專利名稱：包括減壓/增壓的使用的電穿孔方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種使用包括減壓或增壓的電穿孔將所需核酸轉(zhuǎn)移到細(xì)胞或組織(包括植物組織)中，從而產(chǎn)生核酸-轉(zhuǎn)移物質(zhì)(包括轉(zhuǎn)化體)的方法。
背景技術(shù)：
人類的種族主要依賴于供他們生存的主要谷類食品，如小麥、大麥、稻、玉米、大豆等。為推進(jìn)食品生產(chǎn)以與全世界人口的增長相對應(yīng)，必須開發(fā)具有比傳統(tǒng)農(nóng)作物產(chǎn)量更高的農(nóng)作物。重組DNA技術(shù)已經(jīng)作為培育具有更高產(chǎn)量的變種的方法而用于研制轉(zhuǎn)化農(nóng)作物。
蔬菜，例如，大白菜、番茄、黃瓜等是豐富我們的食物以及營養(yǎng)必需的農(nóng)作物。然而，這些蔬菜易感染各種疾病或受到病原體損害。如果重組基因工程技術(shù)可用于產(chǎn)生對疾病或病原體損害的抗性，則可獲得穩(wěn)定的產(chǎn)量。為了滿足這種需要，已經(jīng)研究出了用于分離有效基因以及使用基因轉(zhuǎn)化的方法。
為了轉(zhuǎn)化植物，通常有兩種方法直接的基因轉(zhuǎn)移方法，其中將基因直接轉(zhuǎn)移到植物中；以及間接的基因轉(zhuǎn)移方法，其中將基因間接轉(zhuǎn)移到植物中。
迄今為止，已經(jīng)廣泛使用利用農(nóng)桿菌(Agrobacterium)的間接基因轉(zhuǎn)移方法。例如，培養(yǎng)稻的成熟種子，三周后，用農(nóng)桿菌感染所得愈傷組織(Hiei等人，Plant Journal，6271-282，1994)；或在發(fā)芽后第4-5天用農(nóng)桿菌感染種子，從而快速獲得轉(zhuǎn)化體(Tanaka等人，日本專利號3141084)。
直接的基因轉(zhuǎn)移方法的例子包括基因槍方法(Christou P.等人，Bio/Technology，9957-962，1991)、聚乙二醇方法(Datta S.K.等人，Bio/Technology，8736-740，1990)、電穿孔方法(Shimamoto K.等人，Nature，338274-276，1989)等。這些技術(shù)用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)化體。電穿孔是一種基因轉(zhuǎn)移方法，其中將細(xì)胞(例如，植物細(xì)胞)放在含有所需基因(例如，DNA)的溶液中，并通過電刺激將基因引入到細(xì)胞中。
與間接的基因轉(zhuǎn)移方法相比，直接的基因轉(zhuǎn)移方法具有無需組織培養(yǎng)和農(nóng)桿菌制備等的優(yōu)點(diǎn)。然而，基因槍方法，其是一種直接的基因轉(zhuǎn)移方法，具有轉(zhuǎn)化體(例如，轉(zhuǎn)化的全株植物)從轉(zhuǎn)化組織的再生效率普遍較低的缺點(diǎn)(Hagio，JARQ，32(4)239-247，1998)。電穿孔方法具有可用的細(xì)胞及組織有限的缺點(diǎn)。因此，直接的基因轉(zhuǎn)移方法具有有限的應(yīng)用。
傳統(tǒng)的電穿孔方法只能用于先天沒有細(xì)胞壁的細(xì)胞以及細(xì)胞壁已經(jīng)人工除去的細(xì)胞(例如，原生質(zhì)體)。相反，相信電穿孔不能用于具有細(xì)胞壁的細(xì)胞(例如，植物(包括休眠組織，如種子等))。事實(shí)上，還沒有關(guān)于通過電穿孔將核酸轉(zhuǎn)移到種子中的方法。因此，為了使用傳統(tǒng)的電穿孔方法獲得核酸轉(zhuǎn)移物質(zhì)(特別是，全株轉(zhuǎn)化植物)，在核酸已經(jīng)轉(zhuǎn)移到組織，如原生質(zhì)體等中后，不可避免地需要原生質(zhì)體培養(yǎng)、組織培養(yǎng)(例如，為了再分化)或其它步驟。因此，電穿孔并非必然是一種容易的方法，而且需要成本、時間、和勞動。
為了將基因轉(zhuǎn)移到小麥中，已經(jīng)使用了未成熟的胚(Weeks J.T.等人，Plant.Physiol.，1021077-1084，1993)。然而，植物需要在田間或溫室生長，以便獲得未成熟的胚。在田間，需要花費(fèi)6-7個月。在溫室，需要花費(fèi)3-5個月。
因此，還沒有可行的、簡單且快速的核酸轉(zhuǎn)移方法(特別是，轉(zhuǎn)化方法)，其中無需農(nóng)桿菌的培養(yǎng)和制備等，且很容易制備向其中轉(zhuǎn)移核酸的樣品，且核酸-轉(zhuǎn)移物質(zhì)(特別是，轉(zhuǎn)化體)很容易在核酸轉(zhuǎn)移之后獲得。
