xué)鍵?？深A(yù)期盡管交聯(lián)一般包括使用中間化合物交聯(lián)胡蘿卜素合酶與固相支持物，但是也可不使用中間化合物在酶與固相支持物之間直接形成共價(jià)鍵。交聯(lián)通常使用雙官能或多官能試劑將酶的羧基，氨基，巰基(sulfur group)，羥基或其它官能團(tuán)活化并附著到固相支持物上。術(shù)語(yǔ)“活化”是指允許在官能團(tuán)上形成鍵的官能團(tuán)的化學(xué)轉(zhuǎn)化。舉例性的氨基活化劑包括水溶性碳二亞胺，戊二醛，溴化氰，N-羥基琥珀酰亞胺酯，三嗪，氰尿酰氯和羰基二咪唑(carbonyl diimidazole)。舉例性的羧基活化劑包括水溶性碳二亞胺，和N-乙基-5-苯基異唑(phenylisoxazolium)-3-磺酸。舉例性的酪氨?；罨瘎┌ㄖ氐衔铩Ｅe例性的巰基活化劑包括二硫基雙-5，5’-(2-硝基苯甲酸)，和谷胱甘肽-2-吡啶基二硫化物。用于將酶與固相支持物直接共價(jià)交聯(lián)的系統(tǒng)包括Eupergit，即可從Rohm Pharma(Darmstadt，Germany)獲得的聚甲基丙烯酸酯珠粒支持物，可從Sterling Organics獲得的硅藻土(Macrosorbs)，可從English China Clay作為“Biofix”支持物獲得的高嶺石，可從W.R.Grace獲得的，通過(guò)硅烷化活化的硅膠，和可從UOP(Des Plaines，IL)獲得的高密度礬土。
也可使用包埋固定化胡蘿卜素合酶。包埋胡蘿卜素合酶包括形成，特別是凝膠(使用有機(jī)或生物多聚體)，囊泡(包括微囊化)，半透膜或其它基質(zhì)。用于包埋酶的舉例性的材料包括膠原，明膠，瓊脂，三醋酸纖維，藻酸鹽，聚丙烯酰胺，聚苯乙烯，聚氨酯，環(huán)氧樹(shù)脂，角叉菜膠，和卵清蛋白。一些多聚體，特別是三醋酸纖維可用于包埋該酶，因?yàn)樗鼈兛蓳饺肜w維中。諸如聚丙烯酰胺凝膠的其它材料可在溶液中聚合以包埋該酶。還有其它材料，例如用可聚合的乙烯基末端基團(tuán)官能化的聚乙二醇寡聚體，通過(guò)在光敏劑存在下用紫外光照射形成交聯(lián)多聚體可包埋酶。
用本文所述的本發(fā)明的任一方法產(chǎn)生的類(lèi)胡蘿卜素可通過(guò)常規(guī)方法回收。使用本發(fā)明的任一方法產(chǎn)生的優(yōu)選的類(lèi)胡蘿卜素包括，但不限于β-胡蘿卜素，蝦青素，角黃素，羥基-角黃素，玉米黃質(zhì)，β-隱黃素，海膽酮，堇菜黃素，α-胡蘿卜素，葉黃素，番茄紅素，和任一上述類(lèi)胡蘿卜素的酯和糖苷。
本發(fā)明還包括能夠選擇性結(jié)合本發(fā)明的胡蘿卜素合酶的分離的(即，從其天然環(huán)境取出的)抗體，或其抗原結(jié)合片段(例如，胡蘿卜素合酶抗體)。術(shù)語(yǔ)“選擇性結(jié)合”是指一個(gè)蛋白與另一蛋白的特異性結(jié)合(例如，抗體，其片段，或抗原的結(jié)合配偶體)，其中通過(guò)任何標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定法(例如，免疫測(cè)定法)測(cè)定的結(jié)合水平比該測(cè)定的背景對(duì)照在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著更高。例如，當(dāng)進(jìn)行免疫測(cè)定時(shí)，對(duì)照一般包括僅含有抗體或抗原結(jié)合片段(即，不存在抗原)的反應(yīng)孔/管，其中在不存在抗原時(shí)抗體或其抗原結(jié)合片段的反應(yīng)量(例如，與孔的非特異性結(jié)合)認(rèn)為是背景。結(jié)合可使用本領(lǐng)域的各種標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)量，包括酶免疫測(cè)定(例如，ELISA)，免疫印跡測(cè)定，等。本發(fā)明的抗體可以是多克隆或單克隆的，功能等價(jià)物，例如抗體片段和遺傳改造的抗體，包括單鏈抗體或嵌合抗體，包括可結(jié)合一個(gè)以上表位的雙特異性抗體。
一般來(lái)說(shuō)，在抗體產(chǎn)生中，將需要其抗體的抗原與合適的的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，例如，但不限于，兔，綿羊，倉(cāng)鼠，豚鼠，小鼠，大鼠，或雞接觸。一般來(lái)說(shuō)，用注射進(jìn)動(dòng)物的有效量的抗原免疫動(dòng)物?？乖挠行Я渴侵刚T導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生抗體所需的量。然后允許動(dòng)物的免疫系統(tǒng)在預(yù)定的時(shí)期內(nèi)應(yīng)答。重復(fù)該免疫過(guò)程直到發(fā)現(xiàn)該免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗該抗原的抗體。為了獲得抗原特異性的多克隆抗體，可從含有所需抗體的動(dòng)物回收血清(或?qū)τ陔u，可從雞蛋中收集抗體)。該血清可作為試劑使用。可通過(guò)例如，用硫酸銨處理血清從血清(或雞蛋)中進(jìn)一步純化多克隆抗體。
單克隆抗體可根據(jù)Kohler和Milstein(Nature 256495-497，1975)的方法產(chǎn)生。例如，可從免疫的動(dòng)物脾臟(或任何合適的組織)中回收B淋巴細(xì)胞且然后與骨髓瘤細(xì)胞融合以獲得能夠在合適培養(yǎng)基中持續(xù)生長(zhǎng)的雜交瘤細(xì)胞群體。產(chǎn)生所需抗體的雜交瘤可通過(guò)檢測(cè)雜交瘤產(chǎn)生的抗體與目的抗原結(jié)合的能力來(lái)選擇。
本發(fā)明的遺傳工程抗體包括通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的那些抗體，該技術(shù)包含操作和重表達(dá)編碼抗體可變區(qū)和/或恒定區(qū)的DNA。具體例子包括，嵌合抗體，其中該抗體的VH和/或VL結(jié)構(gòu)域來(lái)自與抗體剩余部分不同的來(lái)源，和CDR嫁接抗體(及其抗原結(jié)合片段)，其中至少一個(gè)CDR序列和任選至少一個(gè)可變區(qū)構(gòu)架氨基酸來(lái)自一種來(lái)源而可變區(qū)和恒定區(qū)的剩余部分(如果合適的話(huà))來(lái)自不同的來(lái)源。嵌合和CDR-嫁接抗體的構(gòu)建在例如，歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)EP-A 0194276，EP-A 0239400，EP-A 0451216和EP-A 0460617中描述。
2002年5月14日申請(qǐng)的，發(fā)明名稱(chēng)為“胡蘿卜素合酶基因及其用途”的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)60/380,721的完整說(shuō)明書(shū)在本文中作為參考文獻(xiàn)引用。
提供的下列實(shí)施例是用于例證的目的而不打算限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例實(shí)施例1下面的實(shí)施例描述了本發(fā)明的胡蘿卜素合酶基因的鑒定，克隆和測(cè)序。
使用以前從Schizochytrium cDNA文庫(kù)測(cè)序的，但不能公開(kāi)獲得的，內(nèi)部來(lái)源的8500個(gè)克隆，用該克隆序列進(jìn)行BLAST檢索。這些cDNA克隆中命名為L(zhǎng)IB3033-014-Q1-E1-C9的一個(gè)克隆的翻譯序列與已知的八氫番茄紅素合酶(PS)基因表現(xiàn)出強(qiáng)大的同源性。
以該DNA序列的大約400個(gè)堿基對(duì)開(kāi)始，本發(fā)明人努力分離了與已知PS基因具有同源性的Schizochytrium基因。設(shè)計(jì)了一系列DNA引物并用于以Schizochytrium染色體DNA為模板的“基因組步查”P(pán)CR方法以順序鑒定相鄰DNA區(qū)。使用商業(yè)試劑盒(Clonetech，Inc.；Palo Alto，CA)和Schizochytrium基因組DNA構(gòu)建文庫(kù)。將成功的PCR產(chǎn)物克隆進(jìn)大腸桿菌并純化質(zhì)粒DNA用于測(cè)序。另外，使用“逆向PCR”的一個(gè)應(yīng)用(iPCR；Sambrook等，Molecular Cloning，1989，出處同上)。這些工作得到了一個(gè)含有與已知八氫番茄紅素脫氫酶(PD)和番茄紅素環(huán)化酶(LC)基因以及與PS基因同源的不同區(qū)域的大約5085bp的“毗連序列群(contig)”。盡管在PCR-產(chǎn)生的片段中本身存在序列差錯(cuò)，但是很可能這三個(gè)同源性區(qū)域以5’-PD-PS-LC-3’的順序形成單個(gè)閱讀框(ORF)。該預(yù)期的基因命名為胡蘿卜素合酶(CS)。這些活性代表了類(lèi)胡蘿卜素生物合成中的三個(gè)連續(xù)的步驟，即如果有功能，可足以將牻牛兒基牻牛兒焦磷酸(GGPP)轉(zhuǎn)化成β-胡蘿卜素。
對(duì)EST文庫(kù)更詳細(xì)的檢查后來(lái)鑒定了與CS毗連序列群同源的兩個(gè)其它成員。第一個(gè)克隆命名為L(zhǎng)IB81-022-Q1-E1-G1，它與剛好位于LIB3033-014-Q1-E1-C9上游的CS ORF同源而無(wú)重疊。第二個(gè)克隆命名為L(zhǎng)IB81-021-Q1-E1-H1，從CS毗連序列群的上游(在其之外)開(kāi)始并延伸進(jìn)該毗連序列群大約208bp。該EST可能代表上游相鄰基因，但通過(guò)BLAST檢測(cè)與已知基因無(wú)同源性。該EST成員的出現(xiàn)強(qiáng)有力地表明CS毗連序列群含有包括調(diào)控(啟動(dòng)子)序列的CS基因的完整5’區(qū)。
上述5085bp的毗連序列群從該可能的基因起始密碼子上游大約1400bp開(kāi)始延伸并延伸通過(guò)大部分的LC結(jié)構(gòu)域。即，沒(méi)有檢測(cè)到與預(yù)期基因結(jié)構(gòu)一致的終止密碼子。另外，在PCR產(chǎn)生的片段和“單向(one pass)”測(cè)序反應(yīng)的典型毗連序列群中存在明顯的序列錯(cuò)誤。因此，必需獲得并仔細(xì)測(cè)序從Schizochytrium基因組DNA獲得的CS基因的克隆。在本發(fā)明人的實(shí)驗(yàn)室中已經(jīng)構(gòu)建了在λ噬菌體載體(Lambda Fix II；Stratagene，La Jolla，CA)中的一些基因組文庫(kù)。本發(fā)明人設(shè)計(jì)了一種策略，其中如果其DNA明顯與兩種探針雜交，則該噬菌體只能認(rèn)為是“預(yù)期的CS克隆”。評(píng)價(jià)了許多來(lái)自PS，LC，和“上游”(可能的ORF起點(diǎn)的5’區(qū)，或上游)區(qū)域的PCR引物對(duì)使用Schizochytrium基因組DNA作模板產(chǎn)生的強(qiáng)信號(hào)單產(chǎn)物PCR片段。選擇最佳來(lái)自PS的片段并用于探測(cè)由插入載體λFIX II的來(lái)自Schizochytriumsp.ATCC20888基因組DNA的DNA片段組成的重組基因組文庫(kù)。PS探針是洋地黃毒苷標(biāo)記的相應(yīng)于預(yù)期胡蘿卜素合酶閱讀框的部分PS結(jié)構(gòu)域的探針。隨后用洋地黃毒苷標(biāo)記的從胡蘿卜素合酶基因預(yù)期起點(diǎn)上游(“5’-前(prime)”)的序列產(chǎn)生的片段探測(cè)產(chǎn)生陽(yáng)性信號(hào)的克隆。
與兩種探針都產(chǎn)生雜交信號(hào)的一個(gè)λ克隆通過(guò)亞克隆和測(cè)序進(jìn)一步鑒定。限制性分析表明來(lái)自該噬菌體的DNA含有一個(gè)大約18-20kb的克隆插入片段。該插入片段顯示出除了在插入的DNA兩側(cè)的噬菌體載體上有兩個(gè)NotI位點(diǎn)外還含有兩個(gè)內(nèi)部NotI限制性位點(diǎn)。因此，該插入的DNA可鑒定為大約1.2，6，和12kb大小的三個(gè)NotI片段。如果該毗連序列群和PCR片段的限制性圖譜推測(cè)出可能的ATG起始密碼子下游大約140bp處有一個(gè)特征性NotI位點(diǎn)(即，SEQ ID NO1中的bp1542-1549)，則將這三個(gè)NotI片段亞克隆進(jìn)質(zhì)粒載體(pBluescript II SK+)中用于測(cè)序。獲得了6個(gè)構(gòu)建體，代表分別以?xún)煞N方向的3個(gè)片段。同樣，使用XbaI酶獲得了包含全部20kb插入片段的兩個(gè)亞克隆(即，噬菌體載體中的兩個(gè)XbaI位點(diǎn)在插入片段兩側(cè)且無(wú)內(nèi)部XbaI位點(diǎn))。
pCX010，pCX0111.2kb NotI插入片段pCX012，pCX0136kb NotI插入片段pCX014，pCX01512kb NotI插入片段pCX016，pCX01720kb XbaI插入片段從載體引物(越過(guò)NotI克隆位點(diǎn)并延伸進(jìn)Schizochytrium DNA)測(cè)序三個(gè)NotI片段清楚地揭示獲得了完整的CS基因(假定沒(méi)有或僅有小內(nèi)含子，據(jù)信Schizochytrium基因組DNA不含內(nèi)含子)。具體地說(shuō)，1.2kb NotI片段代表預(yù)期的CS ORF的上游和前140bp(很可能含有啟動(dòng)子元件)，且12kb NotI片段代表該基因的剩余部分。顯然，6kb NotI片段代表明顯在CS基因下游的序列。
1.2kb和12kb的NotI克隆用于多序列反應(yīng)。XbaI片段克隆用于證實(shí)該序列包含CS基因中的NotI位點(diǎn)。從兩條鏈測(cè)序展開(kāi)的毗連序列群中的每個(gè)堿基(除了5’上游和3’下游端盡頭的那些堿基；見(jiàn)下文)至少一次。
這些成果產(chǎn)生了一個(gè)序列，測(cè)定為由6525bp組成的CS毗連序列群。CS ORF含有1268個(gè)氨基酸，通過(guò)BLAST分析清楚地分成上述具有明顯同源性的PD(大約469aa)，PS(大約275aa)，和LC(大約222aa)結(jié)構(gòu)域。這三個(gè)結(jié)構(gòu)域通過(guò)與已知序列無(wú)可測(cè)同源性的50-60個(gè)氨基酸的區(qū)域分開(kāi)。這些結(jié)構(gòu)域之間的區(qū)域可能是單純的接頭區(qū)或酶“鉸鏈”。通過(guò)BLAST發(fā)現(xiàn)這三個(gè)活性結(jié)構(gòu)域內(nèi)部是連續(xù)的。因此，似乎不可能在CS基因中存在內(nèi)含子。
