專利名稱：將突變轉(zhuǎn)移到靶核酸中的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及將突變導(dǎo)入靶核酸的方法，該方法可用于將突變導(dǎo)入基因中和修復(fù)基因中突變。
背景技術(shù)：
根據(jù)現(xiàn)今用于基因治療的方法，病毒載體等用于將基因轉(zhuǎn)化到由于細(xì)胞中基因的缺失或突變而功能異常的細(xì)胞中。從而，細(xì)胞的正常功能被恢復(fù)，并且細(xì)胞可以發(fā)揮其內(nèi)在作用。這可稱為基因替代治療。
使用病毒載體的基因轉(zhuǎn)移具有如下問題。突變基因仍然按照原樣在染色體上。如果來自突變基因的突變蛋白的結(jié)構(gòu)與來自正常基因的正常蛋白的結(jié)構(gòu)類似，那么突變蛋白可能干擾正常蛋白的功能。
最近，關(guān)注基因靶向方法，其中細(xì)胞中目標(biāo)基因中核苷酸不像病毒載體介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移被轉(zhuǎn)變。Thomas Jefferson University的Eric B.Kmiec開發(fā)的嵌合體形成方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.93，p.2071-2076(1996))是基因靶向方法的一個具體實例。該方法利用了嵌合寡核苷酸，其中含有將要改變的核苷酸的部分由DNA組成，并且RNA伸長部分置于兩個末端用于定位。RNA-DNA結(jié)合比DNA-DNA結(jié)合更強。從而，如果這種嵌合核苷酸被轉(zhuǎn)移到細(xì)胞，兩端的RNA核苷酸序列將尋找細(xì)胞DNA中相應(yīng)的核苷酸序列以形成雙鏈體。然后由于錯配修復(fù)的結(jié)果突變被導(dǎo)入期望的位點。嵌合寡核苷酸具有復(fù)雜的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。特別地，該結(jié)果的保持需要使用額外的八個胸腺嘧啶殘基，其對結(jié)合目標(biāo)DNA的能力具有很大的負(fù)作用。
O.Igoucheva等已經(jīng)開發(fā)了單鏈寡核苷酸(此后也稱作ss oligo)形成方法(Gene Therapy，Vol.8，p.391-399(2001))。根據(jù)該方法使用有幾十個核苷酸的寡核苷酸。對應(yīng)于靶核酸中將被突變的核苷酸的核苷酸被置于寡核苷酸的中心，一些不易被細(xì)胞內(nèi)核酸酶降解的甲基化尿嘧啶殘基連接到兩端。
上面提到的兩種誘變方法的修復(fù)效率仍然較低。單鏈核苷酸(ssoligo)形成方法(其在兩種方法中具有更好的修復(fù)效率)仍然具有明顯的缺陷。特別地，該方法不能用于結(jié)合靶核酸后錯配修復(fù)時同時修復(fù)雙鏈DNA的有義和反義鏈上突變核苷酸。僅僅一個突變的核苷酸被修復(fù)，而互補鏈上剩下的突變核苷酸需要另外通過細(xì)胞的錯配修復(fù)機制修復(fù)。
與目標(biāo)DNA沒有關(guān)系的序列被包括在根據(jù)Kmiec等的嵌合寡核苷酸(嵌合oligo)中以保持其環(huán)狀結(jié)構(gòu)。不相關(guān)序列占該oligo序列的百分之十以上。這降低了靶向嵌合oligo的目標(biāo)DNA的活性。
另一個要點是考慮到修復(fù)機制，使用嵌合oligo或ss oligo和將要使用的寡核苷酸結(jié)構(gòu)不可能同時修復(fù)相距較遠(yuǎn)的兩個或多個核苷酸。如果要修復(fù)位于遠(yuǎn)處的兩個或多個突變核苷酸，或者突變將被導(dǎo)入位于遠(yuǎn)處的兩個或多個位點，必須進行幾輪寡核苷酸轉(zhuǎn)移后進行克隆。上面的方法自然需要許多時間和勞動。此外，現(xiàn)今將DNA轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中的技術(shù)極大地傷害細(xì)胞。從而，難以得到保留期望的功能的存活細(xì)胞。
如果染色體上突變寡核苷酸將在細(xì)胞中被修復(fù)，用于修復(fù)的DNA僅僅被轉(zhuǎn)移到胞質(zhì)中。由于根據(jù)濃度梯度的自由擴散，用于修復(fù)的DNA移動到細(xì)胞核中。在這種情況下，必須將大量修復(fù)DNA分子轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中。然而，僅僅一些分子最終進入細(xì)胞核，導(dǎo)致突變修復(fù)的效率不能令人滿意。
隨著基因治療的發(fā)展，期望能夠同時修復(fù)多個核苷酸和將修復(fù)用的DNA向細(xì)胞核活躍轉(zhuǎn)移的高效方法代替上面提到的基于復(fù)雜機制的效率較低的修復(fù)方法。
發(fā)明概述作為實現(xiàn)上面提到的目的的深入研究的結(jié)果，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，使用含有反向重復(fù)的DNA，靶核酸中的核苷酸可被有效突變。從而，完成了本發(fā)明。
本發(fā)明的第一個方面涉及將突變導(dǎo)入靶核酸的核苷酸序列的方法，該方法包括步驟(1)制備含有反向重復(fù)序列的DNA，其中該含有反向重復(fù)序列的DNA的核苷酸序列與靶核苷酸同源并且含有將要被導(dǎo)入靶核酸的突變；和(2)將含有反向重復(fù)序列的DNA轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中。
根據(jù)第一個方面，含有反向重復(fù)序列的DNA可以含有具有核運輸信號的蛋白質(zhì)的結(jié)合基序序列，如轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合基序序列。該DNA可含有適當(dāng)?shù)男揎椇塑账帷?br> 根據(jù)第一方面，靶核酸可以是位于胞質(zhì)中的核酸或者位于細(xì)胞核中的核酸。含有反向重復(fù)序列的DNA可以是雙鏈DNA或者單鏈DNA。
根據(jù)第一方面的方法，多個突變可同時導(dǎo)入靶核酸。將要導(dǎo)入靶核酸的突變?yōu)槔绾塑账岬奶娲?、缺失?或插入。
本發(fā)明的第二方面涉及通過第一方面的方法將突變導(dǎo)入靶核酸的試劑盒，該試劑盒含有具有反向重復(fù)序列的DNA，其中含有反向重復(fù)序列的DNA的核苷酸序列與靶核酸同源并且含有將要導(dǎo)入靶核酸的突變。
第二方面的試劑盒中所含具有反向重復(fù)序列的DNA可以具有轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合基序序列或適當(dāng)?shù)男揎椇塑账帷：蟹聪蛑貜?fù)序列的DNA可以是雙鏈或單鏈DNA。
附圖簡述