考慮到上述還沒有建立簡單且快速的核酸轉(zhuǎn)移方法(特別是，植物轉(zhuǎn)化方法)的情況，本發(fā)明目的是提供一種簡單且快速的核酸轉(zhuǎn)移方法(特別是，一種植物轉(zhuǎn)化方法)，它具有下列特征(i)無需農(nóng)桿菌等的培養(yǎng)和制備；(ii)向其中轉(zhuǎn)移核酸的樣品的制備較為簡單；且(iii)核酸轉(zhuǎn)移-物質(zhì)很容易在核酸轉(zhuǎn)移后獲得。
本發(fā)明簡單且快速的方法可迅速獲得大量核酸轉(zhuǎn)移物質(zhì)(特別是，全株轉(zhuǎn)化植物)。因此，本發(fā)明可用于需要植物轉(zhuǎn)化體的工業(yè)領(lǐng)域以及使用植物很容易進(jìn)行大規(guī)模處理和大規(guī)模分析的研究和開發(fā)中。此外，本發(fā)明可引起研究的顯著進(jìn)步，潛在導(dǎo)致創(chuàng)新重組體的開發(fā)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的上述目的是通過用于將核酸轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中的方法實(shí)現(xiàn)的，該方法包括下列步驟a)將細(xì)胞保持在不同于大氣壓的壓力下；并b)將細(xì)胞及核酸置于能夠引發(fā)電穿孔的條件下。
在其中一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法是通過下列步驟進(jìn)行的1)將植物組織保持在不同于大氣壓的壓力下；并2)使用電穿孔將所需基因轉(zhuǎn)移到植物中。
具體而言，在這里本發(fā)明人已經(jīng)試驗(yàn)過各種用于處理細(xì)胞，從而使核酸很容易被引入到細(xì)胞中的方法，從而在植物中實(shí)現(xiàn)成功的電穿孔。通常，相信(i)應(yīng)用農(nóng)桿菌的核酸轉(zhuǎn)移方法，其中將植物放在真空中，對于除擬南芥屬(Arabidopsis)之外的植物無效；且(ii)無需將植物保持在真空中，以便使用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)移核酸(Bent，PlantPhysiology，1241540-1547，2000年12月)。相反，如下面實(shí)施例所示，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)通過電穿孔進(jìn)行植物核酸轉(zhuǎn)移是通過增加將植物組織保持在不同于大氣壓的壓力下的步驟而優(yōu)化的。本發(fā)明的方法可應(yīng)用于除植物細(xì)胞之外的任何其它細(xì)胞，其中通過電穿孔進(jìn)行的核酸轉(zhuǎn)移的效率明顯提高。
本發(fā)明的方法非常簡單。此外，本發(fā)明的方法無需培養(yǎng)，而這種培養(yǎng)通常是核酸轉(zhuǎn)移后所必需的。因此，本發(fā)明具有核酸轉(zhuǎn)化物質(zhì)沒有體細(xì)胞克隆變異的優(yōu)點(diǎn)。已知體細(xì)胞克隆變異不可避免地出現(xiàn)在常規(guī)核酸轉(zhuǎn)移后所需的培養(yǎng)中。正如本領(lǐng)域那些技術(shù)人員通常所了解的那樣，體細(xì)胞克隆變異是指在培養(yǎng)物中出現(xiàn)的基因突變，即培養(yǎng)物中核酸序列中出現(xiàn)的任何序列改變(例如，置換、缺失、插入、易位、倒位、重復(fù)等)，所述核酸序列是指最初由向其中轉(zhuǎn)移核酸的細(xì)胞所具有的核酸序列和/或轉(zhuǎn)移的核酸序列。無意的體細(xì)胞克隆變異常常為核酸轉(zhuǎn)移物質(zhì)帶來不希望得到的特性。因此，因?yàn)樗璧暮怂徂D(zhuǎn)移物質(zhì)可在不發(fā)生體細(xì)胞克隆變異的條件下獲得，所以本發(fā)明的方法十分有用。
本發(fā)明進(jìn)一步提供允許植物物種轉(zhuǎn)化的優(yōu)點(diǎn)，這些植物物種不能或很難通過傳統(tǒng)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)轉(zhuǎn)化。具體而言，Norin 61(小麥變種)，其用于下列實(shí)施例中，在日本是小麥的其中一種主要變種。不能通過組織培養(yǎng)使這種變種再生為全株植物，即，很難通過傳統(tǒng)技術(shù)獲得轉(zhuǎn)化體(Machii等人，Plant Cell，Tissue and Organ Culture，5367-74，1998)。此外，例如，對于實(shí)施例4中所用的大豆，還沒有很好地建立再分化技術(shù)。很難獲得大豆的轉(zhuǎn)化體。然而，如下面實(shí)施例所述，本發(fā)明可轉(zhuǎn)化通常不能或很難被制成轉(zhuǎn)化體的植物物種。本發(fā)明的方法可用于通常不能或很難被制成轉(zhuǎn)化體的任何其它物種。