含有CS ORF和調(diào)控區(qū)的6525bp的毗連序列群的前5898bp本文以SEQ ID NO1表示。包含SEQ ID NO2的位置1406到5212(包含終止密碼子)的CS ORF本文以SEQ ID NO2表示。SEQ ID NO2編碼本文以SEQ IDNO3表示的1268個(gè)氨基酸的本發(fā)明的胡蘿卜素合酶?，F(xiàn)在參照SEQ IDNO3，CS蛋白的第一個(gè)結(jié)構(gòu)域，即八氫番茄紅素脫氫酶(PD)結(jié)構(gòu)域，包含SEQ ID NO3的氨基酸53到521且本文以SEQ ID NO5表示。SEQ IDNO5由本文以SEQ ID NO4(SEQ ID NO2的位置157至1563)表示的核酸序列編碼。CS蛋白的第二個(gè)結(jié)構(gòu)域，即八氫番茄紅素合酶(PS)結(jié)構(gòu)域，包含SEQ ID NO3的氨基酸586至860且本文以SEQ ID NO7表示。SEQID NO7由本文以SEQ ID NO6(SEQ ID NO2的位置1756至2580)表示的核酸序列編碼。CS蛋白的第三個(gè)結(jié)構(gòu)域，即番茄紅素環(huán)化酶(LC)結(jié)構(gòu)域，包含SEQ ID NO3的氨基酸911至1132且本文以SEQ ID NO9表示。SEQID NO5由本文以SEQ ID NO8(SEQ ID NO2的位置2731至3396)表示的核酸序列編碼。
CS蛋白(SEQ ID NO3)的開(kāi)始(N-末端)50-52個(gè)氨基酸顯示與PD基因無(wú)同源性。相反，其前29個(gè)氨基酸預(yù)期極有可能代表信號(hào)序列(丹麥科技大學(xué)，生物序列分析中心)。很可能該序列將酶靶向細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器，很可能是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。有一個(gè)大約135的C-末端氨基酸序列與已知基因無(wú)明顯的同源性。
該毗連序列群的上游區(qū)域由起始密碼子ATG之前的1405bp組成(SEQID NO1的位置1-1405)。SEQ ID NO1的位置1-345代表從原始PCR產(chǎn)生的片段的序列數(shù)據(jù)且應(yīng)謹(jǐn)慎看待，因?yàn)橥ㄟ^(guò)PCR本身會(huì)引入一些序列錯(cuò)誤。對(duì)1.2kb NotI片段的測(cè)序清楚地鑒定了在該毗連序列群的bp346-349(SEQ ID NO1的位置346-349)處的Sau3AI位點(diǎn)有一個(gè)“終點(diǎn)”，它在λ文庫(kù)構(gòu)建期間可能是部分裂解反應(yīng)的位點(diǎn)。對(duì)上游序列的BLAST揭示與已知基因無(wú)顯著同源性，盡管有一個(gè)EST位于該區(qū)域(見(jiàn)上文)。為了本發(fā)明的目的，位置1-1405，或至少位置346-1405代表了本發(fā)明的CS基因的調(diào)控區(qū)，它很可能含有CS基因的啟動(dòng)子。
對(duì)下游區(qū)域的分析揭示了從該毗連序列群外側(cè)開(kāi)始并向CS基因末端閱讀的一個(gè)ORF(ORF2)。ORF2的終止密碼子很可能產(chǎn)生一個(gè)大約690bp的基因間區(qū)域。在該區(qū)域中間具有功能未知的有趣特征鏈長(zhǎng)42bp(SEQ IDNO1中的bp5698-5739)，具有完整的交替TATAT，等。對(duì)ORF2的625bp進(jìn)行BLAST揭示與廣泛的各種真核來(lái)源的蛋白激酶具有強(qiáng)大同源性(數(shù)據(jù)未顯示)。對(duì)兩條鏈的測(cè)序證實(shí)該毗連序列群的核苷酸多達(dá)bp6479。因此，“6525bp CS毗連序列群”從bp346到bp6479的核苷酸序列具有高度可靠性，其位置346-5898在SEQ ID NO1中顯示。SEQ ID NO1中缺少的部分6525bp毗連序列群是上文剛討論的ORF 2基因編碼區(qū)的開(kāi)始部分。
將SEQ ID NO3(CS)，SEQ ID NO5(PD結(jié)構(gòu)域)，SEQ ID NO7(PS結(jié)構(gòu)域)和SEQ ID NO9(LC結(jié)構(gòu)域)分別與公共序列數(shù)據(jù)庫(kù)比較揭示了下列相似序列的信息。SEQ ID NO5代表八氫番茄紅素脫氫酶結(jié)構(gòu)域，它與來(lái)自鹽桿菌屬種類(lèi)(Halobacterium sp.)(NC 002607)的八氫番茄紅素脫氫酶在488個(gè)氨基酸中有34％的相同性(50％的同源性)；與來(lái)自Methanothermobacter thermautotrophicus(NC_000916)的八氫番茄紅素脫氫酶在476個(gè)氨基酸中有32％的相同性(51％同源性)；與來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)(NC_003450)的八氫番茄紅素脫氫酶在491個(gè)氨基酸中有33％的相同性(47％的同源性)。
SEQ ID NO7代表八氫番茄紅素合酶結(jié)構(gòu)域，它與來(lái)自Mycobacteriumaureum(AJ133724)的八氫番茄紅素合酶在292個(gè)氨基酸中有29％的相同性(39％的同源性)；與來(lái)自天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)(AL109962)的可能的八氫番茄紅素合酶在269個(gè)氨基酸中有30％的相同性(39％的同源性)；與來(lái)自灰色鏈霉菌(Streptomyces griseus)(AF272737)的八氫番茄紅素合酶在138個(gè)氨基酸中有37％的相同性(47％的同源性)。
SEQ ID NO9代表番茄紅素環(huán)化酶結(jié)構(gòu)域，它與來(lái)自布拉氏須霉(Phycomyces blakesleeanus)(AJ278287)的番茄紅素環(huán)化酶/八氫番茄紅素合酶在230個(gè)氨基酸中有31％的相同性(45％的同源性)；與來(lái)自布拉氏須霉(AJ276965)的八氫番茄紅素合酶/番茄紅素環(huán)化酶在230個(gè)氨基酸中有31％的相同性(45％的同源性)；與來(lái)自粗糙鏈孢霉(Neurospora crassa)(L27652)的八氫番茄紅素合酶在245個(gè)氨基酸中有29％的相同性(45％的同源性)；且與來(lái)自稻惡苗赤霉(Gibberella fujikuroi)(AJ426417)的胡蘿卜素環(huán)化酶在193個(gè)氨基酸中有30％的相同性。
SEQ ID NO3代表本發(fā)明的完整胡蘿卜素合酶蛋白，它與來(lái)自鹽桿菌屬種類(lèi)(NP_280452.1)的八氫番茄紅素脫氫酶在488個(gè)氨基酸中具有34％的相同性(51％的同源性)；與來(lái)自Methanogthermobacterthermoautotrophicus(NP_276913.1)的八氫番茄紅素脫氫酶在480個(gè)氨基酸中具有33％的相同性(52％的同源性)；與來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌(NP_599858.1)的八氫番茄紅素脫氫酶在480個(gè)氨基酸中具有33％的相同性(47％的同源性)。
實(shí)施例2下面的實(shí)施例證實(shí)了本發(fā)明的胡蘿卜素合酶基因的表達(dá)和功能。
接下來(lái)的工作集中在證實(shí)CS基因的功能。CS基因在同源和異源宿主中的成功表達(dá)和功能對(duì)于將CS基因及其產(chǎn)物用于各種應(yīng)用具有極大的益處。針對(duì)這些目標(biāo)，準(zhǔn)備了三個(gè)平行的表達(dá)質(zhì)粒方案。另外，構(gòu)建了設(shè)計(jì)成通過(guò)單交換的同源重組或雙交換的重組“敲除”染色體CS基因表達(dá)的質(zhì)粒并通過(guò)轉(zhuǎn)化檢測(cè)(見(jiàn)實(shí)施例3)。質(zhì)粒構(gòu)建的詳情如下。PCSZEO1和pCSZEO2(用于從其天然啟動(dòng)子表達(dá)CS和LC-缺陷型CS)。
將來(lái)自pCX017的大約5.1kb的EcoRI片段(含有完整的CS ORF(SEQ IDNO1的位置1406-5212))，全部上游克隆的DNA(SEQ ID NO1的位置1-1405)，和大約270bp的下游DNA(SEQ ID NO1的位置5213至位置5485)克隆進(jìn)pBluescript SK(+)(Stratagene)的EcoRI位點(diǎn)。具有所需插入方向的構(gòu)建體是pBSKCS6。
通過(guò)消化，稀釋?zhuān)驮龠B接從pBSKCS6中去掉HindE片段(大約950bp)以產(chǎn)生pBSKCS6ΔH。該缺失利用了LC結(jié)構(gòu)域中的HindIII位點(diǎn)(SEQ IDNO1中的bp4552-4557)并去掉了LC結(jié)構(gòu)域的遠(yuǎn)端一半和所有下游的Schizochytrium序列。
接著，通過(guò)消化，稀釋?zhuān)驮龠B接分別從pBSKCS6和pBSKCS6ΔH去掉載體序列的小(大約60bp)XbaI片段以產(chǎn)生pBSKCS6ΔX和pBSKCS6ΔHΔX。去掉小XbaI片段有利于隨后的步驟。
然后將含有Schizochytrium微管蛋白基因啟動(dòng)子(tub啟動(dòng)子)，ble Zeocin抗性基因，和病毒SV40終止子(“TZS”序列盒)的來(lái)自pTUBZEO11-2(Schizochytrium轉(zhuǎn)化載體，詳情參見(jiàn)共同未決的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)系列號(hào)10/124,807，出處同上)的大約1060bp XbaI片段克隆進(jìn)pBSKCS6ΔX和pBSKCS6ΔHΔX的XbaI位點(diǎn)以分別產(chǎn)生pCSZEO1和pCSZEO2。pTUBCS 11，pTUBCS 12，pTUBCS 13，和pTUBCS 14(用于從微管蛋白啟動(dòng)子表達(dá)CS，LC-缺失的CS，和信號(hào)序列缺失的CS)將含有tub啟動(dòng)子鄰近一半的來(lái)自pTUBZEO11-2的213bp的PstI/EcoRI片段定向克隆進(jìn)載體pUC9的合適位點(diǎn)以產(chǎn)生pUC-TUB。
通過(guò)將來(lái)自pTUBZEO11-2的大約880bp的EcoRI片段(如上所述，含有tub啟動(dòng)子的遠(yuǎn)側(cè)一半，Zeocin抗性基因，和SV40終止子)插入pUC-TUB的單一EcoRI位點(diǎn)以構(gòu)建質(zhì)粒pTZS5。通過(guò)特征性限制消化測(cè)定合適的方向。該程序?qū)ⅰ癟ZS”序列盒有效轉(zhuǎn)移進(jìn)pUC9以便在隨后的步驟中利用某些限制性位點(diǎn)。
接著，從CS基因的起點(diǎn)產(chǎn)生PCR片段以便克隆進(jìn)在起始密碼子處含有NcoI位點(diǎn)的所需大腸桿菌表達(dá)載體中。設(shè)計(jì)了兩個(gè)反應(yīng)一個(gè)產(chǎn)生具有天然N-末端的蛋白質(zhì)且第二個(gè)產(chǎn)生缺失了推定的信號(hào)序列的蛋白質(zhì)(見(jiàn)實(shí)施例1)。然后將這些含有NcoI位點(diǎn)的構(gòu)建體轉(zhuǎn)移進(jìn)pTZS5中用于Schizochytrium的微管蛋白啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的表達(dá)。另外，形成這些構(gòu)建體還用于在大腸桿菌中表達(dá)(見(jiàn)下文)。設(shè)計(jì)PCR引物CAX049以便將CS起始ATG密碼子(SEQ ID NO1中的bp1406-1408)轉(zhuǎn)換成NcoI限制性位點(diǎn)(CCATGG)。同樣，設(shè)計(jì)引物CAX050同時(shí)將aa29的密碼子(SEQ ID NO1中的bp1490-1492)轉(zhuǎn)換成起始ATG和NcoI位點(diǎn)。任一引物分別在下游密碼子aa2或aa30處沒(méi)有產(chǎn)生改變。反向引物(CAX048)選擇KpnI位點(diǎn)(SEQ IDNO1的bp1859-1864)的下游以便使用pCX016作模板與CAX049產(chǎn)生510bp的產(chǎn)物且與CAX050產(chǎn)生426bp的產(chǎn)物。
來(lái)自上文剛描述的PCR反應(yīng)的DNA用NcoI和KpnI消化，凝膠純化該片段并分別克隆進(jìn)商業(yè)上可獲得的表達(dá)載體pTrcHis2B(Invitrogen；Carlsbad，CA)的合適位點(diǎn)，產(chǎn)生質(zhì)粒pCSNK2(天然N末端)和pCSNKI 8(截短的N末端)。該載體在大腸桿菌中從高活性的trc啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)。它還含有用于誘導(dǎo)型表達(dá)調(diào)控(用IPTG)的lacIq基因和多克隆位點(diǎn)下游的有效轉(zhuǎn)錄終止子。該載體還設(shè)計(jì)成在表達(dá)蛋白的C末端添加一個(gè)(His)6標(biāo)記，但是該特征與本文所述的克隆步驟無(wú)關(guān)。測(cè)定了pCSNK2和pCSNK18的插入片段的DNA序列并顯示出含有所需的NcoI位點(diǎn)且還與已知的CS基因序列匹配。
pTZS5(和pTUBZEO11-2)中的ble(Zeocin抗性)基因以NcoI/PmlI片段存在，其中NcoI位點(diǎn)的ATG是起始密碼子。用PmlI消化產(chǎn)生平端。為了將N-末端CS編碼區(qū)從pCSNK2和pCSNK18轉(zhuǎn)移進(jìn)pTZS5，采用緊靠(His)6標(biāo)記編碼區(qū)下游的pTrcHis2B載體中的DraI位點(diǎn)(平端)。限制性酶消化后通過(guò)凝膠純化獲得pCSNK2和pCSNK18的NcoI/DraI片段。同樣獲得用NcoI和PmlI消化的pTZS5的大載體片段(缺少ble基因)。將NcoI/DraI片段克隆進(jìn)pTZS5載體片段中產(chǎn)生CS基因片段位于微管蛋白啟動(dòng)子“之后”的pTUBCS2(全長(zhǎng)N-末端)和pTUBCS3(截短的N末端)。
最后，將CS基因的C-末端部分添加到pTUBCS2和pTUBCS3上。通過(guò)用KpnI消化將各質(zhì)粒線(xiàn)形化并用蝦堿性磷酸酶(SAP)處理以最小化隨后載體末端的再連接。通過(guò)消化和凝膠純化制備pBSKCS6和pBSKCS6ΔH(見(jiàn)上文)的KpnI片段。這些片段從早先在CS基因中的KpnI位點(diǎn)(通過(guò)上述PCR片段設(shè)計(jì)保留的)延伸到CS基因下游的載體KpnI位點(diǎn)。因此，它們分別含有CS C-末端的全長(zhǎng)或截短(LC-缺失)部分。將各插入片段與各載體制品連接產(chǎn)生+/-信號(hào)序列(SS)和+/-LC結(jié)構(gòu)域的4個(gè)可能的變異體。通過(guò)限制性消化證實(shí)插入片段的合適方向。命名如下(見(jiàn)下面表格)pTUBCS11SS+，LC+；pTUBCS12SS+，LC-；pTUBCS13SS-，LC+；pTUBCS 14SS-，LC-。這些質(zhì)粒有效導(dǎo)致tub/ble/SV40構(gòu)建體中的ble基因被各種形式的CS基因取代而保持翻譯起始位點(diǎn)在相同位置。它們不含用于轉(zhuǎn)化Schizochytrium的選擇標(biāo)記且必需通過(guò)共轉(zhuǎn)化導(dǎo)入。