圖1是質(zhì)粒示意圖，每個質(zhì)粒含有按照本發(fā)明制備的反向重復(fù)序列。
發(fā)明詳述對于根據(jù)本發(fā)明的“靶核酸”沒有特別限制。可以包括期望導(dǎo)入突變的任何核酸。例如，本發(fā)明可用于將突變導(dǎo)入胞內(nèi)DNA。位于胞質(zhì)中的DNA(附加體DNA、質(zhì)粒、線粒體DNA等)或位于細(xì)胞核中的DNA(染色體DNA)可作為靶核酸。
對于將要導(dǎo)入根據(jù)本發(fā)明的靶核酸的突變也沒有特別限制?？赡軐?dǎo)入突變?nèi)鐗A基替代、缺失或插入。在該情況下，具有這種突變的核苷酸序列可以包括在含有將要使用的反向重復(fù)序列的DNA。
當(dāng)然，根據(jù)本發(fā)明的突變的導(dǎo)入不僅僅限于將突變導(dǎo)入正常核苷酸序列，而且包括一種實施方案，其中具有天然發(fā)生的突變的核苷酸序列被恢復(fù)到正常序列。
根據(jù)本發(fā)明使用的含有反向重復(fù)序列的DNA(此后也稱為反向重復(fù)DNA)為具有與靶核酸同源的核苷酸序列的DNA并且含有將要導(dǎo)入靶核酸的突變。如此處所用的，“同源的”指能夠與靶核酸形成雙鏈體的核苷酸序列或者與之互補的鏈，并且不表示核苷酸序列完全匹配。即，其表示通過堿基配對足夠與靶核酸形成雙鏈體的核苷酸序列。
對含有反向重復(fù)序列的DNA的制備方法沒有特別限制?？墒褂没瘜W(xué)合成、酶促合成(核酸擴增反應(yīng)，等)或者生物合成(其中使用能夠自我復(fù)制的核酸(例如質(zhì)粒)的方法)。含有反向重復(fù)序列的DNA中靶核酸的有義鏈序列和反義鏈序列串連排列。隨機序列(間隔子)可插入這些序列中，只要所得DNA可用于將突變導(dǎo)入靶核酸中。
根據(jù)本發(fā)明可以使用含有反向重復(fù)序列的雙鏈DNA。還可使用通過雙鏈DNA變性得到的單鏈DNA。由于這種單鏈DNA的有義鏈部分和反義鏈部分含有相互互補的核苷酸序列，DNA可以由于這些部分的堿基配對而呈現(xiàn)發(fā)夾結(jié)構(gòu)。根據(jù)本發(fā)明還可使用該形式中的單鏈DNA。
例如，根據(jù)本發(fā)明可制備含有反向重復(fù)序列并形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的這種DNA并制備如在美國專利號5,643,762、5,714,323和6,043,028中描述的稱為slDNA的單鏈DNA。
根據(jù)本發(fā)明的方法，可以在靶核酸中兩個或多個位點上同時導(dǎo)入突變。認(rèn)為只要可能，優(yōu)選地制備含有反向重復(fù)序列的DNA以用于該目的。DNA同源重組修復(fù)發(fā)生在細(xì)胞生長周期中DNA合成期(S期)。在從親本DNA復(fù)制成子DNA的過程中，親本DNA的螺旋解開并形成復(fù)制叉。在這時可同時結(jié)合復(fù)制叉部分中DNA的有義和反義鏈的DNA的靶向活性應(yīng)該是高的。從而，本發(fā)明人制備了含有目標(biāo)DNA的有義和反義鏈序列的單鏈DNA，即可以結(jié)合目標(biāo)DNA的有義和反義鏈的單鏈反向重復(fù)DNA。
首先在制備方法中構(gòu)建含有反向重復(fù)DNA插入片段的質(zhì)粒，其中兩個相同的基因或其片段以相反方向排列。構(gòu)建如實施例2中描述的質(zhì)粒的方法例舉了這種方法。通過培養(yǎng)用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞得到大量該質(zhì)粒。利用質(zhì)粒中插入片段兩端的限制酶位點通過從載體上切割反向重復(fù)DNA插入片段可以得到反向重復(fù)DNA。備選地，通過PCR使用質(zhì)粒作為模板可以擴增反向重復(fù)DNA。
盡管不旨在限制本發(fā)明，通常優(yōu)選地構(gòu)建一種質(zhì)粒，將要插入反向重復(fù)DNA中的該質(zhì)粒的基因或其片段長度為500bp到1500bp。如果長度小于500bp，可能難以將兩個相同DNA片段以相反方向插入載體質(zhì)粒中。在該情況下，目標(biāo)DNA可以使用不同方法(例如化學(xué)和或酶促方法)合成。
根據(jù)本發(fā)明可以使用下面的反向重復(fù)DNA。該DNA含有十個核苷酸或更多，優(yōu)選地幾百核苷酸或更多的核苷酸序列，位于將要導(dǎo)入突變的靶核酸位點的上游和下游。結(jié)果，可容易地發(fā)生同源重組。
如果使用含有根據(jù)本發(fā)明的反向重復(fù)序列的DNA將突變導(dǎo)入靶核酸中(例如，用于糾正基因中的突變核苷酸)，可以如下修復(fù)突變核苷酸。制備含有野生型基因序列的反向重復(fù)DNA，該DNA在對應(yīng)于突變核苷酸的位點含有正常核苷酸。然后使用公知的DNA轉(zhuǎn)移方法，如磷酸鈣方法、電穿孔方法或脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法將該DNA轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中。
另一方面，如果突變將被導(dǎo)入野生型基因中，可以如下將突變導(dǎo)入靶基因中。制備含有將被導(dǎo)入該基因的核苷酸(核苷酸序列)的反向重復(fù)DNA，然后使用上述DNA轉(zhuǎn)移方法將該DNA轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中。
根據(jù)本發(fā)明的含有反向重復(fù)序列的DNA的5’末端和3’末端可以被保護以防止核酸酶的作用以便防止DNA被核酸酶降解。盡管不旨在限制本發(fā)明，例如，通過物理或化學(xué)環(huán)化DNA實現(xiàn)對末端的保護。備選地，DNA中可包括修飾核苷酸如修飾脫氧核糖核苷酸、修飾核糖核苷酸或LNA(WO 99/14226)。優(yōu)選地，通過插入甲基化核糖核苷酸、硫化脫氧核糖核苷酸等保護末端。通過化學(xué)方法，或者下面實施例中描述的酶學(xué)方法可以將核苷酸插入到含有反向重復(fù)序列的DNA的末端部分。
根據(jù)本發(fā)明使用的含有反向重復(fù)序列的DNA可以含有具有核運輸信號的蛋白質(zhì)的結(jié)合基序序列，例如能夠結(jié)合該蛋白質(zhì)的DNA序列。
對可根據(jù)本發(fā)明使用的具有核運輸信號的蛋白質(zhì)沒有特別限制。可以使用天然存在的或人工蛋白質(zhì)。其實例包括轉(zhuǎn)錄因子、SV40大T抗原、組蛋白、核纖溶酶和雙鏈RNA-結(jié)合蛋白NF90。此外，根據(jù)本發(fā)明可使用含有如Biochim.Biophys.Acta，Vol.1071，p.83-101(1991)中描述的核運輸信號的各種蛋白質(zhì)。