因此，本發(fā)明提供下列內(nèi)容。
1.一種用于將核酸轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中的方法，包括下列步驟a)細(xì)胞保持在不同于大氣壓的壓力下；并b)將細(xì)胞及核酸置于能夠引發(fā)電穿孔的條件下。
2.根據(jù)項(xiàng)1所述的方法，其中將細(xì)胞保持在不同于大氣壓的壓力下的步驟是使細(xì)胞經(jīng)過減壓的步驟。
3.根據(jù)項(xiàng)1所述的方法，其中將細(xì)胞保持在不同于大氣壓的壓力下的步驟是使細(xì)胞經(jīng)過增壓的步驟。
4.根據(jù)項(xiàng)1所述的方法，其中將細(xì)胞保持在不同于大氣壓的壓力下的步驟是在將細(xì)胞及核酸置于能夠引發(fā)電穿孔的條件下的步驟之前進(jìn)行的。
5.根據(jù)項(xiàng)2所述的方法，其中減壓步驟是在比大氣壓低約0.096MPa的壓力下進(jìn)行的。
6.根據(jù)項(xiàng)1所述的方法，其中步驟b)包括在至少兩個方向上向細(xì)胞及核酸施加高壓脈沖。
7.根據(jù)項(xiàng)1所述的方法，其中所述細(xì)胞是植物細(xì)胞。
8.根據(jù)項(xiàng)7所述的方法，其中所述植物細(xì)胞是休眠植物組織的細(xì)胞。
9.根據(jù)項(xiàng)8所述的方法，其中所述休眠植物組織是種子。
10.根據(jù)項(xiàng)7所述的方法，其中所述植物是單子葉植物。
11.根據(jù)項(xiàng)10所述的方法，其中所述單子葉植物是禾本科(Gramineae)植物。
12.根據(jù)項(xiàng)11所述的方法，其中所述禾本科植物是小麥(Triticumaestivum L.)。
13.根據(jù)項(xiàng)11所述的方法，其中所述禾本科植物是稻(Oryza sativaL.)。
14.根據(jù)項(xiàng)11所述的方法，其中所述禾本科植物是玉米(Zea mays L.)。
15.根據(jù)項(xiàng)7所述的方法，其中所述植物是雙子葉植物。
16.根據(jù)項(xiàng)15所述的方法，其中所述雙子葉植物是十字花科(Cruciferae)植物。
17.根據(jù)項(xiàng)16所述的方法，其中所述十字花科植物是大白菜(Brassicarapa L.)。
18.根據(jù)項(xiàng)16所述的方法，其中所述十字花科植物是油菜(Brassicanapus L.)。
19.根據(jù)項(xiàng)15所述的方法，其中所述雙子葉植物是豆科(Leguminosae)植物。
20.根據(jù)項(xiàng)19所述的方法，其中所述豆科植物是大豆(Glycine maxMerr)。
21.根據(jù)項(xiàng)15所述的方法，其中所述雙子葉植物是茄科(Solanaceae)植物。
22.根據(jù)項(xiàng)21所述的方法，其中所述茄科植物是番茄(Lycopersicumesculentum Mill)。
23.根據(jù)項(xiàng)15所述的方法，其中所述雙子葉植物是葫蘆科(Cucurbitaceae)植物。
24.根據(jù)項(xiàng)23所述的方法，其中所述葫蘆科植物是日本香瓜(Cucumismelo L.)。
25.根據(jù)項(xiàng)15所述的方法，其中所述雙子葉植物是旋花科(Convolvulaceae)植物。
26.根據(jù)項(xiàng)25所述的方法，其中所述旋花科植物是牽牛花(Pharbitis nilChoisy)。
27.一種用于產(chǎn)生植物的方法，其中核酸被轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中，包括下列步驟a)細(xì)胞保持在不同于大氣壓的壓力下；并b)將細(xì)胞及核酸置于能夠引發(fā)電穿孔的條件下。
28.根據(jù)項(xiàng)27所述的方法，還包括使細(xì)胞分化、生長、和/或增殖的步驟。
29.根據(jù)項(xiàng)27或28所述的方法，其中步驟a)包括將含有細(xì)胞的種子保持在不同于大氣壓的壓力下的步驟，且步驟b)包括將含有細(xì)胞及核酸的種子置于能夠引發(fā)電穿孔的條件下的步驟。