PTHCS1，pTHCS2，pTHCS3，pTHCS4，pATCS1，pATCS2，pATCS3和pATCS4(用于在大腸桿菌中表達(dá)CS，LC-缺失的CS，和信號(hào)序列缺失的CS)質(zhì)粒pCSNK2和pCSNK18(見(jiàn)上文)分別用KpnI+EcoRI或KpnI+HindIII處理以制備載體片段(SS+/-)用于隨后添加C-末端DNA片段。質(zhì)粒pBSKCS6(見(jiàn)上文)同樣用KpnI+EcoRI或KpnI+HindIII處理以釋放分別含有或不含CS結(jié)構(gòu)域的C-末端片段。(HindIII和KpnI位點(diǎn)的相關(guān)性已有描述；EcoRI位點(diǎn)位于CS基因下游的載體序列中)。載體片段與插入片段的連接如下

設(shè)計(jì)質(zhì)粒pTHCS1到4用于在大腸桿菌中表達(dá)CS基因及其變異體。使用針對(duì)CS基因產(chǎn)生的抗血清/抗體通過(guò)Western印跡可檢測(cè)這些質(zhì)粒的表達(dá)(見(jiàn)下文)。然而，在大腸桿菌中從這些質(zhì)粒功能性表達(dá)CS不會(huì)導(dǎo)致類(lèi)胡蘿卜素產(chǎn)生，因?yàn)樵摷?xì)菌正常情況下不會(huì)合成CS酶的預(yù)期底物，即牻牛兒基牻牛兒焦磷酸(GGPP)。由于存在某些克隆基因而合成GGPP的各種大腸桿菌菌株在文獻(xiàn)中已有描述。這些克隆基因一般在與pTHCS 1到4不相容的克隆載體上攜帶。因此，構(gòu)建了一組新的質(zhì)粒，將它們?cè)O(shè)計(jì)成在相容載體中表達(dá)CS基因(和變異體)。選擇質(zhì)粒pACYC184作為相容載體用于有效共表達(dá)CS變異體與文獻(xiàn)所述的產(chǎn)生GGPP的質(zhì)粒。選擇pACYC184和pTHCS1-4構(gòu)建體中的限制性位點(diǎn)以允許或者將trc/CS/終止子和lacIq區(qū)轉(zhuǎn)移到無(wú)ori(pTrcHis2B中的質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn))的pACYC184或者轉(zhuǎn)移β-內(nèi)酰胺酶基因(產(chǎn)生GGPP的質(zhì)粒攜帶β-內(nèi)酰胺酶基因且需要氨芐青霉素維持)。具體地說(shuō)，用AseI和NruI消化pACYC184以產(chǎn)生含有pACYC184的ori和氯霉素抗性基因而無(wú)四環(huán)素抗性基因的載體片段。用NdeI和ScaI消化pTHCS1-4質(zhì)粒以提供具有上述屬性的片段。NruI和ScaI消化產(chǎn)生平端，且AseI和NdeI消化產(chǎn)生匹配的2bp 5’突出端的事實(shí)有利于將所得的trc/CS/終止子/lacIq片段克隆進(jìn)部分pACYC184載體中。因此，定向克隆產(chǎn)生在pACYC184中的來(lái)自pTHCS1，2，3，和4的4個(gè)CS構(gòu)建體，分別命名為pATCS1，2，3，和4。預(yù)期在合成GGPP的大腸桿菌菌株中從pATCS 1到4功能性表達(dá)CS基因(和變異體)可產(chǎn)生以肉眼和分光光度法都可檢測(cè)的類(lèi)胡蘿卜素色素。該產(chǎn)生可證實(shí)CS基因在異源性生物體中的功能性表達(dá)。
生物彈(Biolistic)轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化方法基本上按照最初在美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)系列號(hào)10/124,807，出處同上所述的方法。使用生物彈PDS-1000/He粒子傳遞系統(tǒng)(Bio-Rad)。對(duì)于每次轟擊，將大約5μg質(zhì)粒DNA覆蓋到3mg M-10鎢微載體上。使用1100或1350psi爆破盤(pán)(rupture discs)對(duì)Schizochytrium進(jìn)行轟擊?！伴L(zhǎng)滿(mǎn)(grow-out)”4-6小時(shí)后，將轟擊的細(xì)胞接種到含有150-300μg/ml Zeocin(Invitrogen)的瓊脂板上。一般在4-8天回收轉(zhuǎn)化子。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果1.由其天然啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)并在其后面有天然終止子的CS基因表達(dá)。
產(chǎn)生含有CS基因的質(zhì)粒且包括上述Zeocin-抗性序列盒(“TZS”；Schizochytrium微管蛋白基因啟動(dòng)子，Zeocin[博萊霉素]抗性基因[ble]，和病毒SV40終止子)。
用pCSZEO1(全長(zhǎng)CS基因)和pCSZEO2(LC結(jié)構(gòu)域缺失，見(jiàn)上文)轉(zhuǎn)化Schizochytrium導(dǎo)致各質(zhì)粒每μg DNA產(chǎn)生大約800個(gè)Zeocin-抗性菌落，而對(duì)照質(zhì)粒pTUBZEO11-2的轉(zhuǎn)化子為大約300個(gè)/μg。對(duì)照轉(zhuǎn)化子一般顏色均一，而pTUBCS的轉(zhuǎn)化子表現(xiàn)出從正常淺黃到黃/橙的逐漸色素形成。保存了產(chǎn)生最大色素形成的菌落的菌株用于進(jìn)一步研究。一個(gè)pTUBZEO1轉(zhuǎn)化子，即B4-2，和一個(gè)pTUBZEO2轉(zhuǎn)化子，即B4-15，在實(shí)驗(yàn)中分別含有92和40ppm胡蘿卜素，其中對(duì)照轉(zhuǎn)化子含有16ppmβ-胡蘿卜素。這些結(jié)果表明CS基因具有功能，且過(guò)量表達(dá)，并表現(xiàn)出“基因拷貝數(shù)”效應(yīng)。令人感興趣的是，pTUBZEO2轉(zhuǎn)化子不能按預(yù)期產(chǎn)生可檢測(cè)的番茄紅素。也許由該構(gòu)建體中截短的CS基因產(chǎn)生的番茄紅素被原始全長(zhǎng)拷貝的CS基因有效轉(zhuǎn)化成β-胡蘿卜素。
2.由微管蛋白基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)且在其后為SV40終止子的CS基因在概念上，使用上述“TUB/ZEO/SV40”啟動(dòng)子與CS基因代替Zeocin抗性基因。不需陽(yáng)性選擇，該質(zhì)粒構(gòu)建體通過(guò)共轉(zhuǎn)化導(dǎo)入Schizochytrium。如美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)系列號(hào)10/124,807，出處同上中所述，使用該系統(tǒng)的共轉(zhuǎn)化可產(chǎn)生50％或更大的轉(zhuǎn)化效率。
在用pTUBCS11或pTUBCS13與pTUBZEO11-2共轉(zhuǎn)化的起始實(shí)驗(yàn)中，獲得了極少的Zeocin抗性菌落(大約1/μg DNA)。至今從每個(gè)質(zhì)粒獲得了大約10個(gè)Zeocin-抗性轉(zhuǎn)化子。一個(gè)pTUBCS11的轉(zhuǎn)化子，即B5-1，是肉眼觀(guān)察色素形成最強(qiáng)的菌株且在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中顯示含有115ppmβ-胡蘿卜素(對(duì)照16ppm；見(jiàn)下文)。色素產(chǎn)量顯著高于對(duì)照，但僅略高于上文第一個(gè)實(shí)驗(yàn)中所述的假定“基因拷貝數(shù)”效應(yīng)。
總之，上述表達(dá)設(shè)計(jì)多達(dá)4個(gè)ORF變異體。第一個(gè)是全長(zhǎng)CS基因。第二個(gè)是缺失SEQ ID NO3前29個(gè)氨基酸，即推定的信號(hào)序列的ORF；在該情況下，將ORF在氨基酸29處改造為ATG起始密碼子和有用的限制性位點(diǎn)?？赡苋L(zhǎng)CS基因在Schizochytrium中的過(guò)量表達(dá)可毒害(poison)該蛋白質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)靶。同樣，有可能信號(hào)序列可毒害該細(xì)菌系統(tǒng)。第三個(gè)變異體是在LC結(jié)構(gòu)域中間截短的CS ORF。如果有功能，所得的PD/PS酶應(yīng)將GGPP轉(zhuǎn)換成番茄紅素。該P(yáng)D/PS酶本身與類(lèi)胡蘿卜素生物合成酶相比具有獨(dú)特活性。第四個(gè)變異體是信號(hào)序列和LC聯(lián)合缺失。質(zhì)粒命名如下


實(shí)施例3本實(shí)施例描述了失活Schizochytrium中的胡蘿卜素合酶基因質(zhì)粒構(gòu)建pCSKO1，pCSKO2，和pCSKO3將內(nèi)部CS ORF片段(KpnI至HindIII；2689bp)克隆進(jìn)商業(yè)載體pTrcHis2B的合適位點(diǎn)以產(chǎn)生質(zhì)粒pL35-4。
通過(guò)用XbaI線(xiàn)形化pL35-4，用蝦堿性磷酸酶處理，并與來(lái)自pTUBZEO11-2的凝膠純化的1122bp XbaI片段連接進(jìn)一步改良質(zhì)粒pL35-4以包含作為1122bp XbaI片段的來(lái)自pTUBZEO11-2的“TZS”序列盒。所得的質(zhì)粒，即pCSKO1設(shè)計(jì)成轉(zhuǎn)化進(jìn)Zeocin抗性選擇的Schizochytrium后通過(guò)單交換同源重組失活(“敲除”)染色體CS基因。
為了設(shè)計(jì)通過(guò)雙交換同源重組敲除CS基因的質(zhì)粒，將來(lái)自pCX017(見(jiàn)上文)的在大約5.1kb的EcoRI片段上的全長(zhǎng)CS基因(包括全部已知的上游區(qū)和大約270bp的下游區(qū)(到SEQ ID NO1的bp5480-5485的EcoRI位點(diǎn)))克隆進(jìn)(限制性酶消化和磷酸酶處理后的)載體pUC9的EcoRI位點(diǎn)產(chǎn)生pL36-3。
pL36-3用DraIII(單個(gè)位點(diǎn)；SEQ ID NO1的bp275-2773)，Klenow片段，和蝦堿性磷酸酶處理以便在CS基因中間“打開(kāi)”質(zhì)粒并產(chǎn)生平端。TUB/ZEO/SV40序列盒的XbaI片段(見(jiàn)上文)同樣用Klenow片段處理以產(chǎn)生平端并連接進(jìn)線(xiàn)形化載體中。獲得了兩個(gè)插入方向，且所得的質(zhì)粒稱(chēng)為pCSKO2和pCSKO3。測(cè)序DraIII/XbaI接頭表明四個(gè)接頭中的三個(gè)具有預(yù)期的序列；pCSKO3中的一個(gè)接頭具有單個(gè)額外的堿基對(duì)。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)用pCSKO1轉(zhuǎn)化Schizochytrium 20888(設(shè)計(jì)成通過(guò)單交換事件敲除)時(shí)，以大約325/μg質(zhì)粒DNA的頻率獲得Zeocin抗性菌落。(注意對(duì)照質(zhì)粒pTUBZEO 11-2的頻率為60-140/μg質(zhì)粒DNA，且在不存在DNA時(shí)的假轉(zhuǎn)化不產(chǎn)生Zeocin抗性菌落)。在來(lái)自pCSKO1的Zeocin抗性轉(zhuǎn)化子中，大約1/220形成白色，無(wú)色素的“白化”菌落。這些數(shù)據(jù)代表了CS基因按預(yù)期起作用的第一手證據(jù)。生長(zhǎng)來(lái)自對(duì)照質(zhì)粒pTUBZEO 11-2的兩個(gè)“白化”轉(zhuǎn)化子和正常色素形成的轉(zhuǎn)化子用于類(lèi)胡蘿卜素分析。分析干生物量樣品的類(lèi)胡蘿卜素含量?！鞍谆本隂](méi)有檢測(cè)到類(lèi)胡蘿卜素，而對(duì)照菌株具有適度含量(16ppm)的β-胡蘿卜素。
設(shè)計(jì)質(zhì)粒pCSKO2使得轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的大多數(shù)“白化”菌落預(yù)期是通過(guò)雙交換同源重組進(jìn)行基因破壞的結(jié)果。用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Schizochytrium產(chǎn)生每μgDNA大約400個(gè)Zeocin-抗性菌落，且其中大約5％是“白化”菌落。類(lèi)胡蘿卜素分析揭示在兩個(gè)選擇的菌株中無(wú)可檢測(cè)的色素(見(jiàn)下文)。另外，從這些菌株制備的染色體DNA的PCR分析表明CS基因確實(shí)被“TZS”序列盒破壞且不存在質(zhì)粒載體序列。為了檢測(cè)CS基因結(jié)構(gòu)，使用與TZS序列盒插入位點(diǎn)兩側(cè)的CS基因序列同源的PCR引物CAX037(SEQ ID NO1的bp2575-2594)和CAX046(SEQ ID NO1的bp3006-3025)。破壞的基因預(yù)期用該引物對(duì)可產(chǎn)生大約1570bp的產(chǎn)物。為了檢測(cè)載體序列的存在，設(shè)計(jì)了在β-內(nèi)酰胺酶基因區(qū)任一端的兩個(gè)引物對(duì)。具體地說(shuō)，bla3/bla4引物對(duì)預(yù)期從β-內(nèi)酰胺酶基因的鄰近部分產(chǎn)生627bp的片段，而bla2/bla5對(duì)從β-內(nèi)酰胺酶基因的遠(yuǎn)側(cè)部分產(chǎn)生354bp的產(chǎn)物。在pCSKO2質(zhì)粒在β-內(nèi)酰胺酶基因內(nèi)或者在任意兩個(gè)PCR引物的位置之間發(fā)生重組的事件中用兩個(gè)引物對(duì)進(jìn)行分析是必需的。PCR分析來(lái)自pCSKO2轉(zhuǎn)化子的DNA的結(jié)果如下。

(*)pCSKO2的色素形成轉(zhuǎn)化子“白化”轉(zhuǎn)化子僅具有破壞的CS基因且不含載體序列(至少無(wú)β-內(nèi)酰胺酶基因區(qū))。色素形成的轉(zhuǎn)化子具有β-內(nèi)酰胺酶基因區(qū)和未破壞的CS基因。后一菌株似乎也含有破壞的CS基因，因?yàn)槿绻鹥CSKO2質(zhì)粒異位整合進(jìn)宿主染色體則是可預(yù)期的。很可能在兩個(gè)PCR產(chǎn)物之間強(qiáng)度的差異反應(yīng)了大小和擴(kuò)增效率的差異。因此，這些結(jié)果與在pCSKO2的“白化”轉(zhuǎn)化子中通過(guò)雙交換同源重組進(jìn)行CS基因破壞完全一致。
下面是對(duì)從實(shí)施例2和3選擇的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行類(lèi)胡蘿卜素分析的小結(jié)。
下表顯示了對(duì)搖瓶中生長(zhǎng)的選定轉(zhuǎn)化子通過(guò)HPLC進(jìn)行類(lèi)胡蘿卜素分析的結(jié)果。為了進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)，根據(jù)肉眼評(píng)估最高色素形成選擇轉(zhuǎn)化子。該轉(zhuǎn)化子已經(jīng)在上面實(shí)施例2和3中進(jìn)行了描述。
在選擇的轉(zhuǎn)化子中的類(lèi)胡蘿卜素

n.d.未檢測(cè)到*ppm(μg/g dcw)；沒(méi)有檢測(cè)到可測(cè)量的其它類(lèi)胡蘿卜素。