如果核運輸信號的蛋白質(zhì)能夠結(jié)合特定DNA序列，那么含有根據(jù)本發(fā)明的反向重復(fù)序列的DNA可包括該蛋白質(zhì)的結(jié)合基序序列。
對可根據(jù)本發(fā)明使用的結(jié)合基序序列沒有特別限制。例如，根據(jù)本發(fā)明可使用能夠結(jié)合具有核運輸信號的蛋白質(zhì)的序列，該核運輸信號在將要導(dǎo)入突變的細(xì)胞中表達。即使含有核運輸信號的蛋白質(zhì)不具有DNA結(jié)合位點，或者不知道具有結(jié)合位點，通過制備含有適當(dāng)DNA結(jié)合序列和核運輸信號的嵌合蛋白質(zhì)根據(jù)本發(fā)明使用該蛋白質(zhì)。
如果具有核運輸信號的蛋白質(zhì)在將要導(dǎo)入突變的細(xì)胞中表達，含有該蛋白質(zhì)的結(jié)合基序序列的含有反向重復(fù)序列的DNA被轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中。然后，被轉(zhuǎn)移的DNA結(jié)合該蛋白質(zhì)并被運輸?shù)郊?xì)胞核，并且目標(biāo)突變可被導(dǎo)入染色體DNA中。如果具有核運輸信號的蛋白質(zhì)不在將要導(dǎo)入突變的細(xì)胞中表達，或者是人工制備的蛋白質(zhì)，那么可以通過將該蛋白質(zhì)或編碼該蛋白質(zhì)的基因轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中實施本發(fā)明的方法。對將該蛋白質(zhì)或編碼該蛋白質(zhì)的基因轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中的方法沒有特別限制?？梢允褂霉椒ㄈ缙渲惺褂弥|(zhì)體等的方法，或者其中使用質(zhì)粒載體、病毒載體等的方法。該蛋白質(zhì)或編碼該蛋白質(zhì)的基因可以共轉(zhuǎn)移到含有具有該蛋白質(zhì)的結(jié)合基序序列的反向重復(fù)序列DNA的細(xì)胞中。
能夠結(jié)合優(yōu)選地根據(jù)本發(fā)明使用的具有核運輸信號的蛋白質(zhì)的序列的實例是能夠結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子的DNA序列。如此處所用的，轉(zhuǎn)錄因子指影響通過RNA聚合酶從DNA到RNA的轉(zhuǎn)錄效率的因子?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明使用的轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合基序序列的實例包括，但不限于，能夠結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子如NF-κB、Sp1、AP1、NF-IL6(C/EBPβ)、AP2、Oct-1、SRF和Ets-1的序列。例如轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合基序序列在下面文獻中描述Eur.J.Biochem，Vol.268，p.1828-1836(2001)；J.Biol.Chem.，Vol.263，p.3372-3379(1998)；Cell，Vol.49，p.741-752(1987)；EMBO J.，Vol.9，p.1897-1906(1990)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.88，p.7948-7952(1991)；Genes Dev.，Vol.2，p.1582-1599(1988)；NucleicAcids Res.，Vol.20，p.3297-3303(1992)；Genes Dev.，Vol.4，p.1451-1453(1990)。
對將要包括在根據(jù)本發(fā)明的含有反向重復(fù)序列的DNA中的結(jié)合基序序列的拷貝數(shù)沒有特別限制。可以使用該序列的單拷貝或多拷貝。對該序列的位置也沒有特別限制。其可位于DNA的5’-或3’-末端部分。例如，5’-或3’-末端部分中可包含結(jié)合基序序列的兩個或多個拷貝。優(yōu)選地，結(jié)合基序序列被插入到反向重復(fù)序列部分的中間，即重復(fù)序列之間。
具有含有核運輸信號的蛋白質(zhì)的結(jié)合基序的反向重復(fù)序列的DNA可被活躍地運輸?shù)郊?xì)胞核中。從而，可高度有效地將突變導(dǎo)入到染色體DNA或突變修復(fù)中。
本發(fā)明方法可用于敲除基因。例如，在該情況下，通過在啟動密碼子“ATG”中一個或兩個核苷酸替代干擾向蛋白質(zhì)的翻譯。備選地，通過在目標(biāo)基因中適當(dāng)位置導(dǎo)入終止密碼子可以抑制全長翻譯產(chǎn)物的產(chǎn)生。此外，通過制備反向重復(fù)DNA可以實現(xiàn)基因敲除，在該DNA中一個或兩個核苷酸被插入(或從中缺失)靶基因的核苷酸序列，并利用其在靶基因中蛋白質(zhì)編碼區(qū)的核苷酸序列中導(dǎo)致移碼。例如，期望突變基因起始密碼子中的一個核苷酸、距離起始密碼子2-30個核苷酸內(nèi)的一個核苷酸、編碼組成酶的活性位點(對于酶蛋白)的一個氨基酸殘基的一個核苷酸，或者編碼決定熒光性的氨基酸殘基的一個核苷酸(對于發(fā)熒光蛋白)。
本發(fā)明最重要的特征是其可同時用于修復(fù)位于遠(yuǎn)處的兩個或多個突變核苷酸。使用反向重復(fù)DNA可以以類似于修復(fù)單個突變核苷酸的方式修復(fù)多個突變。這種DNA由數(shù)百到數(shù)千核苷酸組成并且在數(shù)百到數(shù)千核苷酸區(qū)域中含有修復(fù)靶核酸中多個突變核苷酸的核苷酸。例如，可以如實施例5中描述一次修復(fù)基因中相距約200個核苷酸的兩個突變核苷酸。
在上面提到的實施方案中，其中突變被導(dǎo)入兩個或多個位點，關(guān)于位點之間的距離沒有特別限制。這些位點可以相隔數(shù)百核苷酸。考慮到誘變效率，這些位點優(yōu)選地位于200個核苷酸以內(nèi)，更優(yōu)選地，100個核苷酸內(nèi)，最優(yōu)選地30個核苷酸內(nèi)。
本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明用于導(dǎo)入突變的試劑盒。在一個實施方案中，該試劑盒含有用于將突變導(dǎo)入靶核酸的含有反向重復(fù)序列的DNA。此外，該試劑盒可含有將DNA轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中的試劑。
此外，其中根據(jù)本發(fā)明的方法突變被導(dǎo)入基因中的細(xì)胞可以被移植到活體中。從而，可以進行基因治療，其中突變基因或者其突變已經(jīng)被修復(fù)的基因在體內(nèi)表達。