30.根據(jù)項(xiàng)29所述的方法，其中所述種子是單子葉植物的種子。
31.根據(jù)項(xiàng)30所述的方法，其中所述單子葉植物的種子是禾本科的種子。
32.根據(jù)項(xiàng)31所述的方法，其中所述禾本科的種子是小麥(Triticumaestivum L.)的種子。
33.根據(jù)項(xiàng)31所述的方法，其中所述禾本科的種子是稻(Oryza sativaL.)的種子。
34.根據(jù)項(xiàng)31所述的方法，其中所述禾本科的種子是玉米(Zea maysL.)的種子。
35.根據(jù)項(xiàng)29所述的方法，其中所述種子是雙子葉植物的種子。
36.根據(jù)項(xiàng)35所述的方法，其中所述雙子葉植物的種子是十字花科的種子。
37.根據(jù)項(xiàng)36所述的方法，其中所述十字花科的種子是大白菜(Brassicarapa L.)的種子。
38.根據(jù)項(xiàng)36所述的方法，其中所述十字花科的種子是油菜(Brassicanapas L.)種子。
39.根據(jù)項(xiàng)35所述的方法，其中所述雙子葉植物的種子是豆科的種子。
40.根據(jù)項(xiàng)39所述的方法，其中所述豆科的種子是大豆(Glycine maxMerr)的種子。
41.根據(jù)項(xiàng)35所述的方法，其中所述雙子葉植物的種子是茄科的種子。
42.根據(jù)項(xiàng)41所述的方法，其中所述茄科的種子是番茄(Lycopersicumesculentum Mill)的種子。
43.根據(jù)項(xiàng)35所述的方法，其中所述雙子葉植物的種子是葫蘆科的種子。
44.根據(jù)項(xiàng)43所述的方法，其中所述葫蘆科的種子是日本香瓜(Cucumismelo L.)的種子。
45.根據(jù)項(xiàng)35所述的方法，其中所述雙子葉植物的種子是旋花科的種子。
46.根據(jù)項(xiàng)45所述的方法，其中所述旋花科的種子是牽?；?Pharbitisnil Choisy)的種子。
47.一種通過項(xiàng)27-46任何一項(xiàng)所述的方法生產(chǎn)的植物。
48.根據(jù)項(xiàng)47所述的植物，其不含體細(xì)胞克隆變異。
49.一種用于將核酸轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中的裝置，包括a)用于將細(xì)胞保持在不同于大氣壓的壓力下的部分；和b)用于電穿孔的部分。
50.根據(jù)項(xiàng)49所述的裝置，其中用于將細(xì)胞保持在不同于大氣壓的壓力下的部分具有維持壓力低于大氣壓的能力。
51.根據(jù)項(xiàng)49所述的裝置，其中所述細(xì)胞是植物細(xì)胞。
52.根據(jù)項(xiàng)49所述的方法，其中b)的電穿孔部分包括起陽極作用的第一電極；和起陰極作用的第二電極，其中第一電極與第二電極之間距離的長度足以容納植物種子。
53.根據(jù)項(xiàng)52所述的裝置，其中第一電極與第二電極之間的距離為至少約5mm。
54.根據(jù)項(xiàng)52所述的裝置，其中第一電極與第二電極之間的距離長于約1cm。
55.根據(jù)項(xiàng)52所述的裝置，其中第一電極和第二電極是鉑電極。
56.根據(jù)項(xiàng)49所述的裝置，其中b)的電穿孔部分包括起陽極作用的第一電極；和起陰極作用的第二電極，其中第一電極與第二電極之間的距離可被改變，從而使植物種子可被容納于第一和第二電極之間。
57.根據(jù)項(xiàng)56所述的裝置，其中第一電極和第二電極是鉑電極。
58.一種用于將核酸轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中，并將細(xì)胞保持在不同于大氣壓的壓力下的電穿孔裝置，該裝置包括起陽極作用的第一電極；和起陰極作用的第二電極，其中第一電極與第二電極之間距離的長度足以容納植物種子。
59.根據(jù)項(xiàng)58所述的裝置，其中第一電極與第二電極之間的距離為至少約5mm。
60.根據(jù)項(xiàng)58所述的裝置，其中第一電極與第二電極之間的距離長于約1cm。
61.根據(jù)項(xiàng)58所述的裝置，其中第一電極和第二電極是鉑電極。
62.一種用于將核酸轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中，并將細(xì)胞保持在不同于大氣壓的壓力下的電穿孔裝置，該裝置包括