如實(shí)驗(yàn)I所示，pCSKO1(單交換B3-1，B3-2)和pCSKO2(雙交換B6-2，B6-3)的“白化”轉(zhuǎn)化子不含可檢測(cè)的類(lèi)胡蘿卜素。pCSKO2的有色素形成的轉(zhuǎn)化子，即B6-4，產(chǎn)生49ppm的β-胡蘿卜素。由于pCSKO2僅含有CS基因的內(nèi)部片段(且無(wú)啟動(dòng)子)，預(yù)期非“白化”轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生的色素代表基礎(chǔ)或正常水平。與“基因拷貝數(shù)”解釋一致，B4-2，即pCSKO1的轉(zhuǎn)化子含有大約兩倍基礎(chǔ)水平的β-胡蘿卜素。令人感興趣的是，B4-15，即LC-缺陷型pCSZEO2的代表性轉(zhuǎn)化子，含有接近基礎(chǔ)水平的β-胡蘿卜素且無(wú)番茄紅素。該結(jié)果可能表明在該質(zhì)粒中修飾的CS基因完全無(wú)功能。在菌株B5-1，即微管蛋白啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)CS基因的pTUBCS11與pTUBZEO11-2的共轉(zhuǎn)化子中可見(jiàn)最高的β-胡蘿卜素水平。然而，B5-1中的β-胡蘿卜素水平僅略高于B4-2，表明該強(qiáng)微管蛋白啟動(dòng)子的效益最小或者上游底物的量有限。
在實(shí)驗(yàn)II中，除了β-胡蘿卜素外，生長(zhǎng)條件導(dǎo)致產(chǎn)生葉黃素，蝦青素(但是無(wú)有效含量的中間產(chǎn)物類(lèi)胡蘿卜素)。在檢測(cè)的菌株中，類(lèi)胡蘿卜素產(chǎn)生水平表現(xiàn)出與實(shí)驗(yàn)I所述相同的相關(guān)性?！翱截悢?shù)”構(gòu)建體，即pCSZEO1，產(chǎn)生大約兩倍的對(duì)照(pTUBZEO11-2)總類(lèi)胡蘿卜素水平，且“過(guò)量表達(dá)”構(gòu)建體，即pTUBCS11，產(chǎn)生略高的產(chǎn)量。
實(shí)施例4下面的實(shí)施例描述了胡蘿卜素合酶抗體的產(chǎn)生。
將翻譯的(部分)CS閱讀框一級(jí)結(jié)構(gòu)的氨基酸序列提交到StrategicBiosolutions(Ramona，CA)上用于通過(guò)其所有人的軟件進(jìn)行分析以預(yù)測(cè)大多數(shù)抗原區(qū)/肽。認(rèn)為來(lái)自PD結(jié)構(gòu)域的如下12肽具有高抗原性RLVDRLMDEAKA(SEQ ID NO3的aa176-187)。通過(guò)ResGen(Huntsville，AL)合成該肽并用于在兔中產(chǎn)生多克隆抗血清。具體地說(shuō)，在第1天，第2周，第6周，和第8周通過(guò)皮下注射0.5mg肽免疫兩只新西蘭白兔。在第0天(預(yù)抽血)和第4，8，和10周收集血液并制備血清。血清冷凍貯存。
盡管詳細(xì)描述了本發(fā)明的各種實(shí)施方案，顯然本領(lǐng)域的技術(shù)人員可對(duì)這些實(shí)施方案進(jìn)行修飾和改編。然而，應(yīng)明確理解該修飾和改編在下面權(quán)利要求書(shū)所提出的本發(fā)明的范圍內(nèi)。
序列表<110>馬泰克生物科學(xué)公司(Martek Biosciences Corporation)<120>胡蘿卜素合酶基因及其用途<130>2997-30-PCT<150>60/380,721<151>2002-05-14<160>9<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>5898<212>DNA<213>Schizochytrium<400>1acgcgtggtc gacgcccgga ctggtatctc gacatgactt acacggtcct ggacaatgac 60gctgtgcacg tgcaagttag ctaccctatg accggcggat ggattggcgt gggcctttcc120gacaatggcg acatggttgg ctcgcatgcc gtcattgccg gccaaggcgt atccggtatt180cctgcaccaa tcggcgagta caagctcact gcgtacgatg cgccaagact ttcttcctcg240agagccatca ccgacacctc catcgaggtc aacaatggcg tcatgaccat ggagtttacg300gcaaaaacca ttgccggccg gagcattgac gtttcgggtg atggggatcg catcatttac360gccgtctacg agggaagctc cttcggcacg cagcatgccc gagcgggcga ttccaccgtc420aactggtctt cgcctgtgcc ttccagcgca gtgcgccttg ccccgctcgg tcttattatt480cttggcgctc tcgtcaatgt gatcatgatc tagtcgaacg tgcaatctag ccaatgaaaa540aagagtccag ttctatctga atttttcact ttctaaatct cgcatcgaca atctactttt600caaatctcgc aacaaagctg atcttgtttc tccctcaccc agttctatct gaatttttcc660ttttctgaag ctcgcgttaa caatctactt ttcgaatctg tcaacaaagc tgatcttgtt720tctcccccct atccccttcc ctcccccctt ctttgggatc ttgttgtgcg tgtcgcccct780tcaacttctt tgttcgacga tgacctccac ctagcctgtg aagctcatcg tctccgagta840tttctggcct gctccaattc ctctcttcca ttctccatcg catacatgca tgttctttgg900tctcactccg agccatgctt cttcggtcac tacttcatct atttgactag gcctctgttc960gagcgacgaa ccctccgtgt tcgcgggtgt tcattctctg caaagtggtc cgtaaccgtg 1020actaccggac acctcgcgta cactacattc gggacggacg cggccgagcg cgacgtctct 1080
gggcccggcc tgccgccccc ggggccgcgg cttcctcgcg ccgccagccg cgtccaagtc 1140gccagcgcga ggtcgcgcga gtcgaaggag acgttgtcga tctcgaccct cgccatgcgc 1200gtgacgggtg accgcctcac cggatcccgc cctccgcgcg ctgccttcat tccttcattc 1260cttcattcct tcactcaatc ctgcatcatc catcgcccgc ccgcccgctc gcacgcacca 1320gaggcgcgca ttgcgggcca gggcgccgcc tgcagaccgc catcgcgccc gccttctgcc 1380gcgcctcgct cgctcggaga ccgagatggc gcgcagggcg tcgcgcctcg gcgccgccgt 1440cgtcgtcgtc ctcgtcgtcg tcgcctccgc ctgctgctgg caagccgctg cggacgtcgt 1500ggacgcgcag ggcgcaagag gcccggggca agagagcgac ggcggccgcg cgaagaagcg 1560catcgccgtg ctcggggccg ggtacgcagg cctgtccgca gcctgcgaac tgagcagact 1620gggacacgag gtcgtggttc tcgagaagaa cgcctacgtg ggaggccgtg cccaccagtt 1680cgaggtcgag gccgacaatg ggcagacctt caagttcgac gccgggccca gctggtactg 1740gatgcccgag gtctttgacc gcttctttgc gcggtatggg cgaaccgtcc aggagttcta 1800ccagctcgag cgcctcgacc cggcatatcg catcattcgc aatgaccaca acggcgaggg 1860taccgtcgat gtgcccggcg cttcgagcga ggccttcatg tcttgggcac gccaattgaa 1920cggcgatgcc cgactcgtcg accgtctcat ggacgaggcc aaggcaaagt acgaggaggg 1980cgtcttcaag tggatttggc atcccatggt ctcgtggtgg gaaatgatcg atctcaatct 2040cgcgcgcgct gccttgcagt atgacatgtt caacagcttt gtcgctcacc tgcaaaagta 2100catttcaagc gataccctgc tcatgattct caagtggccc gtcatctttc tcggggcctc 2160gcctaatggc gcccctgcgt tgtattccat gatgacctat ggcggtcacg cgctcggcac 2220cttttatcca actggaggcc tcgcgcggcc cgtcgttgcc atcgccgagc ttgccagaga 2280cctcggcgtc gacattcagc tcgatgccga ggtcacctcg tttcgctttg acgagagcgg 2340ccgtggtgtt caagctgttt gcactcgcaa cgatcgctgt gaggctgtcg atggggtcgt 2400ggctgccgcc gattaccacc acgttgagca gacccttctg cccccggaac ttcgtcgcta 2460cgagcagggt ttttgggatg cccaagtcat gtcgccgtcc tgcgtcctct tctacctcgg 2520cttcgatcac cgcatccaag ggctcaccca tcatacgttc ttctttgacc gagacctcga 2580cgctcatctt cacgcggcct ttgacacgca cacttgggcc gaggaacccg tcttttacgt 2640gtcagccacc tcgaaaacgg acccaagcgt agtttctggt cagggcgagg cgctctttgt 2700gctcgttccc atctcctacc agctcaacgg cacagacaac gctgcgcgtc gggagcaaat 2760cctacacacc gtgctcacac gcatggaaga gaacttgaag cagcccctcc gcgagtggct 2820
cgtctaccaa aagtcctacg ggacaacgga ttttgagcgc gactttcact cctttcgtgg 2880caatgctttt ggccacgcca acacgctttc gcagtcgctc gtgctcaaac cctccatgga 2940ctctttactc aataatctcg tctttgctgg ccatttgacg aatcccggcc caggcgtgcc 3000gccgtccatc gtctcgggca ctgtttcggc caacctgttg catgacaaaa tccaagtgac 3060agcaaatcac catgcactgg ggttcacgct cctcggagct ttccttggag ccttgttact 3120cggtattctg gctctctcgg tattctcaac tcgcttcgtg tcgtatgtgg agtgcatcag 3180actcttgtat gtgcacgggc ggacttactt tgccgccgcc acgctcatga agcccatggc 3240ctttctcgac acggcggcca tgtacgggct ttttcgcgtt gccgacgact acgtcgacaa 3300tgttggcgac gccggcgagc ggcagcggaa cctcgacgcc ttcatggcgg acttttggcg 3360atgctgggaa tccggccgag gcgactacgc gcgccatccg acgctccctg ccatcatcga 3420gtcggcgcac cgtcgtgcat acccgcggga actctttgag cgtttcttcc gctccatgcg 3480gatggacgcc aaacgaaagg tcgtctgcct caccatggat gatacgatgg agtacatgga 3540aggcagcgcg gctgtcattg gcgagttcat gctacctatt ctcatgcccg acagagactc 3600tttggctttc aagcaagccg taccgcacgc gcgcaatctt ggactcgctt tccaaatcac 3660caacatgctt cgggatattg gcgaggataa tcgcttgggt cgccagtaca ttcctgtcga 3720cgcctgcaag cgccatggtc taaacggcaa gctcacgtct catgaacagc ctggctttcg 3780cgagctcatg gaggaaatgt tcgctttcac cgacaatctc tatgctagtg ctgaccttgg 3840catcgacatg ttgcctgagc aggtgcgcga cgtcattcgt gtggcgcgtc ttgcgtatca 3900ccgcatccac gacaagatcc gcgcagcgaa ttacgacatt ttcaccgctc gacgtcgagt 3960tccccttgga gaaaagttaa cgattctcgt cgataccgta ccgcgactca agctcgcccg 4020cattgcgctc accgagctca tttgtgctac actctatggt ctttcgcgcc cgcatattgc 4080tttcgtttgg attggcgccg tatgggcgag ctggctcgag tggccgggat gctcgtacct 4140gcgctttcac gggctcttca tactaccgcc gctcctcatg ctcgcccgtt tggcgcacca 4200acgcgctgtt gccgacaagc aggtcccctt cttgcgccgc gctggtttct ggactgtggc 4260actttgcgtc gttgcaacac tttacaccac accatgggac aattttctcg tgtatcgccg 4320cgtctgggga tacccgccgg agcgcattct ctttgtcatt gggtatgtgc ccattgaaga 4380gtacatgttc ttcacgctcg aaaccatgtt ggtcgcggcg gtctggctac aggtttttca 4440gcccacgacg ttgcaggccg aggtaggccc acgtggaaag gggggcatgc tcgttctcgc 4500gagtcttgga ctcgtctggg ttgccggcct ttcgtgtttg gcctcggagc aaagcttata 4560