細(xì)胞的實例包括，但不限于，血細(xì)胞(造血細(xì)胞、造血干細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、臍帶血細(xì)胞、外周血干細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、B細(xì)胞、T細(xì)胞，等)、成纖維細(xì)胞、成神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、成肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、癌細(xì)胞和白血病細(xì)胞。
例如，使用造血干細(xì)胞作為靶細(xì)胞的基因治療可以如下進行。首先，從供體收集含有造血干細(xì)胞的材料(例如，骨髓組織、外周血或臍帶血)。這種材料可按原樣用于基因轉(zhuǎn)移方法。然而，通常情況下，通過密度梯度離心等制備含有造血干細(xì)胞的單核細(xì)胞級分，或者使用適當(dāng)?shù)募?xì)胞表面標(biāo)記分子進一步純化造血干細(xì)胞。然后對含有造血干細(xì)胞的材料進行使用本發(fā)明方法進行突變導(dǎo)入或者突變修復(fù)。所得細(xì)胞可以例如，通過靜脈內(nèi)施用等移植到受體。盡管受體優(yōu)選為供體自己，但是也可能進行同種異體移植。例如，如果將臍帶血細(xì)胞用作材料，則進行同種異體移植。
根據(jù)本發(fā)明的基因治療的實例為對一種基因的治療，由于突變該基因在患者中的表達被增強或者其功能被減弱或喪失。例如，由于單個核苷酸替代(例如鐮刀細(xì)胞貧血)導(dǎo)致的遺傳疾病優(yōu)選地根據(jù)本發(fā)明的方法治療。
上面提到的基因治療可用于人以及非人脊椎動物和無脊椎動物。
本發(fā)明的一個示例性應(yīng)用是使用生殖細(xì)胞(例如，胚胎干細(xì)胞、原始生殖細(xì)胞、卵母細(xì)胞、卵原細(xì)胞、卵子、精細(xì)胞(spermacyte)或精子)作為靶細(xì)胞方便地產(chǎn)生非人轉(zhuǎn)基因動物(例如，小鼠、大鼠、狗、豬、奶牛、雞、蛙或青鳉)?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生基因敲除動物，其中僅僅目標(biāo)基因的表達被特異性抑制。這種敲除動物對于基因的功能分析、與該基因相關(guān)的試劑的篩選等非常有用。
實施例下面的實施例進一步詳細(xì)闡明本發(fā)明但是不被理解為對本發(fā)明范圍的限制。
實施例1 突變核苷酸向紅移綠色熒光蛋白基因的導(dǎo)入插入質(zhì)粒pQBI25(Quantum Biotechnologies Inc.)中的紅移綠色熒光蛋白(此后稱為GFP)編碼基因(SEQ ID NO1)的核苷酸序列中的單個核苷酸被替代，從而該基因不表達。66和68位氨基酸殘基對于GFP的熒光性是重要的。使用PCR體外誘變試劑盒(Takara Bio)將編碼其中67位的酪氨酸的密碼子“TAT”改變?yōu)榻K止密碼子“TAG”。如上描述制備突變GFP(mGFP)并將沒有突變的GFP編碼基因獨立地插入質(zhì)粒pDON-AI(Takara Bio)中以分別構(gòu)建pDON-mGFP和pDON-GFP。將含有1μg這些質(zhì)粒的一種的50μl TE緩沖液與含有1μg脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺(lipofectamine)2000(LF2000，Gibco BRL)的50μlOptimen培養(yǎng)基(Gibco BRL)混合。該混合物用于轉(zhuǎn)染293細(xì)胞。4天后在熒光顯微鏡下觀察這些細(xì)胞。對于加入pDON-GFP的細(xì)胞觀察到強烈的綠色熒光，而對于含有pDON-mGFP的細(xì)胞沒有觀察到熒光。基于這些結(jié)果，構(gòu)建了在細(xì)胞中不發(fā)熒光的突變基因。在下面的實驗中使用mGFP基因。
實施例2為了制備含有GFP基因的核苷酸序列的反向重復(fù)DNA(此后稱為irDNA)，將作為irDNA擴增模板的一組相反方向的GFP基因的兩個片段首先插入到質(zhì)粒中。使用引物Us-EcoRI(SEQ ID NO2)和DEND(SEQ ID NO3)擴增插入質(zhì)粒pQBI25中的GFP完整基因序列的片段。將通過用EcoRI和BamHI(都來自Takara Bio)消化片段得到的760-bp DNA片段插入質(zhì)粒pUC19(Takara Bio)中EcoRI和BamHI位點之間。使用引物Us-hindIII(SEQ ID NO4)和DEND擴增得到GFP基因完整序列的DNA片段。通過用HindIII(Takara Bio)和BamHI消化DNA片段得到的760-bp DNA片段被插入到該質(zhì)粒的HindIII和BamHI位點之間。如上述構(gòu)建的質(zhì)粒被指定為pucGFP0-0。
此外，使用引物Us-EcoRI和DEND擴增GFP基因全部序列的片段。通過用EcoRI和PvuII(Takara Bio)消化片段得到的714-bp DNA片段被插入到質(zhì)粒pUC19中EcoRI和SmaI位點之間。使用引物Us-hindIII和DEND擴增得到GFP基因完整序列的DNA片段。用HindIII和BamHI消化DNA片段得到的760-bp DNA片段被插入該質(zhì)粒中HindIII和BamHI位點之間。將如上述構(gòu)建的質(zhì)粒命名為pucGFP0-2。
此外，使用引物U100hindIII(SEQ ID NO5)和U100bamhI(SEQ IDNO6)從GFP基因擴增DNA片段。用HindIII和BamHI消化DNA片段制備110-bp DNA片段。該110-bp DNA片段用于替代質(zhì)粒pucGFP0-0中的760-bp HindIII-BamHI片段以構(gòu)建質(zhì)粒pucGFP0-6。
pucGFP0-0對于全長編碼GFP編碼基因有一個反向重復(fù)序列。該插入DNA的長度為1518bp。在pucGFP0-2中重復(fù)序列之一中缺失了距離終止密碼子38個核苷酸的區(qū)域。插入DNA的長度為1479bp。質(zhì)粒pucGFP0-6含有一反向重復(fù)序列，其由全長GFP編碼基因和GFP基因的150位到250位的核苷酸組成。插入DNA的長度是868bp。圖1A、1B和1C分別圖解了pucGFP0-0，pucGFP0-2和pucGFP0-6。