起陽極作用的第一電極；和起陰極作用的第二電極，其中第一電極與第二電極之間的距離可被改變，從而使植物種子可被容納于第一和第二電極之間。
63.根據(jù)項(xiàng)62所述的裝置，其中第一電極和第二電極是鉑電極。
64.一種能抵抗不同于大氣壓的壓力并具有足以容納植物種子大小的電穿孔室。
65.根據(jù)項(xiàng)64所述的電穿孔室，其中與電穿孔室內(nèi)壁上的至少3個點(diǎn)相切的最大內(nèi)切圓直徑為至少約5mm。
66.根據(jù)項(xiàng)64所述的電穿孔室，其中與電穿孔室內(nèi)壁上的至少3個點(diǎn)相切的最大內(nèi)切圓直徑長于約1cm。
67.根據(jù)項(xiàng)64所述的電穿孔室，其中該室具有四邊形的橫截面，且室的內(nèi)部尺寸是約1cm×2cm×2cm。
68.根據(jù)項(xiàng)64所述的電穿孔室，其中該室具有圓形的橫截面，且室的內(nèi)部尺寸是約1cm×4cm。
69.一種能夠抵抗不同于大氣壓的壓力的電穿孔室，其中該室的大小可被改變，從而使植物種子可被容納于室中。
70.一種用于自動進(jìn)行電穿孔的裝置，包括a)用于放置含核酸及細(xì)胞的混合物的容器；b)用于在容器a)中放置核酸的部分；c)用于在容器a)中放置細(xì)胞的部分；d)用于將細(xì)胞保持在不同于大氣壓的壓力下的容器，該容器能夠抵抗不同于大氣壓的壓力；e)用于在容器d)中放置細(xì)胞的部分；f)用于將容器d)的內(nèi)部區(qū)域維持在不同于大氣壓的壓力下的部分；g)用于向含核酸及細(xì)胞的混合物施加高壓脈沖的容器；h)用于在容器g)中放置含核酸及細(xì)胞的混合物的部分；i)用于向容器g)中的含核酸及細(xì)胞的混合物施加高壓脈沖的部分；和j)用于自動運(yùn)行部分b)、c)、e)、f)、h)、和i)的部分，其中部分b)和部分c)彼此相同或不同；部分e)和部分h)彼此相同或不同；且容器a)、容器d)、和容器g)彼此相同或不同。
附圖簡述

圖1是pWI-H5K的限制性酶切圖。
圖2表示在下列條件下經(jīng)過電穿孔的小麥種子(Norin 61)的結(jié)果脈沖寬度為50μsec、脈沖次數(shù)為50、壓力是低于大氣壓0.096MPa(減壓)、施加的電壓是100V(A)、50V(B)、20V(C)、或0V(D)。
圖3表示1經(jīng)過減壓和電穿孔的小麥種子；2只經(jīng)過電穿孔的小麥種子；和3對照小麥種子的GUS染色結(jié)果。
圖4表示用2000ppm遺傳霉素篩選轉(zhuǎn)化小麥種子的結(jié)果，其中A具有質(zhì)粒的樣品，B沒有質(zhì)粒的對照。
圖5表示轉(zhuǎn)化小麥植株DNA的PCR分析結(jié)果。第1-8泳道轉(zhuǎn)化小麥植物的DNA樣品；M標(biāo)記；P陽性對照，N陰性對照。右面的箭頭表示目標(biāo)產(chǎn)物的位置(約0.75kb)。
圖6表示轉(zhuǎn)化小麥植株DNA的DNA印跡分析結(jié)果。第1-8泳道轉(zhuǎn)化小麥植株的DNA樣品；P1陽性對照，P2陽性對照，N陰性對照。右面從上面開始的箭頭表示約4.0kb、約2.0kb、約1.5kb、和約1.0kb。
圖7表示具有種子生育力的小麥轉(zhuǎn)化體的照片。照片中的植株與在圖6的DNA印跡分析中呈陽性的第1和2泳道的植株相對應(yīng)。
圖8表示轉(zhuǎn)化小麥植株的下一代個體(T1)DNA的PCR分析結(jié)果。第1-6泳道轉(zhuǎn)化小麥植株的下一代個體(T1)的DNA樣品，M標(biāo)記，P陽性對照，N陰性對照。右面的箭頭表示目標(biāo)產(chǎn)物的位置(約0.75kb)。
圖9表示在下列條件下經(jīng)過電穿孔的稻種子(日本產(chǎn))的結(jié)果脈沖寬度為50μsec、脈沖次數(shù)為99、壓力是低于大氣壓0.096MPa(減壓)、施加的電壓是50V(A)、20V(B)、10V(C)、或0V(D)。
圖10表示1經(jīng)過減壓和電穿孔的日本產(chǎn)稻種子；2只經(jīng)過電穿孔的日本產(chǎn)稻種子；和3對照的日本產(chǎn)稻種子的GUS染色結(jié)果。
圖11表示用200ppm遺傳霉素篩選轉(zhuǎn)化的日本產(chǎn)稻種子的結(jié)果，其中A具有質(zhì)粒的樣品，B沒有質(zhì)粒的對照。
圖12表示轉(zhuǎn)化的日本產(chǎn)稻植株DNA的DNA印跡分析結(jié)果。第1-6泳道轉(zhuǎn)化的日本產(chǎn)稻植株的DNA樣品，P陽性對照(相當(dāng)于約5個拷貝)，N陰性對照。右面的箭頭表示目標(biāo)產(chǎn)物的位置(約0.8kb)。