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<221>CDS<222>(1)..(3807)<223>
<400>2atg gcg cgc agg gcg tcg cgc ctc ggc gcc gcc gtc gtc gtc gtc ctc 48Met Ala Arg Arg Ala Ser Arg Leu Gly Ala Ala Val Val Val Val Leu1 5 10 15gtc gtc gtc gcc tcc gcc tgc tgc tgg caa gcc gct gcg gac gtc gtg 96Val Val Val Ala Ser Ala Cys Cys Trp Gln Ala Ala Ala Asp Val Val20 25 30gac gcg cag ggc gca aga ggc ccg ggg caa gag agc gac ggc ggc cgc 144Asp Ala Gln Gly Ala Arg Gly Pro Gly Gln Glu Ser Asp Gly Gly Arg35 40 45gcg aag aag cgc atc gcc gtg ctc ggg gcc ggg tac gca ggc ctg tcc 192Ala Lys Lys Arg Ile Ala Val Leu Gly Ala Gly Tyr Ala Gly Leu Ser50 55 60gca gcc tgc gaa ctg agc aga ctg gga cac gag gtc gtg gtt ctc gag 240Ala Ala Cys Glu Leu Ser Arg Leu Gly His Glu Val Val Val Leu Glu65 70 75 80aag aac gcc tac gtg gga ggc cgt gcc cac cag ttc gag gtc gag gcc 288Lys Asn Ala Tyr Val Gly Gly Arg Ala His Gln Phe Glu Val Glu Ala85 90 95gac aat ggg cag acc ttc aag ttc gac gcc ggg ccc agc tgg tac tgg 336Asp Asn Gly Gln Thr Phe Lys Phe Asp Ala Gly Pro Ser Trp Tyr Trp100 105 110atg ccc gag gtc ttt gac cgc ttc ttt gcg cgg tat ggg cga acc gtc 384Met Pro Glu Val Phe Asp Arg Phe Phe Ala Arg Tyr Gly Arg Thr Val115 120 125cag gag ttc tac cag ctc gag cgc ctc gac ccg gca tat cgc atc att 432Gln Glu Phe Tyr Gln Leu Glu Arg Leu Asp Pro Ala Tyr Arg Ile Ile130 135 140cgc aat gac cac aac ggc gag ggt acc gtc gat gtg ccc ggc gct tcg 480Arg Asn Asp His Asn Gly Glu Gly Thr Val Asp Val Pro Gly Ala Ser145 150 155 160agc gag gcc ttc atg tct tgg gca cgc caa ttg aac ggc gat gcc cga 528Ser Glu Ala Phe Met Ser Trp Ala Arg Gln Leu Asn Gly Asp Ala Arg165 170 175ctc gtc gac cgt ctc atg gac gag gcc aag gca aag tac gag gag ggc 576Leu Val Asp Arg Leu Met Asp Glu Ala Lys Ala Lys Tyr Glu Glu Gly180 185 190gtc ttc aag tgg att tgg cat ccc atg gtc tcg tgg tgg gaa atg atc 624Val Phe Lys Trp Ile Trp His Pro Met Val Ser Trp Trp Glu Met Ile195 200 205gat ctc aat ctc gcg cgc gct gcc ttg cag tat gac atg ttc aac agc 672Asp Leu Asn Leu Ala Arg Ala Ala Leu Gln Tyr Asp Met Phe Asn Ser210 215 220ttt gtc gct cac ctg caa aag tac att tca agc gat acc ctg ctc atg 720
Phe Val Ala His Leu Gln Lys Tyr Ile Ser Ser Asp Thr Leu Leu Met225 230 235 240att ctc aag tgg ccc gtc atc ttt ctc ggg gcc tcg cct aat ggc gcc 768Ile Leu Lys Trp Pro Val Ile Phe Leu Gly Ala Ser Pro Asn Gly Ala245 250 255cct gcg ttg tat tcc atg atg acc tat ggc ggt cac gcg ctc ggc acc 816Pro Ala Leu Tyr Ser Met Met Thr Tyr Gly Gly His Ala Leu Gly Thr260 265 270ttt tat cca act gga ggc ctc gcg cgg ccc gtc gtt gcc atc gcc gag 864Phe Tyr Pro Thr Gly Gly Leu Ala Arg Pro Val Val Ala Ile Ala Glu275 280 285ctt gcc aga gac ctc ggc gtc gac att cag ctc gat gcc gag gtc acc 912Leu Ala Arg Asp Leu Gly Val Asp Ile Gln Leu Asp Ala Glu Val Thr290 295 300tcg ttt cgc ttt gac gag agc ggc cgt ggt gtt caa gct gtt tgc act 960Ser Phe Arg Phe Asp Glu Ser Gly Arg Gly Val Gln Ala Val Cys Thr305 310 315 320cgc aac gat cgc tgt gag gct gtc gat ggg gtc gtg gct gcc gcc gat 1008Arg Asn Asp Arg Cys Glu Ala Val Asp Gly Val Val Ala Ala Ala Asp325 330 335tac cac cac gtt gag cag acc ctt ctg ccc ccg gaa ctt cgt cgc tac 1056Tyr His His Val Glu Gln Thr Leu Leu Pro Pro Glu Leu Arg Arg Tyr340 345 350gag cag ggt ttt tgg gat gcc caa gtc atg tcg ccg tcc tgc gtc ctc 1104Glu Gln Gly Phe Trp Asp Ala Gln Val Met Ser Pro Ser Cys Val Leu355 360 365ttc tac ctc ggc ttc gat cac cgc atc caa ggg ctc acc cat cat acg 1152Phe Tyr Leu Gly Phe Asp His Arg Ile Gln Gly Leu Thr His His Thr370 375 380ttc ttc ttt gac cga gac ctc gac gct cat ctt cac gcg gcc ttt gac 1200Phe Phe Phe Asp Arg Asp Leu Asp Ala His Leu His Ala Ala Phe Asp385 390 395 400acg cac act tgg gcc gag gaa ccc gtc ttt tac gtg tca gcc acc tcg 1248Thr His Thr Trp Ala Glu Glu Pro Val Phe Tyr Val Ser Ala Thr Ser405 410 415aaa acg gac cca agc gta gtt tct ggt cag ggc gag gcg ctc ttt gtg 1296Lys Thr Asp Pro Ser Val Val Ser Gly Gln Gly Glu Ala Leu Phe Val420 425 430ctc gtt ccc atc tcc tac cag ctc aac ggc aca gac aac gct gcg cgt 1344Leu Val Pro Ile Ser Tyr Gln Leu Asn Gly Thr Asp Asn Ala Ala Arg435 440 445cgg gag caa atc cta cac acc gtg ctc aca cgc atg gaa gag aac ttg 1392Arg Glu Gln Ile Leu His Thr Val Leu Thr Arg Met Glu Glu Asn Leu450 455 460
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Arg Ser Met Arg Met Asp Ala Lys Arg Lys Va1 Val Cys Leu Thr Met690 695 700gat gat acg atg gag tac atg gaa ggc agc gcg gct gtc att ggc gag 2160Asp Asp Thr Met Glu Tyr Met Glu Gly Ser Ala Ala Val Ile Gly Glu705 710 715 720ttc atg cta cct att ctc atg ccc gac aga gac tct ttg gct ttc aag 2208Phe Met Leu Pro Ile Leu Met Pro Asp Arg Asp Ser Leu Ala Phe Lys725 730 735caa gcc gta ccg cac gcg cgc aat ctt gga ctc gct ttc caa atc acc 2256Gln Ala Val Pro His Ala Arg Asn Leu Gly Leu Ala Phe Gln Ile Thr740 745 750aac atg ctt cgg gat att ggc gag gat aat cgc ttg ggt cgc cag tac 2304Asn Met Leu Arg Asp Ile Gly Glu Asp Asn Arg Leu Gly Arg Gln Tyr755 760 765att cct gtc gac gcc tgc aag cgc cat ggt cta aac ggc aag ctc acg 2352Ile Pro Val Asp Ala Cys Lys Arg His Gly Leu Asn Gly Lys Leu Thr770 775 780tct cat gaa cag cct ggc ttt cgc gag ctc atg gag gaa atg ttc gct 2400Ser His Glu Gln Pro Gly Phe Arg Glu Leu Met Glu Glu Met Phe Ala785 790 795 800ttc acc gac aat ctc tat gct agt gct gac ctt ggc atc gac atg ttg 2448Phe Thr Asp Asn Leu Tyr Ala Ser Ala Asp Leu Gly Ile Asp Met Leu805 810 815cct gag cag gtg cgc gac gtc att cgt gtg gcg cgt ctt gcg tat cac 2496Pro Glu Gln Val Arg Asp Val Ile Arg Val Ala Arg Leu Ala Tyr His820 825 830cgc atc cac gac aag atc cgc gca gcg aat tac gac att ttc acc gct 2544Arg Ile His Asp Lys Ile Arg Ala Ala Asn Tyr Asp Ile Phe Thr Ala835 840 845cga cgt cga gtt ccc ctt gga gaa aag tta acg att ctc gtc gat acc 2592Arg Arg Arg Val Pro Leu Gly Glu Lys Leu Thr Ile Leu Val Asp Thr850 855 860gta ccg cga ctc aag ctc gcc cgc att gcg ctc acc gag ctc att tgt 2640Val Pro Arg Leu Lys Leu Ala Arg Ile Ala Leu Thr Glu Leu Ile Cys865 870 875 880gct aca ctc tat ggt ctt tcg cgc ccg cat att gct ttc gtt tgg att 2688Ala Thr Leu Tyr Gly Leu Ser Arg Pro His Ile Ala Phe Val Trp Ile885 890 895ggc gcc gta tgg gcg agc tgg ctc gag tgg ccg gga tgc tcg tac ctg 2736Gly Ala Val Trp Ala Ser Trp Leu Glu Trp Pro Gly Cys Ser Tyr Leu900 905 910cgc ttt cac ggg ctc ttc ata cta ccg ccg ctc ctc atg ctc gcc cgt 2784Arg Phe His Gly Leu Phe Ile Leu Pro Pro Leu Leu Met Leu Ala Arg915 920 925