通過PCR，使用pucGFP0-0、pucGFP0-2和pucGFP0-6作為模板制備反向重復(fù)DNA0-0irDNA、0-2irDNA和0-6irDNA。引物Us-ecoRI-1(SEQ ID NO7)和Us-hindIII-1(SEQ ID NO8)用于制備0-0irDNA和0-2irDNA。引物Us-ecoRI-1和U100hindIII-1(SEQ IDNO9)用于制備0-6irDNA。用于恢復(fù)導(dǎo)入mGFP基因中的突變核苷酸“G”和“C”的野生型GFP基因的核苷酸“T”和“A”分別位于0-0irDNA、0-2irDNA和0-6irDNA中距離有義鏈的5’末端或反義鏈的3’末端(EcoRI位點)的第237個和第1282個核苷酸、第237和第1243個核苷酸和第237和第813個核苷酸。參與mGFP基因的有義和反義鏈中突變核苷酸修復(fù)的核苷酸的位置通過圖1中標(biāo)記“*”和“#”指出。
實施例3 附加體實驗?zāi)Ｐ椭衜GFP基因中單個突變核苷酸的修復(fù)進行使用反向重復(fù)DNA的基因修復(fù)實驗，并檢查對靶核酸的結(jié)合和靶核酸中突變核苷酸的修復(fù)。由于多輪DNA轉(zhuǎn)移對細(xì)胞的毒性影響通過同時轉(zhuǎn)移到含有作為靶核酸的插入mGFP基因(pcep-mGFP)的質(zhì)粒的胞質(zhì)中而避免，并且將用于修復(fù)的三個反向重復(fù)DNA(irDNA)或ss oligo之一作為對照。ss oligo的核苷酸序列在SEQID NO10中顯示。
(1)使用熱變性irDNA修復(fù)附加體mGFP基因為了制備實驗?zāi)Ｐ停瑥膶嵤├?中構(gòu)建的pDON-mGFP分離含有mGFP基因的760-bp HindIII-BamHI片段，并在附加體哺乳動物表達載體pCEP4(Invitrogen)中HindIII和BamHI位點之間亞克隆以制備質(zhì)粒pcep-mGFP。將293細(xì)胞(8×104)接種在48孔板中并在含有10％FBS的DEME培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。2μg每種0-0irDNA、0-2irDNA和0-6irDNA在94℃熱變性5分鐘并在冰水中快速冷卻。將2μg ssoligo、0-0irDNA、0-2irDNA或0-6irDNA，和1.5μg prep-mGFP或pUC19(陰性對照1)用37.5μl Optimen培養(yǎng)基稀釋?；旌衔锱c含有2μg LF2000的同體積的Optimen培養(yǎng)基混合。通過混合僅含有3.5μgpcep-mGFP的37.5μl Optimen培養(yǎng)基和同體積的含有2μg LF2000的Optimen培養(yǎng)基制備的混合物用作陰性對照2。
孵育20分鐘后，將每種DNA-LF2000試劑復(fù)合物加入到細(xì)胞中。混合物在室溫靜置30分鐘。向其中再加入150μl Optimen培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染6小時后，向其中加入1ml含有10％FBS的DEME培養(yǎng)基。48小時后，對于陰性對照1和2沒有觀察到發(fā)射綠色熒光蛋白的細(xì)胞(GFP-陽性細(xì)胞)。另一方面，在其中ss oligo或用于修復(fù)突變核苷酸的三種ir DNA之一和含有靶DNA的pcep-mGFP用于轉(zhuǎn)染的孔中觀察到GFP-陽性細(xì)胞。在第四天觀察到GFP-陽性細(xì)胞的最大數(shù)目。通過胰蛋白酶作用使細(xì)胞從平板脫離，并用FACS確定GFP陽性細(xì)胞。在表1中顯示了從測定值中減去作為背景的陰性對照1的值所得的結(jié)果。
在0-0irDNA中觀察到對于293細(xì)胞的每104個細(xì)胞的GFP陽性細(xì)胞數(shù)目的最大值，將該值作為mGFP基因中突變核苷酸的修復(fù)指數(shù)。修復(fù)作用比用ss oligo所觀察到的高約3倍。作為對4輪獨立實驗的Mann-Whitney U檢驗的結(jié)果，在0-0irDNA和ss oligo的修復(fù)效率之間觀察到顯著差異(p＜0.05)。
表1

(1)使用無熱變性irDNA對附加體mGFP基因的修復(fù)如實施例3-(1)所描述的檢查mGFP基因的修復(fù)，只是使用通過PCR擴增制備的irDNA而無熱變性。在104個293細(xì)胞中表現(xiàn)GFP-陽性細(xì)胞數(shù)目在表2中顯示。使用各自無熱變性的irDNA觀察到高于用ss oligo的修復(fù)效率。作為對4輪獨立實驗的Mann-Whitney U檢驗的結(jié)果，在0-0irDNA或0-2irDNA和ss oligo的修復(fù)效率之間觀察到顯著差異(p＜0.05)。
表2

當(dāng)作為靶核酸的pcep-mGFP和用于突變修復(fù)的0-0irDNA被用于以6小時間隔進行的連續(xù)轉(zhuǎn)染時，觀察到高于用ss oligo觀察到的修復(fù)效率。
在上面(2)中描述的實驗中表明作為靶核酸的質(zhì)粒不被轉(zhuǎn)移到所用的所有細(xì)胞中。在相同條件下將pcep-GFP和0-0irDNA轉(zhuǎn)移到293細(xì)胞中，并且確定GFP-陽性細(xì)胞的數(shù)目。結(jié)果，僅僅21.22±4.67％的細(xì)胞表現(xiàn)出含有質(zhì)粒。通過除去沒有質(zhì)粒的細(xì)胞修改表2中所示結(jié)果。在表3中顯示了每104個含有轉(zhuǎn)移的pcep-mGFP的細(xì)胞GFP陽性細(xì)胞(其中突變核苷酸被修復(fù))的數(shù)目。作為對4輪獨立實驗的Mann-Whitney U檢驗的結(jié)果，在0-0irDNA和ss oligo的修復(fù)效率之間觀察到顯著差異(p＜0.05)。
表3

用于上面提到的實驗(2μg)中轉(zhuǎn)染的三種irDNA和ss oligo的量相應(yīng)于529nmol(ss oligo)、9.5nmol(0-0irDNA)、10.1nmol(0-2irDNA)和16.6nmol(0-6irDNA)。用三種irDNA修復(fù)突變核苷酸的比率(rate)比用ss oligo的高。即使無熱變性進行轉(zhuǎn)染，使用含有完整GFP基因區(qū)的0-0irDNA也觀察到類似于用熱變性irDNA轉(zhuǎn)染觀察到的高修復(fù)效率。該修復(fù)效率比用ss oligo的高5倍。盡管0-0irDNA的分子數(shù)為ss oligo分子數(shù)的幾十分之一，但是用0-0irDNA的修復(fù)效率比用ss oligo的高若干倍。實驗結(jié)果表明靶向irDNA的靶核苷酸的活性比ss oligo的高得多，導(dǎo)致修復(fù)效率增加。