圖13表示具有種子生育力的日本產(chǎn)稻轉(zhuǎn)化體的照片。照片中的植株與在圖12的DNA印跡分析中呈陽性的第5泳道植株相對應(yīng)。
圖14表示轉(zhuǎn)化的日本產(chǎn)稻植株下一代個體(T1)的DNA的PCR分析結(jié)果。第1-8泳道轉(zhuǎn)化的日本產(chǎn)稻植株下一代個體(T1)的DNA樣品，M標(biāo)記，P陽性對照，N陰性對照。右面的箭頭表示目標(biāo)產(chǎn)物的位置(約0.75kb)。
圖15表示A經(jīng)過減壓和電穿孔的印度產(chǎn)稻種子；B只經(jīng)過電穿孔的印度產(chǎn)稻種子；和C對照的印度產(chǎn)稻種子的GUS染色結(jié)果。
圖16表示1經(jīng)過減壓和電穿孔的大豆種子；和2對照大豆種子的GUS染色結(jié)果。
圖17表示A經(jīng)過減壓和電穿孔的大白菜種子；和B對照大白菜種子的GUS染色結(jié)果。
圖18表示A經(jīng)過減壓和電穿孔的番茄種子；B只經(jīng)過電穿孔的番茄種子；和C對照番茄種子的GUS染色結(jié)果。
圖19表示A經(jīng)過減壓和電穿孔的牽?；ǚN子；和B對照牽?；ǚN子的GUS染色結(jié)果。
圖20表示經(jīng)過電穿孔的小麥種子的結(jié)果，其中電壓是100V，脈沖寬度是50μsec，脈沖次數(shù)是50，且A低于大氣壓0.096MPa壓力，B低于大氣壓0.06MPa壓力，C沒有減壓，或D對照(沒有DNA和減壓)。
圖21表示經(jīng)過電穿孔的日本產(chǎn)稻種子的結(jié)果，其中電壓是50V，脈沖寬度是50μsec，脈沖次數(shù)是99，A低于大氣壓0.096MPa壓力，B低于大氣壓0.06MPa壓力，C沒有減壓，或D對照(沒有DNA和減壓)。
圖22表示本發(fā)明電穿孔裝置的實(shí)施方案。
圖23表示本發(fā)明電穿孔裝置的另一實(shí)施方案。
圖24表示本發(fā)明電穿孔裝置的另一實(shí)施方案。
圖25表示本發(fā)明直角平行六面體形電穿孔室的實(shí)施方案。
圖26表示本發(fā)明微管形電穿孔室的實(shí)施方案。
圖27表示與本發(fā)明舉例性電穿孔室內(nèi)壁上的至少3個點(diǎn)相切的最大內(nèi)切圓的例子。
圖28表示本發(fā)明自動電穿孔裝置的圖解說明。
圖29表示本發(fā)明自動電穿孔裝置的實(shí)施方案。
進(jìn)行本發(fā)明的最佳方式以下，將參考附圖通過用于說明的實(shí)施例描述本發(fā)明。
應(yīng)當(dāng)理解，在本說明書中，除非另有說明，單數(shù)形式的冠詞包括它們復(fù)數(shù)的概念。還應(yīng)當(dāng)理解，除非另有說明，這里所用的術(shù)語具有本領(lǐng)域通常所用的定義。
本公開內(nèi)容中所用的下列術(shù)語具有下面歸于它們的含義。
這里所用術(shù)語“核酸轉(zhuǎn)移”是指以人工方式將核酸轉(zhuǎn)移到細(xì)胞或組織中。已經(jīng)通過“核酸轉(zhuǎn)移”向其中轉(zhuǎn)移了核酸的細(xì)胞或組織的表型可以改變或不改變。這里所用術(shù)語“基因轉(zhuǎn)移”是指以人工方式將含有基因的核酸轉(zhuǎn)移到細(xì)胞或組織中，該基團(tuán)是決定遺傳性狀的因子。已經(jīng)通過“基因轉(zhuǎn)移”向其中轉(zhuǎn)移了含基因的核酸的細(xì)胞或組織的表型可以改變或不改變。這里所用術(shù)語“轉(zhuǎn)化”是指通過將含基因的核酸引入到細(xì)胞或組織中而改變細(xì)胞或組織的表型。值得注意的是，在特定情況下，術(shù)語“核酸轉(zhuǎn)移”、“基因轉(zhuǎn)移”、和“轉(zhuǎn)化”可在這里互換使用。在本說明書的上下文中，本領(lǐng)域那些技術(shù)人員可很清楚理解這些術(shù)語各自的含義。
術(shù)語“核酸轉(zhuǎn)移物質(zhì)”、“基因轉(zhuǎn)移物質(zhì)”、和“轉(zhuǎn)化體”是指從分別經(jīng)過核酸轉(zhuǎn)移、基因轉(zhuǎn)移、以及轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或組織產(chǎn)生的生物的全部或一部分。應(yīng)注意的是，在特定情況下，術(shù)語“核酸轉(zhuǎn)移物質(zhì)”、“基因轉(zhuǎn)移物質(zhì)”、和“轉(zhuǎn)化體”可在這里互換使用。在本說明書的上下文中，本領(lǐng)域那些技術(shù)人員可很清楚地理解這些術(shù)語各自的含義。核酸轉(zhuǎn)移物質(zhì)、基因轉(zhuǎn)移物質(zhì)、和轉(zhuǎn)化體可以是任何生物，包括，例如，從原核生物細(xì)胞及真核生物細(xì)胞(例如，植物細(xì)胞等)或組織產(chǎn)生的生物。轉(zhuǎn)化體還被稱作轉(zhuǎn)化細(xì)胞、轉(zhuǎn)化組織、轉(zhuǎn)化宿主等，這取決于所轉(zhuǎn)化的是什么。這里所用術(shù)語“轉(zhuǎn)化體”包括所有這些形式，而且可指特定環(huán)境中的特定形式。它們可用于術(shù)語“核酸轉(zhuǎn)移物質(zhì)”及“基因轉(zhuǎn)移物質(zhì)”。