ttg gcg cac caa cgc gct gtt gcc gac aag cag gtc ccc ttc ttg cgc 2832Leu Ala His Gln Arg Ala Val Ala Asp Lys Gln Val Pro Phe Leu Arg930 935 940cgc gct ggt ttc tgg act gtg gca ctt tgc gtc gtt gca aca ctt tac 2880Arg Ala Gly Phe Trp Thr Val Ala Leu Cys Val Val Ala Thr Leu Tyr945 950 955 960acc aca cca tgg gac aat ttt ctc gtg tat cgc cgc gtc tgg gga tac 2928Thr Thr Pro Trp Asp Asn Phe Leu Val Tyr Arg Arg Val Trp Gly Tyr965 970 975ccg ccg gag cgc att ctc ttt gtc att ggg tat gtg ccc att gaa gag 2976Pro Pro Glu Arg Ile Leu Phe Val Ile Gly Tyr Val Pro Ile Glu Glu980 985 990tac atg ttc ttc acg ctc gaa acc atg ttg gtc gcg gcg gtc tgg cta 3024Tyr Met Phe Phe Thr Leu Glu Thr Met Leu Val Ala Ala Val Trp Leu995 10001005cag gtt ttt cag ccc acg acg ttg cag gcc gag gta ggc cca cgt 3069Gln Val Phe Gln Pro Thr Thr Leu Gln Ala Glu Val Gly Pro Arg101010151020gga aag ggg ggc atg ctc gtt ctc gcg agt ctt gga ctc gtc tgg 3114Gly Lys Gly Gly Met Leu Val Leu Ala Ser Leu Gly Leu Val Trp102510301035gtt gcc ggc ctt tcg tgt ttg gcc tcg gag caa agc tta tac att 3159Val Ala Gly Leu Ser Cys Leu Ala Ser Glu Gln Ser Leu Tyr Ile104010451050ggt ctc att ctc agc tgg tct atg ccc gtc ctc att ctg caa tgg 3204Gly Leu Ile Leu Ser Trp Ser Met Pro Val Leu Ile Leu Gln Trp105510601065agt ctc ggt gca cat gtg ctc act acg cat gca aag ccg gtc ctg 3249Ser Leu Gly Ala His Val Leu Thr Thr His Ala Lys Pro Val Leu107010751080acg acg atc gtg tcg gcc aca gcg tac ctt tgc gtg gcc gac gaa 3294Thr Thr Ile Val Ser Ala Thr Ala Tyr Leu Cys Val Ala Asp Glu108510901095tgg gcg att cgt cac ggc atc tgg cgc atc aat cct gca aat ctt 3339Trp Ala Ile Arg His Gly Ile Trp Arg Ile Asn Pro Ala Ash Leu110011051110gtg ttg ccc atg ggc aaa cat gca ctt ccc ctc gag gaa gcc ctc 3384Val Leu Pro Met Gly Lys His Ala Leu Pro Leu Glu Glu Ala Leu111511201125ttc ttc ttg gtg acc tcg atc atg tgt acg tgg gga ctc acg ctg 3429Phe Phe Leu Val Thr Ser Ile Met Cys Thr Trp Gly Leu Thr Leu113011351140gcc atg gtt ctc tgg ggc aag ccc atc ggc ttg gca gtt ggt atg 3474
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<221>CDS<222>(1)..(825)<223>
<400>6tcg tat gtg gag tgc atc aga ctc ttg tat gtg cac ggg cgg act tac 48Ser Tyr Val Glu Cys Ile Arg Leu Leu Tyr Val His Gly Arg Thr Tyr1 5 10 15ttt gcc gcc gcc acg ctc atg aag ccc atg gcc ttt ctc gac acg gcg 96Phe Ala Ala Ala Thr Leu Met Lys Pro Met Ala Phe Leu Asp Thr Ala20 25 30gcc atg tac ggg ctt ttt cgc gtt gcc gac gac tac gtc gac aat gtt 144Ala Met Tyr Gly Leu Phe Arg Val Ala Asp Asp Tyr Val Asp Asn Val35 40 45ggc gac gcc ggc gag cgg cag cgg aac ctc gac gcc ttc atg gcg gac 192Gly Asp Ala Gly Glu Arg Gln Arg Asn Leu Asp Ala Phe Met Ala Asp50 55 60ttt tgg cga tgc tgg gaa tcc ggc cga ggc gac tac gcg cgc cat ccg 240Phe Trp Arg Cys Trp Glu Ser Gly Arg Gly Asp Tyr Ala Arg His Pro65 70 75 80acg ctc cct gcc atc atc gag tcg gcg cac cgt cgt gca tac ccg cgg 288Thr Leu Pro Ala Ile Ile Glu Ser Ala His Arg Arg Ala Tyr Pro Arg85 90 95gaa ctc ttt gag cgt ttc ttc cgc tcc atg cgg atg gac gcc aaa cga 336Glu Leu Phe Glu Arg Phe Phe Arg Ser Met Arg Met Asp Ala Lys Arg100 105 110aag gtc gtc tgc ctc acc atg gat gat acg atg gag tac atg gaa ggc 384Lys Val Val Cys Leu Thr Met Asp Asp Thr Met Glu Tyr Met Glu Gly115 120 125agc gcg gct gtc att ggc gag ttc atg cta cct att ctc atg ccc gac 432Ser Ala Ala Val Ile Gly Glu Phe Met Leu Pro Ile Leu Met Pro Asp130 135 140aga gac tct ttg gct ttc aag caa gcc gta ccg cac gcg cgc aat ctt 480Arg Asp Ser Leu Ala Phe Lys Gln Ala Val Pro His Ala Arg Asn Leu145 150 155 160gga ctc gct ttc caa atc acc aac atg ctt cgg gat att ggc gag gat 528Gly Leu Ala Phe Gln Ile Thr Asn Met Leu Arg Asp Ile Gly Glu Asp165 170 175aat cgc ttg ggt cgc cag tac att cct gtc gac gcc tgc aag cgc cat 576Asn Arg Leu Gly Arg Gln Tyr Ile Pro Val Asp Ala Cys Lys Arg His180 185 190ggt cta aac ggc aag ctc acg tct cat gaa cag cct ggc ttt cgc gag 624Gly Leu Asn Gly Lys Leu Thr Ser His Glu Gln Pro Gly Phe Arg Glu195 200 205
ctc atg gag gaa atg ttc gct ttc acc gac aat ctc tat gct agt gct 672Leu Met Glu Glu Met Phe Ala Phe Thr Asp Asn Leu Tyr Ala Ser Ala210 215 220gac ctt ggc atc gac atg ttg cct gag cag gtg cgc gac gtc att cgt 720Asp Leu Gly Ile Asp Met Leu Pro Glu Gln Val Arg Asp Val Ile Arg225 230 235 240gtg gcg cgt ctt gcg tat cac cgc atc cac gac aag atc cgc gca gcg 768Val Ala Arg Leu Ala Tyr His Arg Ile His Asp Lys Ile Arg Ala Ala245 250 255aat tac gac att ttc acc gct cga cgt cga gtt ccc ctt gga gaa aag 816Asn Tyr Asp Ile Phe Thr Ala Arg Arg Arg Val Pro Leu Gly Glu Lys260 265 270tta acg att 825Leu Thr Ile275<210>7<211>275<212>PRT<213>Schizochytrium<400>7Ser Tyr Val Glu Cys Iie Arg Leu Leu Tyr Val His Gly Arg Thr Tyr1 5 10 15Phe Ala Ala Ala Thr Leu Met Lys Pro Met Ala Phe Leu Asp Thr Ala20 25 30Ala Met Tyr Gly Leu Phe Arg Val Ala Asp Asp Tyr Val Asp Asn Val35 40 45Gly Asp Ala Gly Glu Arg Gln Arg Asn Leu Asp Ala Phe Met Ala Asp50 55 60Phe Trp Arg Cys Trp Glu Ser Gly Arg Gly Asp Tyr Ala Arg His Pro65 70 75 80Thr Leu Pro Ala Ile Ile Glu Ser Ala His Arg Arg Ala Tyr Pro Arg85 90 95Glu Leu Phe Glu Arg Phe Phe Arg Ser Met Arg Met Asp Ala Lys Arg100 105 110Lys Val Val Cys Leu Thr Met Asp Asp Thr Met Glu Tyr Met Glu Gly115 120 125Ser Ala Ala Val Ile Gly Glu Phe Met Leu Pro Ile Leu Met Pro Asp130 135 140Arg Asp Ser Leu Ala Phe Lys Gln Ala Val Pro His Ala Arg Asn Leu145 150 155 160
Gly Leu Ala Phe Gln Ile Thr Asn Met Leu Arg Asp Ile Gly Glu Asp165 170 175Asn Arg Leu Gly Arg Gln Tyr Ile Pro Val Asp Ala Cys Lys Arg His180 185 190Gly Leu Asn Gly Lys Leu Thr Ser His Glu Gln Pro Gly Phe Arg Glu195 200 205Leu Met Glu Glu Met Phe Ala Phe Thr Asp Asn Leu Tyr Ala Ser Ala210 215 220Asp Leu Gly Ile Asp Met Leu Pro Glu Gln Val Arg Asp Val Ile Arg225 230 235 240Val Ala Arg Leu Ala Tyr His Arg Ile His Asp Lys Ile Arg Ala Ala245 250 255Asn Tyr Asp Ile Phe Thr Ala Arg Arg Arg Val Pro Leu Gly Glu Lys260 265 270Leu Thr Ile275<210>8<211>666<212>DNA<213>Schizochytrium<220>
<221>CDS<222>(1)..(666)<223>
<400>8tac ctg cgc ttt cac ggg ctc ttc ata cta ccg ccg ctc ctc atg ctc 48Tyr Leu Arg Phe His Gly Leu Phe Ile Leu Pro Pro Leu Leu Met Leu1 5 10 15gcc cgt ttg gcg cac caa cgc gct gtt gcc gac aag cag gtc ccc ttc 96Ala Arg Leu Ala His Gln Arg Ala Val Ala Asp Lys Gln Val Pro Phe20 25 30ttg cgc cgc gct ggt ttc tgg act gtg gca ctt tgc gtc gtt gca aca 144Leu Arg Arg Ala Gly Phe Trp Thr Val Ala Leu Cys Val Val Ala Thr35 40 45ctt tac acc aca cca tgg gac aat ttt ctc gtg tat cgc cgc gtc tgg 192Leu Tyr Thr Thr Pro Trp Asp Asn Phe Leu Val Tyr Arg Arg Val Trp50 55 60gga tac ccg ccg gag cgc att ctc ttt gtc att ggg tat gtg ccc att 240Gly Tyr Pro Pro Glu Arg Ile Leu Phe Val Ile Gly Tyr Val Pro Ile65 70 75 80gaa gag tac atg ttc ttc acg ctc gaa acc atg ttg gtc gcg gcg gtc 288Glu Glu Tyr Met Phe Phe Thr Leu Glu Thr Met Leu Val Ala Ala Val
85 90 95tgg cta cag gtt ttt cag ccc acg acg ttg cag gcc gag gta ggc cca 336Trp Leu Gln Val Phe Gln Pro Thr Thr Leu Gln Ala Glu Val Gly Pro100 105 110cgt gga aag ggg ggc atg ctc gtt ctc gcg agt ctt gga ctc gtc tgg 384Arg Gly Lys Gly Gly Met Leu Val Leu Ala Ser Leu Gly Leu Val Trp115 120 125gtt gcc ggc ctt tcg tgt ttg gcc tcg gag caa agc tta tac att ggt 432Val Ala Gly Leu Ser Cys Leu Ala Ser Glu Gln Ser Leu Tyr Ile Gly130 135 140ctc att ctc agc tgg tct atg ccc gtc ctc att ctg caa tgg agt ctc 480Leu Ile Leu Ser Trp Ser Met Pro Val Leu Ile Leu Gln Trp Ser Leu145 150 155 160ggt gca cat gtg ctc act acg cat gca aag ccg gtc ctg acg acg atc 528Gly Ala His Val Leu Thr Thr His Ala Lys Pro Val Leu Thr Thr Ile165 170 175gtg tcg gcc aca gcg tac ctt tgc gtg gcc gac gaa tgg gcg att cgt 576Val Ser Ala Thr Ala Tyr Leu Cys Val Ala Asp Glu Trp Ala Ile Arg180 185 190cac ggc atc tgg cgc atc aat cct gca aat ctt gtg ttg ccc atg ggc 624His Gly Ile Trp Arg Ile Asn Pro Ala Asn Leu Val Leu Pro Met Gly195 200 205aaa cat gca ctt ccc ctc gag gaa gcc ctc ttc ttc ttg gtg 666Lys His Ala Leu Pro Leu Glu Glu Ala Leu Phe Phe Leu Val210 215 220<210>9<211>222<212>PRT<213>Schizochytrium<400>9Tyr Leu Arg Phe His Gly Leu Phe Ile Leu Pro Pro Leu Leu Met Leu1 5 10 15Ala Arg Leu Ala His Gln Arg Ala Val Ala Asp Lys Gln Val Pro Phe20 25 30Leu Arg Arg Ala Gly Phe Trp Thr Val Ala Leu Cys Val Val Ala Thr35 40 45Leu Tyr Thr Thr Pro Trp Asp Asn Phe Leu Val Tyr Arg Arg Val Trp50 55 60Gly Tyr Pro Pro Glu Arg Ile Leu Phe Val Ile Gly Tyr Val Pro Ile65 70 75 80