實施例4 mGFP基因整合到細(xì)胞染色體中使用逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝試劑盒ampho(Takara Bio)制備用以將mGFP基因插入到細(xì)胞染色體的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒。使用試劑盒中的包裝載體，根據(jù)磷酸鈣方法，如在實施例1中描述的重組逆轉(zhuǎn)錄載體pDON-mGFP被共轉(zhuǎn)移到293細(xì)胞中。培養(yǎng)48小時后，收集并過濾培養(yǎng)上清液。培養(yǎng)物上清液(逆轉(zhuǎn)錄病毒懸浮液)被稀釋并加入到用于293細(xì)胞的培養(yǎng)基中。通過PCR-擴增的DNA片段的序列分析證實含有mGFP基因的克隆細(xì)胞(293-10細(xì)胞)。從293-10細(xì)胞提取基因組DNA，并分析逆轉(zhuǎn)錄病毒的整合位點和與該位點相鄰的染色體DNA的序列。證實單拷貝GFP基因被整合到細(xì)胞中。該克隆細(xì)胞被用于下面的實驗中。
實施例5用于修復(fù)甲基化修飾的核糖核苷酸和用于修復(fù)mGFP中突變核苷酸的0-0irDNA的制備在SEQ ID NO11和12中分別顯示了5’引物RNA-ecoRI和3’引物RNA-hindIII的核苷酸序列，5’引物RNA-ecoRI和3’引物RNA-hindIII使用2’-O-甲基RNA亞磷酰胺(phosphoamidite)和CE-亞磷酰胺根據(jù)亞磷酰胺方法合成。在每個引物中頭6個核苷酸是甲基化核糖核苷酸。6個甲基化核糖核苷酸連接在0-0irDNA的有義鏈和反義鏈的5’末端，使用這兩種引物和pcuGFP0-0作為模板通過PCR得到0-0irDNA。在細(xì)胞中不易受核酸酶降解的0-0irDNA被指定為R0-0irDNA。
將4×105個293-10細(xì)胞或293細(xì)胞(作為陰性對照)接種在24孔板的每個孔中并在含有10％FBS的DEME培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。將4μg ss oligo、0-0irDNA或R0-0irDNA用75μl Optimen培養(yǎng)基稀釋。混合物與等體積含有4μg LF2000的Optimen培養(yǎng)基混合。孵育20分鐘后，將每種DNA-LF2000試劑復(fù)合物直接加入到細(xì)胞中。向其中還加入含有10％FBS的90μl DEME培養(yǎng)基用于轉(zhuǎn)染。培養(yǎng)基中ssoligo、0-0irDNA和R0-0irDNA量(摩爾)分別是992.00nmol、17.83nmol和17.82nmol。6小時后，向其中加入1.5ml含有10％FBS的DEME培養(yǎng)基。16-18小時后，培養(yǎng)基換成含有3％FBS的DEME培養(yǎng)基。培養(yǎng)在32℃持續(xù)2.5天。
為了準(zhǔn)確計數(shù)GFP-陽性細(xì)胞，將細(xì)胞用PBS洗滌，通過胰蛋白酶作用脫離并轉(zhuǎn)移到含有培養(yǎng)基的新孔板的孔中，在熒光顯微鏡下計數(shù)每個孔(1.6-1.9×106個細(xì)胞)中GFP-陽性細(xì)胞數(shù)。作為對照的293細(xì)胞中GFP-陽性細(xì)胞的背景值被從已經(jīng)被加入修復(fù)DNA的293-10細(xì)胞中GFP-陽性細(xì)胞值減去。結(jié)果，對于ss oligo、0-0irDNA和R0-0irDNA每個孔中GFP-陽性細(xì)胞的平均數(shù)分別為約54、2300和3800。每104個293-10細(xì)胞的GFP-陽性細(xì)胞數(shù)在表4中顯示。
作為對4輪獨立實驗的Mann-Whitney U檢驗的結(jié)果，在兩種irDNA的每一種和ss oligo的修復(fù)效率之間觀察到顯著差異(p＜0.05)。
表4

如上所述，使用R0-0irDNA的在293-10細(xì)胞的染色體中修復(fù)突變核苷酸的比率高于用ss oligo或0-0irDNA的比率。實驗結(jié)果表明，與使用0-0irDNA相比，由于甲基化核糖核苷酸對核酸酶等的降解的抗性，和胞質(zhì)或細(xì)胞核中R0-0irDNA更長時間的停留，使用R0-0irDNA的突變修復(fù)效率增加。
實施例6 使用含有能夠結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子的序列的irDNA修復(fù)突變核苷酸轉(zhuǎn)錄因子是參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞核中的重要因子，并且在基因表達控制中起作用。許多轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞質(zhì)中合成并且總是在細(xì)胞質(zhì)中等待時機。如果轉(zhuǎn)錄因子接收到活化信號，其便被運輸?shù)郊?xì)胞核中并發(fā)揮功能。
一種轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和抑制NF-κB活化的I-κB通常相互結(jié)合存在于細(xì)胞質(zhì)中。如果由于細(xì)胞因子如TNF-α的刺激I-κB被磷酸化，那么NF-κB被活化并被運輸?shù)郊?xì)胞核中(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.91，p.11884-11888(1994))。NF-κB結(jié)合位于基因上游被稱為NF-κB基序的短DNA序列并促進該基因轉(zhuǎn)錄。
已經(jīng)報導(dǎo)293細(xì)胞中存在NF-κB和能結(jié)合NF-κB的DNA序列(5′-gattgctttagcttggaaattccggagctg-3′，SEQ ID NO13)(Eur.J.Biochem.，Vol.268，p.1828-1836(2001))。合成三種引物GFP-kB1(SEQ IDNO14)、GFP-kB2(SEQ ID NO15)和GFP-kB3(SEQ ID NO16)以便將該序列導(dǎo)入irDNA中間的反向重復(fù)序列。首先，使用GFP-kB1和上面提到的引物Us-EcoRI以及從pucGFP 0-0切除的EcoRI-BamHI片段(其含有GFP基因)作為模板DNA進行PCR反應(yīng)得到擴增的DNA片段。其次，使用該擴增片段作為模板以及GFP-kB2和Us-EcoRI進行PCR以得到擴增的片段。此外，使用該擴增片段作為模板以及GFP-kB3和Us-EcoRI進行PCR以得到擴增的片段。所得擴增片段用EcoRI和BamHI消化，并且pucGFR0-0中EcoRI-BamHI片段被消化所得片段替代。如上描述構(gòu)建的質(zhì)粒被命名為pucGFP0nf-0。
pucGFP0nf-0含有一段插入片段，其含有GFP基因的反向重復(fù)序列和NF-κB-結(jié)合基序序列。插入片段的長達為1548bp。使用該質(zhì)粒作為模板DNA以及引物RNA-ecoRI和RNA-hindIII，或S-ecoRI和S-hindIII進行PCR。S-ecoRI和S-hindIII是序列與引物RNA-ecoRI和RNA-hindIII的序列相同的引物，并且其中每個引物的5’末端的6個核苷酸被改變成脫氧核糖核苷酸，并且它們之間的磷酸基團被硫分子修飾。擴增的片段被分別命名為R0nf-0irDNA和S0nf-0irDNA。