術(shù)語“細(xì)胞”是指來源于任何生物(例如，任何類型的多細(xì)胞生物(例如，動物(例如，脊椎動物、無脊椎動物)、植物(例如，單子葉植物、雙子葉植物等))、單細(xì)胞生物(例如，細(xì)菌等))的細(xì)胞。優(yōu)選，本發(fā)明所用的細(xì)胞是具有細(xì)胞壁的細(xì)胞，特別優(yōu)選植物細(xì)胞。
這里所用術(shù)語“組織”是指多細(xì)胞生物中，具有基本相同功能和/或形式的細(xì)胞聚集體。組織通常是相同來源的細(xì)胞聚集體，或如果細(xì)胞具有基本相同的功能和/或形式，可以是不同來源的細(xì)胞聚集體。通常，組織是器官的一部分。在植物中，組織可以各種方式被粗略分類，例如，可被分為分生組織和永久組織，這取決于成分細(xì)胞的發(fā)育狀態(tài)；或被分為簡單組織和復(fù)雜組織，這取決于成分細(xì)胞的類型。動物組織被分為上皮組織、結(jié)締組織、肌肉組織、神經(jīng)組織等，這取決于形式、功能或遺傳基礎(chǔ)。
這里所用術(shù)語“組織”是指來源于任何生物(例如，任何類型的多細(xì)胞生物(例如，動物(例如，脊椎動物、無脊椎動物)、植物(例如，單子葉植物、雙子葉植物等)、真菌等)的任何組織。優(yōu)選，本發(fā)明所用的組織是具有細(xì)胞壁的組織，特別優(yōu)選植物組織。植物組織的例子包括，但不限于，休眠組織、種質(zhì)、生長點(diǎn)、和花芽。休眠組織的優(yōu)選例子包括，但不限于，成熟種子、未成熟種子、冬芽、和塊莖。特別優(yōu)選的休眠組織是成熟種子，但不限于此。
這里所用術(shù)語“器官”是指一種結(jié)構(gòu)，其是個體生物的特殊部分，其中個體生物的某些功能就是在此局部進(jìn)行的，而且其是形態(tài)學(xué)獨(dú)立的。通常，在多細(xì)胞生物(例如，動物、植物、真菌)中，器官是由若干組織以特定的空間排列構(gòu)成的，組織是由許多細(xì)胞構(gòu)成的。植物器官的例子包括，但不限于，根、葉、莖、花等。動物器官的例子包括，但不限于，皮膚、心臟、血管、角膜、視網(wǎng)膜、腎、肝、胰、腸、胎盤、臍帶、肺、腦、神經(jīng)、末肢等。
這里所用術(shù)語“篩選”是指通過抗生素-抗性試驗(yàn)和/或基因工程技術(shù)(例如，PCR、DNA印跡、RNA印跡等)將核酸轉(zhuǎn)移物質(zhì)與非-核酸轉(zhuǎn)移物質(zhì)區(qū)別開來。具體而言，術(shù)語“篩選”是指在有藥物存在的條件下，通過培養(yǎng)和/或使這些生物生長而將具有引入的藥物抗性基因的轉(zhuǎn)化生物與未轉(zhuǎn)化生物區(qū)別開來的步驟，其中轉(zhuǎn)化生物對所述藥物具有抗性。
這里所用術(shù)語“電穿孔”是指將核酸(例如，含基因的核酸)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞(例如，植物細(xì)胞)中的技術(shù)，其中將DC高壓脈沖施加于細(xì)胞上，從而將孔打開，使核酸進(jìn)入細(xì)胞。進(jìn)行電穿孔的條件可由本領(lǐng)域那些技術(shù)人員根據(jù)所用的物種、組織、細(xì)胞等適當(dāng)選擇。進(jìn)行電穿孔所用的一般電壓是10V/cm-200V/cm、優(yōu)選20V/cm-150V/cm、更優(yōu)選30V/cm-120V/cm、甚至更優(yōu)選40V/cm-100V/cm、最優(yōu)選50V/cm-100V/cm，但不限于這些值。進(jìn)行電穿孔的一般脈沖寬度是lμsec-90μsec、優(yōu)選10μsec-90μsec、更優(yōu)選20μsec-80μsec、更優(yōu)選30μsec-80μsec、甚至更優(yōu)選40μsec-70μsec、最優(yōu)選50μsec-60μsec，但不限于這些值。進(jìn)行電穿孔的一般脈沖次數(shù)是1-200、優(yōu)選10-150、更優(yōu)選20-120、甚至更優(yōu)選30-110、最優(yōu)選40-100、但不限于這些值。