Glu Glu Tyr Met Phe Phe Thr Leu Glu Thr Met Leu Val Ala Ala Val85 90 95Trp Leu Gln Val Phe Gln Pro Thr Thr Leu Gln Ala Glu Val Gly Pro100 105 110Arg Gly Lys Gly Gly Met Leu Val Leu Ala Ser Leu Gly Leu Val Trp115 120 125Val Ala Gly Leu Ser Cys Leu Ala Ser Glu Gln Ser Leu Tyr Ile Gly130 135 140Leu Ile Leu Ser Trp Ser Met Pro Val Leu Ile Leu Gln Trp Ser Leu145 150 155 160Gly Ala His Val Leu Thr Thr His Ala Lys Pro Val Leu Thr Thr Ile165 170 175Val Ser Ala Thr Ala Tyr Leu Cys Val Ala Asp Glu Trp Ala Ile Arg180 185 190His Gly Ile Trp Arg Ile Asn Pro Ala Ash Leu Val Leu Pro Met Gly195 200 205Lys His Ala Leu Pro Leu Glu Glu Ala Leu Phe Phe Leu Val210 215 220
權(quán)利要求
1.一種分離的蛋白質(zhì)，包含選自由如下組成的組中的氨基酸序列a.選自由SEQ ID NO3，SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9，SEQ ID NO3的位置30至1268組成的氨基酸序列，和其生物活性片段組成的組中的氨基酸序列；b.與SEQ ID NO3或者與SEQ ID NO3的位置30至1268組成的氨基酸序列具有至少大約40％相同性的氨基酸序列，其中所述的氨基酸序列具有下列生物學(xué)活性八氫番茄紅素脫氫酶(PD)活性，八氫番茄紅素合酶(PS)活性，和番茄紅素環(huán)化酶(LC)活性；c.與SEQ ID NO5具有至少大約40％相同性的氨基酸序列，其中所述的氨基酸序列具有八氫番茄紅素脫氫酶(PD)活性；d.與SEQ ID NO7具有至少大約40％相同性的氨基酸序列，其中所述的氨基酸序列具有八氫番茄紅素合酶(PS)活性；和e.與SEQ ID NO9具有至少大約40％相同性的氨基酸序列，其中所述的氨基酸序列具有番茄紅素環(huán)化酶(LC)活性。
2.權(quán)利要求1的分離的蛋白質(zhì)，其中所述的分離的蛋白質(zhì)含有選自由如下組成的組中的氨基酸序列a.與SEQ ID NO3或者與SEQ ID NO3的位置30至1268組成的氨基酸序列具有至少大約60％相同性的氨基酸序列，其中所述的氨基酸序列具有下列生物學(xué)活性八氫番茄紅素脫氫酶(PD)活性，八氫番茄紅素合酶(PS)活性，和番茄紅素環(huán)化酶(LC)活性；b.與SEQ ID NO5具有至少大約60％相同性的氨基酸序列，其中所述的氨基酸序列具有八氫番茄紅素脫氫酶(PD)活性；c.與SEQ ID NO7具有至少大約60％相同性的氨基酸序列，其中所述的氨基酸序列具有八氫番茄紅素合酶(PD)活性；和d.與SEQ ID NO9具有至少大約60％相同性的氨基酸序列，其中所述的氨基酸序列具有番茄紅素環(huán)化酶(LC)活性。
3.權(quán)利要求1的分離的蛋白質(zhì)，其中所述的蛋白質(zhì)含有選自由如下組成的組中的氨基酸序列a.與SEQ ID NO3或者與SEQ ID NO3的位置30至1268組成的氨基酸序列具有至少大約80％相同性的氨基酸序列，其中所述的氨基酸序列具有下列生物學(xué)活性八氫番茄紅素脫氫酶(PD)活性，八氫番茄紅素合酶(PS)活性，和番茄紅素環(huán)化酶(LC)活性；b.與SEQ ID NO5具有至少大約80％相同性的氨基酸序列，其中所述的氨基酸序列具有八氫番茄紅素脫氫酶(PD)活性；c.與SEQ ID NO7具有至少大約80％相同性的氨基酸序列，其中所述的氨基酸序列具有八氫番茄紅素合酶(PS)活性；和d.與SEQ ID NO9具有至少大約80％相同性的氨基酸序列，其中所述的氨基酸序列具有番茄紅素環(huán)化酶(LC)活性。
4.權(quán)利要求1的分離的蛋白質(zhì)，其中所述的蛋白質(zhì)含有選自由如下組成的組中的氨基酸序列a.與SEQ ID NO3或者與SEQ ID NO3的位置30至1268組成的氨基酸序列具有至少大約95％相同性的氨基酸序列，其中所述的氨基酸序列具有下列生物學(xué)活性八氫番茄紅素脫氫酶(PD)活性，八氫番茄紅素合酶(PS)活性，和番茄紅素環(huán)化酶(LC)活性；b.與SEQ ID NO5具有至少大約95％相同性的氨基酸序列，其中所述的氨基酸序列具有八氫番茄紅素脫氫酶(PD)活性；c.與SEQ ID NO7具有至少大約95％相同性的氨基酸序列，其中所述的氨基酸序列具有八氫番茄紅素合酶(PS)活性；和d.與SEQ ID NO9具有至少大約95％相同性的氨基酸序列，其中所述的氨基酸序列具有番茄紅素環(huán)化酶(LC)活性。
5.權(quán)利要求1的分離的蛋白質(zhì)，其中所述的蛋白質(zhì)含有選自由SEQ IDNO3，SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9，SEQ ID NO3的位置30至1268組成的氨基酸序列，和其生物活性片段組成的組中的氨基酸序列。
6.權(quán)利要求1的分離的蛋白質(zhì)，其中所述的蛋白質(zhì)含有選自由SEQ IDNO3，SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9，和SEQ ID NO3的位置30至1268組成的氨基酸序列組成的組中的氨基酸序列。
7.權(quán)利要求1的分離的蛋白質(zhì)，其中所述的蛋白質(zhì)含有選自由SEQ IDNO5，SEQ ID NO7和SEQ ID NO9組成的組中的任意兩種氨基酸序列。
8.權(quán)利要求1的分離的蛋白質(zhì)，其中所述的蛋白質(zhì)含有SEQ ID NO5，SEQ ID NO7和SEQ ID NO9。
9.權(quán)利要求1的分離的蛋白質(zhì)，其中所述的分離的蛋白質(zhì)來(lái)自Thraustochytriales微生物。
10.權(quán)利要求1的分離的蛋白質(zhì)，其中所述的分離的蛋白質(zhì)來(lái)自Schizochytrium微生物。
11.一種分離的蛋白質(zhì)，含有選自由如下組成的組中的氨基酸序列a.含有SEQ ID NO5和SEQ ID NO7的氨基酸序列；和b.與(a)的氨基酸序列具有至少大約40％相同性的氨基酸序列，其中所述的氨基酸序列具有下列生物學(xué)活性八氫番茄紅素脫氫酶(PD)活性和八氫番茄紅素合酶(PS)活性。
12.一種分離的抗體，它與選自由SEQ ID NO3，SEQ ID NO5，SEQID NO7，和SEQ ID NO9組成的組中的氨基酸序列選擇性結(jié)合。
13.一種分離的核酸分子，含有選自由如下組成的組中的核酸序列a.編碼選自由SEQ ID NO3，SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQ IDNO9，SEQ ID NO3的位置30至1268組成的氨基酸序列，和任一所述氨基酸序列的生物活性片段組成的組中的氨基酸序列的核酸序列；b.編碼與SEQ TD NO3或者與SEQ ID NO3的位置30至1268組成的氨基酸序列具有至少大約40％相同性的氨基酸序列的核酸序列，其中所述的氨基酸序列具有下列生物學(xué)活性八氫番茄紅素脫氫酶(PD)活性，八氫番茄紅素合酶(PS)活性，和番茄紅素環(huán)化酶(LC)活性；c.編碼與SEQ ID NO5具有至少大約40％相同性的氨基酸序列的核酸序列，其中所述的氨基酸序列具有八氫番茄紅素脫氫酶(PD)活性；d.編碼與SEQ ID NO7具有至少大約40％相同性的氨基酸序列的核酸序列，其中所述的氨基酸序列具有八氫番茄紅素合酶(PS)活性；e.編碼與SEQ ID NO9具有至少大約40％相同性的氨基酸序列的核酸序列，其中所述的氨基酸序列具有番茄紅素環(huán)化酶(LC)活性；和f.與(a)-(e)的核酸序列中的任意一種完全互補(bǔ)的核酸序列。
14.權(quán)利要求13的分離的核酸分子，其中所述的核酸分子含有選自由如下組成的組中的核酸序列a.編碼與SEQ TD NO3或者與SEQ ID NO3的位置30至1268組成的氨基酸序列具有至少大約60％相同性的氨基酸序列的核酸序列，其中所述的氨基酸序列具有下列生物學(xué)活性八氫番茄紅素脫氫酶(PD)活性，八氫番茄紅素合酶(PS)活性，和番茄紅素環(huán)化酶(LC)活性；b.編碼與SEQ ID NO5具有至少大約60％相同性的氨基酸序列的核酸序列，其中所述的氨基酸序列具有八氫番茄紅素脫氫酶(PD)活性；c.編碼與SEQ ID NO7具有至少大約60％相同性的氨基酸序列的核酸序列，其中所述的氨基酸序列具有八氫番茄紅素合酶(PS)活性；和d.編碼與SEQ ID NO9具有至少大約60％相同性的氨基酸序列的核酸序列，其中所述的氨基酸序列具有番茄紅素環(huán)化酶(LC)活性；和e.與(a)-(d)的核酸序列中的任意一種完全互補(bǔ)的核酸序列。
15.權(quán)利要求13的分離的核酸分子，其中所述的核酸分子含有選自由如下組成的組中的核酸序列a.編碼與SEQ TD NO3或者與SEQ ID NO3的位置30至1268組成的氨基酸序列具有至少大約80％相同性的氨基酸序列的核酸序列，其中所述的氨基酸序列具有下列生物學(xué)活性八氫番茄紅素脫氫酶(PD)活性，八氫番茄紅素合酶(PS)活性，和番茄紅素環(huán)化酶(LC)活性；b.編碼與SEQ ID NO5具有至少大約80％相同性的氨基酸序列的核酸序列，其中所述的氨基酸序列具有八氫番茄紅素脫氫酶(PD)活性；c.編碼與SEQ ID NO7具有至少大約80％相同性的氨基酸序列的核酸序列，其中所述的氨基酸序列具有八氫番茄紅素合酶(PS)活性；和d.編碼與SEQ ID NO9具有至少大約80％相同性的氨基酸序列的核酸序列，其中所述的氨基酸序列具有番茄紅素環(huán)化酶(LC)活性；和e.與(a)-(d)的核酸序列中的任意一種完全互補(bǔ)的核酸序列。
16.權(quán)利要求13的分離的核酸分子，其中所述的核酸分子含有選自由如下組成的組中的核酸序列a.編碼與SEQ TD NO3或者與SEQ ID NO3的位置30至1268組成的氨基酸序列具有至少大約95％相同性的氨基酸序列的核酸序列，其中所述的氨基酸序列具有下列生物學(xué)活性八氫番茄紅素脫氫酶(PD)活性，八氫番茄紅素合酶(PS)活性，和番茄紅素環(huán)化酶(LC)活性；b.編碼與SEQ ID NO5具有至少大約95％相同性的氨基酸序列的核酸序列，其中所述的氨基酸序列具有八氫番茄紅素脫氫酶(PD)活性；c.編碼與SEQ ID NO7具有至少大約95％相同性的氨基酸序列的核酸序列，其中所述的氨基酸序列具有八氫番茄紅素合酶(PS)活性；d.編碼與SEQ ID NO9具有至少大約95％相同性的氨基酸序列的核酸序列，其中所述的氨基酸序列具有番茄紅素環(huán)化酶(LC)活性；和e.與(a)-(d)的核酸序列中的任意一種完全互補(bǔ)的核酸序列。
17.權(quán)利要求13的分離的核酸分子，其中所述的核酸分子含有編碼選自由SEQ ID NO3，SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9，和SEQID NO3的位置30至1268組成的氨基酸序列組成的組中的氨基酸序列的核酸序列。
18.權(quán)利要求13的分離的核酸分子，其中所述的核酸序列選自由SEQID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，SEQ ID NO6和SEQ ID NO8組成的組中。
19.權(quán)利要求13的分離的核酸分子，其中所述的核酸序列編碼選自由SEQ ID NO5，SEQ ID NO7和SEQ ID NO9組成的組中的任意兩種氨基酸序列。
20.權(quán)利要求13的分離的核酸分子，其中所述的核酸序列編碼SEQ IDNO5，SEQ ID NO7和SEQ ID NO9。
21.一種重組核酸分子，含有與轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列可操作地相連的分離的核酸分子，所述的分離的核酸分子包含選自由如下組成的組中的核酸序列a.核酸序列，編碼選自由SEQ ID NO3，SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9，SEQ ID NO3的位置30至1268組成的氨基酸序列，和任一所述氨基酸序列的生物活性片段組成的組中的氨基酸序列；b.核酸序列，編碼與SEQ TD NO3或者與SEQ ID NO3的位置30至1268組成的氨基酸序列具有至少大約40％相同性的氨基酸序列，其中所述的氨基酸序列具有下列生物學(xué)活性八氫番茄紅素脫氫酶(PD)活性，八氫番茄紅素合酶(PS)活性，和番茄紅素環(huán)化酶(LC)活性；c.核酸序列，編碼與SEQ ID NO5具有至少大約40％相同性的氨基酸序列，其中所述的氨基酸序列具有八氫番茄紅素脫氫酶(PD)活性；d.核酸序列，編碼與SEQ ID NO7具有至少大約40％相同性的氨基酸序列，其中所述的氨基酸序列具有八氫番茄紅素合酶(PS)活性；和e.核酸序列，編碼與SEQ ID NO9具有至少大約95％相同性的氨基酸序列，其中所述的氨基酸序列具有番茄紅素環(huán)化酶(LC)活性。
22.權(quán)利要求21的重組核酸分子，其中所述的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列是組織特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。
23.權(quán)利要求21的重組核酸分子，還含有靶向序列。
24.用權(quán)利要求21的重組核酸分子轉(zhuǎn)化的重組細(xì)胞。
25.用于通過(guò)生物合成過(guò)程產(chǎn)生類(lèi)胡蘿卜素的遺傳修飾的微生物，所述的微生物用根據(jù)權(quán)利要求21的重組核酸分子轉(zhuǎn)化。
26.用于通過(guò)生物合成過(guò)程產(chǎn)生類(lèi)胡蘿卜素的遺傳修飾的植物，所述的植物用根據(jù)權(quán)利要求21的重組核酸分子轉(zhuǎn)化。