293-10細(xì)胞和293細(xì)胞(陰性對照)的預(yù)培養(yǎng)條件和用以修復(fù)的DNA的轉(zhuǎn)染方法和實施例5中描述的相同，只是TNF-α以8ng/ml的濃度包含在培養(yǎng)基中，TNF-α在ss oligo、R0-0irDNA、R0nf-0irDNA或S0nf-0irDNA轉(zhuǎn)移后6小時加入。
處理細(xì)胞，并在熒光顯微鏡下計數(shù)每個孔中GFP-陽性細(xì)胞數(shù)，并且作為對照的293細(xì)胞中GFP-陽性細(xì)胞的背景值從如實施例5描述的被加入修復(fù)DNA的細(xì)胞中GFP-陽性細(xì)胞的值減去。結(jié)果，使用ssoligo、R0-0irDNA、R0nf-0irDNA和S0nf-0irDNA的GFP-陽性細(xì)胞的平均數(shù)分別為88、約6000、大于10,000和大于10,000。使用ss oligo、R0-0irDNA、R0nf-0irDNA或S0nf-0irDNA的每104個細(xì)胞中GFP-陽性細(xì)胞數(shù)在表5中顯示。使用S0nf-0irDNA觀察到的最高修復(fù)效率比用ss oligo觀察到的高138倍。
作為對4輪獨立實驗的Mann-Whitney U檢驗的結(jié)果，在三種irDNA的每一種和ss oligo的修復(fù)效率之間觀察到顯著差異(p＜0.05)。而且，在R0-0irDNAs和含有導(dǎo)入的轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合基序序列的R0nf-0irDNA和S0nf-0irDNA的每一種的修復(fù)效率之間觀察到顯著差異(p＜0.5)。
表5

使用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)的ss oligo或0-0irDNA由于根據(jù)濃度梯度的自由擴散以被動擴散的方式移動到細(xì)胞核。因為0-0irDNA的濃度比ss oligo的低數(shù)十倍，因此轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核的0-0irDNA拷貝數(shù)較少，已經(jīng)預(yù)期使用0-0irDNA的修復(fù)突變核苷酸的比率比用ssoligo的低。然而，實際結(jié)果表明使用0-0irDNA的修復(fù)比率比使用ss oligo的高。這些結(jié)果表明盡管少數(shù)拷貝被運輸?shù)郊?xì)胞核中，但是由于0-0irDNA的高靶向活性，其具有更高的突變核苷酸修復(fù)比率。此外，通過向irDNA中導(dǎo)入能夠結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子以促進irDNA運輸?shù)郊?xì)胞核的短DNA序列，修復(fù)效率增加了。通過用甲基化核糖核苷酸或者不易被核酸酶降解的脫氧核糖核苷酸在5’末端修飾irDNA進一步增強效果。
含有與靶DNA相同的序列但是沒有NF-κB-結(jié)合基序序列所連接的反向重復(fù)結(jié)構(gòu)的DNA的修復(fù)效果比反向重復(fù)DNA(0-nf-0irDNA)的低若干倍。其中NF-κB-結(jié)合基序序列的兩個分子以相反方向?qū)?-0irDNA中間的DNA的效果是導(dǎo)入單個分子的NF-κB-結(jié)合基序序列的0nf-0irDNA的效果的約一半。
實施例7 具有雙突變的GFP基因的修復(fù)通過應(yīng)用PCR體外誘變方法將GFP基因的起始密碼子“ATG”中殘基“G”改變成“T”。突變GFP(m1GFP)基因被用于亞克隆到pCEP4并被用于轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，證實沒有觀察到熒光。此外，實施例1中制備的mGFP基因的上游區(qū)中HindIII-NheI片段(-36-174)被m1GFP基因的HindIII-NheI片段(-36-174)代替以構(gòu)建雙突變GFP(dmGFP)基因。
dmGFP基因含有被198個核苷酸隔開的兩個突變核苷酸(3位的“T”和201位的“G”)。在pCEP4中HindIII和BamHI位點之間亞克隆dmGFP基因的760-bp HindIII-BamHI片段以制備用作靶核酸的質(zhì)粒，pcep-dmGFP。
在如實施例3中所描述的實驗條件下檢查使用0-0irDNA同時修復(fù)雙突變的效率。結(jié)果，顯示同時修復(fù)兩個突變核苷酸的GFP-陽性細(xì)胞被觀察到其比率為15.85±2.00/104個細(xì)胞。
工業(yè)適用性本發(fā)明提供了能夠高效地將突變導(dǎo)入基因核苷酸序列的方法。根據(jù)本發(fā)明可以將人工突變導(dǎo)入細(xì)胞DNA中或者修復(fù)由于突變導(dǎo)致的非功能基因。本發(fā)明的方法用于基因治療、生產(chǎn)基因敲除生物體、基因的功能分析等。
序列表自由文本SEQ ID NO1；編碼紅移綠色熒光蛋白的基因。
SEQ ID NO2；用于擴增編碼紅移綠色熒光蛋白的基因的PCR引物Us-EcoRI。
SEQ ID NO3；用于擴增編碼紅移綠色熒光蛋白的基因的PCR引物DENO。
SEQ ID NO4；用于擴增編碼紅移綠色熒光蛋白的基因的PCR引物Us-HindIII。
SEQ ID NO5；用于擴增編碼紅移綠色熒光蛋白的基因的一部分的PCR引物U100HindIII。
SEQ ID NO6；用于擴增編碼紅移綠色熒光蛋白的基因的一部分的PCR引物D100BamHI。
SEQ ID NO7；用于擴增編碼紅移綠色熒光蛋白的基因的PCR引物Us-EcoRI-1。
SEQ ID NO8；用于擴增編碼紅移綠色熒光蛋白的基因的PCR引物Us-HindIII-1。
SEQ ID NO9；用于擴增編碼紅移綠色熒光蛋白的基因的一部分的PCR引物U100HindIII-1。
SEQ ID NO10；嵌合寡核苷酸ss Oligo?！搴塑账?-4和50-53是2′-O-甲基尿苷″。
SEQ ID NO11；用于擴增編碼紅移綠色熒光蛋白的基因的一部分的PCR引物RNA-ecoRI?！昂塑账?-6是2′-O-甲基核糖核苷酸-其他核苷酸是脫氧核糖核苷酸”。
SEQ ID NO12；用于擴增編碼紅移綠色熒光蛋白的基因的一部分的PCR引物RNA-hindIII。“核苷酸1-6是2′-O-甲基核糖核苷酸-其他核苷酸是脫氧核糖核苷酸”。
SEQ ID NO14；用于擴增編碼紅移綠色熒光蛋白的基因的PCR引物GFP-kB1。
SEQ ID NO15；用于擴增編碼紅移綠色熒光蛋白的基因的一部分的PCR引物GFP-kB2。
SEQ ID NO16；用于擴增編碼紅移綠色熒光蛋白的基因的一部分的PCR引物GFP-kB3。
序列表<110>TAKARA BIO INC.
<120>將突變導(dǎo)入靶核酸的方法<130>663910<150>JP 2002-204887<151>2002-07-12<150>JP 2003-113534<151>2003-04-18<160>16<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>720<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述編碼紅移綠色熒光蛋白的基因<400>1atggctagca aaggagaaga actcttcact ggagttgtcc caattcttgt tgaattagat 60
ggtgatgtta acggccacaa gttctctgtc agtggagagg gtgaaggtga tgcaacatac 120ggaaaactta ccctgaagtt catctgcact actggcaaac tgcctgttcc atggccaaca 180ctagtcacta ctctgtgcta tggtgttcaa tgcttttcaa gatacccgga tcatatgaaa 240cggcatgact ttttcaagag tgccatgccc gaaggttatg tacaggaaag gaccatcttc 300ttcaaagatg acggcaacta caagacacgt gctgaagtca agtttgaagg tgataccctt 360gttaatagaa tcgagttaaa aggtattgac ttcaaggaag atggaaacat tctgggacac 420aaattggaat acaactataa ctcacacaat gtatacatca tggcagacaa acaaaagaat 480ggaatcaaag tgaacttcaa gacccgccac aacattgaag atggaagcgt tcaactagca 540gaccattatc aacaaaatac tccaattggc gatggccctg tccttttacc agacaaccat 600tacctgtcca cacaatctgc cctttcgaaa gatcccaacg aaaagagaga ccacatggtc 660cttcttgagt ttgtaacagc tgctgggatt acacatggca tggatgaact gtacaactga 720<210>2<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述擴增編碼紅移綠色熒光蛋白基因的PCR引物Us-EcoR I<400>2cttgaattcg gtaccgagct cggatcgggc gcgcaagaaa40<210>3<211>20
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述擴增編碼紅移綠色熒光蛋白基因的PCR引物DEND<400>3cactggcggc cgttactagt 20<210>4<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述擴增編碼紅移綠色熒光蛋白基因的PCR引物Us-HindIII<400>4cttaagcttg gtaccgagct cggatcgggc gcgcaagaaa 40<210>5<211>40<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述擴增編碼紅移綠色熒光蛋白基因的一部分的PCR引物U100HindIII<400>5ctaagcttct ggcaaactgc ctgttccatg gccaacacta 40<210>6<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述擴增編碼紅移綠色熒光蛋白基因的一部分的PCR引物D100BamH I<400>6tcggatccaa gtcatgccgt ttcatatgat ccgggtatct 40<210>7<211>37<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述擴增編碼紅移綠色熒光蛋白基因的PCR引物Us-EcoRI-1<400>7gaattcggta ccgagctcgg atcgggcgcg caagaaa 37<210>8<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述擴增編碼紅移綠色熒光蛋白基因的PCR引物Us-HindIII-1<400>8aagcttggta ccgagctcgg atcgggcgcg caagaaa 37<210>9<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述擴增編碼紅移綠色熒光蛋白基因的一部分的PCR引物U100HindIII-1<400>9aagcttctgg caaactgcct gttccatggc caacacta 38<210>10<211>54<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>被修飾的堿基<222>(1)..(4)<223>um<220><221>被修飾的堿基<222>(50)..(53)<223>um<220>
<223>人工序列描述嵌合寡核苷酸ss Oligo.
<400>10uuuuatcttg aaaagcattg aacaccatag cacagagtag tgactagtgu uuut54
<210>11<211>35<212>DNA<213>人工序列<223>人工序列描述用于擴增編碼紅移綠色熒光蛋白的基因的一部分的PCR引物RNA-ecoRI。
″核苷酸1到6是2’-O-甲基核糖核苷酸-其他核苷酸是脫氧核糖核苷酸″。
<400>11gaauucggta ccgagctcgg atcgggcgcg caaga 35<210>12<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述用于擴增編碼紅移綠色熒光蛋白的基因的一部分的PCR引物RNA-hindIII。
″核苷酸1到6是2’-O-甲基核糖核苷酸-其他核苷酸是脫氧核糖核苷酸″。
<400>12aagcuuggta ccgagctcgg atcgggagag caaga 35
<210>13<211>30<212>DNA<213>人類<400>13gattgcttta gcttggaaat tccggagctg 30<210>14<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述用于擴增編碼紅移綠色熒光蛋白的基因的一部分的PCR引物GFP-kB1。
<400>14agctaaagca atctcagttg tacagttcat ccatgccatg40<210>15<211>40<212>DNA<213>人工序列
<223>人工序列描述用于擴增編碼紅移綠色熒光蛋白的基因的一部分的PCR引物GFP-kB2。
<400>15tccggaattt ccaagctaaa gcaatctcag ttgtacagtt40<210>16<211>40<212>DNA<213>人工序列<223>人工序列描述用于擴增編碼紅移綠色熒光蛋白的基因的一部分的PCR引物GFP-kB3。
<400>16ttttggatcc cagctccgga atttccaagc taaagcaatc40
權(quán)利要求
1.將突變導(dǎo)入靶核酸的核苷酸序列中的方法，該方法包括以下步驟(1)制備含有反向重復(fù)序列的DNA，其中含有反向重復(fù)序列的DNA的核苷酸序列與靶核酸同源并且含有將要導(dǎo)入靶核酸的突變；和(2)將含有反向重復(fù)序列的DNA轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中含有反向重復(fù)序列的DNA含有具有核運輸信號的蛋白質(zhì)的結(jié)合基序序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中具有核運輸信號的蛋白質(zhì)的結(jié)合基序序列是轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合基序序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中含有反向重復(fù)序列的DNA含有修飾核苷酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中含有反向重復(fù)序列的DNA是雙鏈DNA。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中含有反向重復(fù)序列的DNA是單鏈DNA。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中靶核酸是位于細(xì)胞質(zhì)中的核酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中靶核酸是位于細(xì)胞核中的核酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中多個突變被同時導(dǎo)入靶核酸。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中將要導(dǎo)入靶核酸的突變是核苷酸替代、缺失和/或插入。
11.通過權(quán)利要求1定義的方法將突變導(dǎo)入靶核酸的試劑盒，該試劑盒包含含有反向重復(fù)序列的DNA，其中含有反向重復(fù)序列的DNA的核苷酸序列與靶核酸同源并且含有將要導(dǎo)入靶核酸的突變。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的試劑盒，其中含有反向重復(fù)序列的DNA含有具有核運輸信號的蛋白質(zhì)的結(jié)合基序序列。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的試劑盒，其中含有核運輸信號的蛋白質(zhì)的結(jié)合基序序列是轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合基序序列。
14.根據(jù)權(quán)利要求11的試劑盒，其中含有反向重復(fù)序列的DNA含有修飾核苷酸。
15.根據(jù)權(quán)利要求11的試劑盒，其中含有反向重復(fù)序列的DNA是雙鏈DNA。
16.根據(jù)權(quán)利要求11的試劑盒，其中含有反向重復(fù)序列的DNA是單鏈DNA。
全文摘要
將突變轉(zhuǎn)移到靶核酸的堿基序列中的方法，其特征是包括步驟制備含有反向重復(fù)序列的DNA，其中含有反向重復(fù)序列的DNA的堿基序列與靶核酸同源并且具有含有將轉(zhuǎn)移到靶核酸中的突變，和步驟將含有反向重復(fù)序列的DNA轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中；和用于該方法的試劑盒。
文檔編號C12N15/90GK1668743SQ0381656
公開日2005年9月14日 申請日期2003年7月11日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月12日
發(fā)明者曹春渝, 佐川裕章, 加藤郁之進 申請人:寶生物工程株式會社