27.用于通過(guò)生物合成過(guò)程產(chǎn)生類(lèi)胡蘿卜素的遺傳修飾的微生物，其中所述的微生物包含編碼胡蘿卜素合酶的核酸分子且其中編碼所述的胡蘿卜素合酶的所述核酸分子進(jìn)行了修飾以提高所述胡蘿卜素合酶的表達(dá)或生物學(xué)活性，所述的胡蘿卜素合酶含有選自由如下組成的組中的氨基酸序列a.選自由SEQ ID NO3，SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9，和SEQ ID NO3的位置30至1268組成的氨基酸序列組成的組中的氨基酸序列；b.與SEQ ID NO3或者與SEQ ID NO3的位置30至1268組成的氨基酸序列具有至少大約40％相同性的氨基酸序列，其中所述的氨基酸序列具有下列生物學(xué)活性八氫番茄紅素脫氫酶(PD)活性，八氫番茄紅素合酶(PS)活性，和番茄紅素環(huán)化酶(LC)活性；c.與SEQ ID NO5具有至少大約40％相同性的氨基酸序列，其中所述的氨基酸序列具有八氫番茄紅素脫氫酶(PD)活性；d.與SEQ ID NO7具有至少大約40％相同性的氨基酸序列，其中所述的氨基酸序列具有八氫番茄紅素合酶(PS)活性；和e.與SEQ ID NO9具有至少大約40％相同性的氨基酸序列，其中所述的氨基酸序列具有番茄紅素環(huán)化酶(LC)活性。
28.權(quán)利要求27的遺傳修飾的微生物，其中編碼胡蘿卜素合酶的所述核酸分子是所述微生物中的內(nèi)源性基因。
29.權(quán)利要求27的遺傳修飾的微生物，其中所述的微生物用編碼所述胡蘿卜素合酶的核酸分子轉(zhuǎn)化。
30.權(quán)利要求29的遺傳修飾的微生物，其中所述的微生物是Thraustochytriales微生物。
31.權(quán)利要求29的遺傳修飾的微生物，其中所述的微生物是Schizochytrium。
32.權(quán)利要求27的遺傳修飾的微生物，其中所述的微生物含有編碼所述胡蘿卜素合酶的內(nèi)源性基因且用編碼所述胡蘿卜素合酶的重組核酸分子進(jìn)行了轉(zhuǎn)化，其中所述的基因和所述的重組核酸分子之一或兩者進(jìn)行了修飾以提高所述胡蘿卜素合酶的表達(dá)或生物學(xué)活性。
33.權(quán)利要求27的遺傳修飾的微生物，其中所述的微生物是Thraustochytriales微生物。
34.權(quán)利要求27的遺傳修飾的微生物，其中所述的微生物是Schizochytrium微生物。
35.一種包含遺傳修飾的微生物的生物量，該微生物含有編碼胡蘿卜素合酶的核酸分子且其中編碼所述的胡蘿卜素合酶的所述核酸分子進(jìn)行了修飾以提高所述胡蘿卜素合酶的表達(dá)或生物學(xué)活性，所述的胡蘿卜素合酶含有選自由如下組成的組中的氨基酸序列a.選自由SEQ ID NO3，SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9，和SEQ ID NO3的位置30至1268組成的氨基酸序列組成的組中的氨基酸序列；b.與SEQ ID NO3或者與SEQ ID NO3的位置30至1268組成的氨基酸序列具有至少大約40％相同性的氨基酸序列，其中所述的氨基酸序列具有下列生物學(xué)活性八氫番茄紅素脫氫酶(PD)活性，八氫番茄紅素合酶(PS)活性，和番茄紅素環(huán)化酶(LC)活性；c.與SEQ ID NO5具有至少大約40％相同性的氨基酸序列，其中所述的氨基酸序列具有八氫番茄紅素脫氫酶(PD)活性；d.與SEQ ID NO7具有至少大約40％相同性的氨基酸序列，其中所述的氨基酸序列具有八氫番茄紅素合酶(PS)活性；和e.與SEQ ID NO9具有至少大約40％相同性的氨基酸序列，其中所述的氨基酸序列具有番茄紅素環(huán)化酶(LC)活性。
36.含有權(quán)利要求35的生物量的食品。
37.含有權(quán)利要求35的生物量的藥品。
38.通過(guò)生物合成過(guò)程產(chǎn)生類(lèi)胡蘿卜素的方法，包含在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)提高了胡蘿卜素合酶的表達(dá)或生物學(xué)活性的遺傳修飾的微生物，所述的胡蘿卜素合酶含有選自由如下組成的組中的氨基酸序列a.選自由SEQ ID NO3，SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9，SEQ ID NO3的位置30至1268組成的氨基酸序列，和其生物學(xué)活性片段組成的組中的氨基酸序列；b.與SEQ ID NO3或者與SEQ ID NO3的位置30至1268組成的氨基酸序列具有至少大約40％相同性的氨基酸序列，其中所述的氨基酸序列具有下列生物學(xué)活性八氫番茄紅素脫氫酶(PD)活性，八氫番茄紅素合酶(PS)活性，和番茄紅素環(huán)化酶(LC)活性；c.與SEQ ID NO5具有至少大約40％相同性的氨基酸序列，其中所述的氨基酸序列具有八氫番茄紅素脫氫酶(PD)活性；d.與SEQ ID NO7具有至少大約40％相同性的氨基酸序列，其中所述的氨基酸序列具有八氫番茄紅素合酶(PS)活性；和e.與SEQ ID NO9具有至少大約40％相同性的氨基酸序列，其中所述的氨基酸序列具有番茄紅素環(huán)化酶(LC)活性。
39.權(quán)利要求38的方法，其中所述的微生物用編碼所述胡蘿卜素合酶的重組核酸分子進(jìn)行了轉(zhuǎn)化。
40.權(quán)利要求39的方法，其中所述的微生物是Thraustochytriales微生物。
41.權(quán)利要求39的方法，其中所述的微生物是Schizochytrium。
42.權(quán)利要求38的方法，其中所述的微生物含有編碼所述胡蘿卜素合酶的內(nèi)源性基因，且其中所述的基因進(jìn)行了遺傳修飾以提高所述的胡蘿卜素合酶的表達(dá)或生物學(xué)活性。
43.權(quán)利要求38的方法，其中所述的微生物含有編碼所述胡蘿卜素合酶的內(nèi)源性基因且用編碼所述胡蘿卜素合酶的重組核酸分子進(jìn)行了轉(zhuǎn)化，其中所述的基因和所述的重組核酸分子之一或兩者進(jìn)行了修飾以提高所述胡蘿卜素合酶的表達(dá)或至少一種生物學(xué)活性。
44.權(quán)利要求38的方法，其中所述的微生物是Thraustochytriales微生物。
45.權(quán)利要求38的方法，其中所述的微生物是Schizochytrium。
46.通過(guò)生物合成過(guò)程產(chǎn)生類(lèi)胡蘿卜素的方法，包括使經(jīng)過(guò)重組核酸分子轉(zhuǎn)化的遺傳修飾的植物生長(zhǎng)，所述重組核酸分子編碼一種蛋白質(zhì)，所述的蛋白質(zhì)含有選自由如下組成的組中的氨基酸序列a.選自由SEQ ID NO3，SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9，SEQ ID NO3的位置30至1268組成的氨基酸序列，和其生物學(xué)活性片段組成的組中的氨基酸序列；b.與SEQ ID NO3或者與SEQ ID NO3的位置30至1268組成的氨基酸序列具有至少大約40％相同性的氨基酸序列，其中所述的氨基酸序列具有下列生物學(xué)活性八氫番茄紅素脫氫酶(PD)活性，八氫番茄紅素合酶(PS)活性，和番茄紅素環(huán)化酶(LC)活性；c.與SEQ ID NO5具有至少大約40％相同性的氨基酸序列，其中所述的氨基酸序列具有八氫番茄紅素脫氫酶(PD)活性；d.與SEQ ID NO7具有至少大約40％相同性的氨基酸序列，其中所述的氨基酸序列具有八氫番茄紅素合酶(PS)活性；和e.與SEQ ID NO9具有至少大約40％相同性的氨基酸序列，其中所述的氨基酸序列具有番茄紅素環(huán)化酶(LC)活性。
47.權(quán)利要求46的方法，其中所述的重組核酸分子編碼具有八氫番茄紅素脫氫酶(PD)活性和八氫番茄紅素合酶(PS)活性，但沒(méi)有番茄紅素環(huán)化酶(LC)活性的蛋白質(zhì)。
48.一種寡核苷酸，包含核酸序列的至少12個(gè)連續(xù)核苷酸，所述核酸序列選自由SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，和與其完全互補(bǔ)的核酸序列組成的組。
49.一種缺乏色素形成的遺傳修飾的微生物，其中所述的微生物進(jìn)行了遺傳修飾以選擇性缺失或失活胡蘿卜素合酶基因或其編碼功能域的部分，其中所述的胡蘿卜素合酶基因包含選自由如下組成的組中的核酸序列a.編碼SEQ ID NO3的核酸序列；和b.編碼與SEQ ID NO3具有至少大約40％相同性的氨基酸序列的核酸序列，其中具有所述氨基酸序列的蛋白質(zhì)具有選自由八氫番茄紅素脫氫酶(PD)活性，八氫番茄紅素合酶(PS)活性，和番茄紅素環(huán)化酶(LC)活性組成的組中的一種生物學(xué)活性。
50.權(quán)利要求49的遺傳修飾的微生物，其中所述的胡蘿卜素合酶基因包含SEQ ID NO3代表的核酸序列。
51.權(quán)利要求49的遺傳修飾的微生物，其中所述的微生物是Thraustochytriales微生物。
52.權(quán)利要求49的遺傳修飾的微生物，其中所述的微生物是Schizochytrium。
53.權(quán)利要求49的遺傳修飾的微生物，其中所述的胡蘿卜素合酶基因在調(diào)控區(qū)進(jìn)行了修飾以抑制該基因的表達(dá)。
54.權(quán)利要求49的遺傳修飾的微生物，其中所述的胡蘿卜素合酶基因被部分或完全缺失使得該微生物不能產(chǎn)生有功能的胡蘿卜素合酶。
55.權(quán)利要求49的遺傳修飾的微生物，其中所述的胡蘿卜素合酶基因用一種核酸序列通過(guò)定向同源重組進(jìn)行了突變或失活，所用的核酸序列與所述胡蘿卜素合酶基因雜交且包含破壞所述胡蘿卜素合酶基因編碼區(qū)的異源性核酸序列。
56.一種生物量，含有與相同種的野生型微生物相比色素形成減少的遺傳修飾的微生物，其中所述的微生物進(jìn)行了遺傳修飾以選擇性缺失或失活胡蘿卜素合酶基因，其中所述的胡蘿卜素合酶基因包含選自由如下組成的組中的核酸序列a.編碼SEQ ID NO3的核酸序列；和b.編碼與SEQ ID NO3具有至少大約40％相同性的氨基酸序列的核酸序列，其中具有所述氨基酸序列的蛋白質(zhì)具有選自由八氫番茄紅素脫氫酶(PD)活性，八氫番茄紅素合酶(PS)活性，和番茄紅素環(huán)化酶(LC)活性組成的組中的一種生物學(xué)活性。
57.權(quán)利要求56的生物量，其中所述的胡蘿卜素合酶基因包含編碼SEQ ID NO3的核酸序列。
58.權(quán)利要求56的生物量，其中所述的微生物來(lái)自Thraustochytriales目。
59.含有權(quán)利要求56的生物量的食品。
60.從生物合成過(guò)程產(chǎn)生缺乏色素形成的脂類(lèi)的方法，包括在有效產(chǎn)生所述脂類(lèi)的條件下培養(yǎng)遺傳修飾的微生物，其中所述的微生物進(jìn)行了遺傳修飾以選擇性缺失或失活胡蘿卜素合酶基因，其中所述的胡蘿卜素合酶基因包含選自由如下組成的組中的核酸序列a.編碼SEQ ID NO3的核酸序列；和b.編碼與SEQ ID NO3具有至少大約40％相同性的氨基酸序列的核酸序列，其中具有所述氨基酸序列的蛋白質(zhì)具有選自由八氫番茄紅素脫氫酶(PD)活性，八氫番茄紅素合酶(PS)活性，和番茄紅素環(huán)化酶(LC)活性組成的組中的一種生物學(xué)活性。
61.權(quán)利要求60的方法，其中所述的微生物來(lái)自Thraustochytriales目。
62.從生物合成過(guò)程回收缺乏色素形成的脂類(lèi)的方法，包括從遺傳修飾的微生物的培養(yǎng)物回收脂類(lèi)，其中所述的微生物進(jìn)行了遺傳修飾以選擇性缺失或失活胡蘿卜素合酶基因，其中所述的胡蘿卜素合酶基因包含選自由如下組成的組中的核酸序列a.編碼SEQ ID NO3的核酸序列；和b.編碼與SEQ ID NO3具有至少大約40％相同性的氨基酸序列的核酸序列，其中具有所述氨基酸序列的蛋白質(zhì)具有選自由八氫番茄紅素脫氫酶(PD)活性，八氫番茄紅素合酶(PS)活性，和番茄紅素環(huán)化酶(LC)活性組成的組中的一種生物學(xué)活性。
63.權(quán)利要求62的方法，其中所述的微生物來(lái)自Thraustochytriales目。
64.從遺傳修飾的微生物的培養(yǎng)物回收的缺乏色素形成的脂類(lèi)，其中所述的微生物進(jìn)行了遺傳修飾以選擇性缺失或失活胡蘿卜素合酶基因，其中所述的胡蘿卜素合酶基因包含選自由如下組成的組中的核酸序列a.編碼SEQ ID NO3的核酸序列；和b.編碼與SEQ ID NO3具有至少大約40％相同性的氨基酸序列的核酸序列，其中具有所述氨基酸序列的蛋白質(zhì)具有選自由八氫番茄紅素脫氫酶(PD)活性，八氫番茄紅素合酶(PS)活性，和番茄紅素環(huán)化酶(LC)活性組成的組中的一種生物學(xué)活性。
65.權(quán)利要求64的脂類(lèi)，其中所述的微生物來(lái)自Thraustochytriales目。
66.含有權(quán)利要求64的脂類(lèi)的產(chǎn)品。
67.權(quán)利要求66的產(chǎn)品，它是一種食品。
68.權(quán)利要求66的產(chǎn)品，它是一種藥品。
69.一種產(chǎn)生類(lèi)胡蘿卜素的方法，包含在足以產(chǎn)生類(lèi)胡蘿卜素的條件下將底物與分離的胡蘿卜素合酶接觸；其中所述的分離的胡蘿卜素合酶含有選自由如下組成的組中的氨基酸序列a.選自由SEQ ID NO3，SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9，SEQ ID NO3的位置30至1268組成的氨基酸序列，和其生物學(xué)活性片段組成的組中的氨基酸序列；b.與SEQ ID NO3或者與SEQ ID NO3的位置30至1268組成的氨基酸序列具有至少大約40％相同性的氨基酸序列，其中所述的氨基酸序列具有下列生物學(xué)活性八氫番茄紅素脫氫酶(PD)活性，八氫番茄紅素合酶(PS)活性，和番茄紅素環(huán)化酶(LC)活性；c.與SEQ ID NO5具有至少大約40％相同性的氨基酸序列，其中所述的氨基酸序列具有八氫番茄紅素脫氫酶(PD)活性；d.與SEQ ID NO7具有至少大約40％相同性的氨基酸序列，其中所述的氨基酸序列具有八氫番茄紅素合酶(PS)活性；和e.與SEQ ID NO9具有至少大約40％相同性的氨基酸序列，其中所述的氨基酸序列具有番茄紅素環(huán)化酶(LC)活性。
全文摘要
本文描述了一種來(lái)自Schizochytrium的新型三結(jié)構(gòu)域基因，稱(chēng)為胡蘿卜素合酶，它編碼具有三種不同酶活性的蛋白質(zhì)；即八氫番茄紅素脫氫酶(PD)，八氫番茄紅素合酶(PS)，和番茄紅素環(huán)化酶(LC)。還描述了分離的編碼該胡蘿卜素合酶的基因，其同源物，由該基因編碼的酶，其生物學(xué)活性部分和同源物，重組核酸分子，經(jīng)遺傳修飾以增加或減少該基因作用的微生物和植物，使用本文所述的胡蘿卜素合酶知識(shí)產(chǎn)生類(lèi)胡蘿卜素及其衍生物的方法或產(chǎn)生缺乏色素形成的微生物和脂類(lèi)產(chǎn)品的方法。
文檔編號(hào)C12N1/21GK1668754SQ03816805
公開(kāi)日2005年9月14日 申請(qǐng)日期2003年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月14日
發(fā)明者克雷格·A·韋弗, 詹姆斯·G·梅茨, 杰里·M·庫(kù)納, 小弗蘭克·H·奧弗頓 申請(qǐng)人:馬泰克生物科學(xué)公司