這里所用短語“將細(xì)胞(或組織)及核酸置于能夠引發(fā)電穿孔的條件下”是指將細(xì)胞(或組織)及核酸置于具有引發(fā)電穿孔(即，核酸向細(xì)胞(或組織)中轉(zhuǎn)移)所需的所有條件(電壓、脈沖寬度、脈沖次數(shù)、細(xì)胞(或組織)與核酸之間的位置關(guān)系、電穿孔的運(yùn)行時間等)的狀態(tài)下。進(jìn)行電穿孔所需的條件對于本領(lǐng)域那些技術(shù)人員而言是很清楚的，可由本領(lǐng)域那些技術(shù)人員適當(dāng)確定。
在本發(fā)明中，電穿孔優(yōu)選是通過以至少兩個方向，向細(xì)胞(或組織)及核酸施加高壓脈沖而進(jìn)行的。這項(xiàng)技術(shù)可通過向細(xì)胞(或組織)及核酸施加一段預(yù)定時間的高壓脈沖，之后交換陽極和陰極的位置，并再次施加高壓脈沖而最簡單地實(shí)現(xiàn)。這項(xiàng)技術(shù)還可使用排列于電穿孔室中不同位置上的電極對實(shí)現(xiàn)。通過以至少兩個方向施加高壓脈沖，核酸的轉(zhuǎn)移效率可顯著提高。例如，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)當(dāng)以兩個方向?qū)⒏邏好}沖施加于十字花科植物的種子及核酸上時，與僅以一個方向施加高壓脈沖比，核酸向種子中轉(zhuǎn)移的效率提高了約2倍或更多。
本發(fā)明進(jìn)行電穿孔時所用的電穿孔室可具有任何尺寸，只要該室可容納經(jīng)過核酸轉(zhuǎn)移的細(xì)胞和/或組織。特別優(yōu)選電穿孔室的大小可容納植物組織(例如，植物種子)。本發(fā)明的電穿孔室可以是任何形狀。這種形狀的例子包括，但不限于，立方體、直角平行六面體、圓柱體、管形(例如，體具有均勻或不均勻的橫截面，且該體可以或不向底部漸細(xì))等。為使本發(fā)明的電穿孔室容納植物種子，與本發(fā)明室內(nèi)壁上至少3個點(diǎn)相切的最大內(nèi)切圓直徑可以是，例如至少約5mm或更多、優(yōu)選至少約6mm或更多、優(yōu)選至少約7mm或更多、優(yōu)選至少約8mm或更多、優(yōu)選至少約9mm或更多、優(yōu)選至少約1cm或更多、優(yōu)選至少約2cm或更多、優(yōu)選至少約3cm或更多、優(yōu)選至少約4cm或更多、優(yōu)選至少約5cm或更多、優(yōu)選至少約6cm或更多、優(yōu)選至少約7cm或更多、優(yōu)選至少約8cm或更多、優(yōu)選至少約9cm或更多、優(yōu)選至少約10cm或更多、優(yōu)選至少約15cm或更多、優(yōu)選至少約20cm或更多。與本發(fā)明電穿孔室內(nèi)壁上至少3個點(diǎn)相切的最大內(nèi)切圓直徑的上限可以是，但不限于，例如，約25cm、約20cm、約15cm、約10cm、約9cm、約8cm、約7cm、約6cm、約5cm、約4cm、約3cm、約2cm、約1cm、約9mm、約8mm、約7mm、或約6mm。長度可以是這些確切描述值間的中間值(如1.5cm等)。這里所用術(shù)語“內(nèi)切圓”是指與室容器內(nèi)壁上至少3個任意點(diǎn)相切的任何圓。這里，室中提供的電極也被看作是容器的一部分。因此，室容器的內(nèi)壁包括電極的表面。通常，電極的厚度是可以忽略不計(例如，0.1mm等)。
按照本發(fā)明一個方面，本發(fā)明的電穿孔室具有四邊形的橫截面和內(nèi)部尺寸，1cm×2cm×2cm(例如，長×寬×高)。按照本發(fā)明另一方面，電穿孔具有圓形的橫截面和內(nèi)部尺寸，1cm×4cm(例如，直徑×高)。由電極占據(jù)的區(qū)不包括在室的尺寸中。通常，電極的厚度可以忽略不計。這里所用術(shù)語“橫截面”是指與室的縱向垂直的橫截面。這里所用術(shù)語“內(nèi)部尺寸”是指室容器內(nèi)壁上兩個任意點(diǎn)之間的距離。當(dāng)室具有四邊形的橫截面時，內(nèi)部尺寸是指橫截面的長或?qū)?，或高。?dāng)室具有圓形的橫截面時，內(nèi)部尺寸是指橫截面的直徑，或高。
在其中一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的電穿孔室可被改變成使該室可容納植物種子的大小。室的大小可通過任何方式改變。例如，室的大小可利用螺釘?shù)葋碚{(diào)節(jié)至適宜的尺寸。
本發(fā)明的電穿孔室可由任何材料制成。電穿孔室的材料可以是形成固體的任何材料。這種材料的例子包括，但不限于，玻璃、硅石、硅、陶瓷、二氧化硅、塑料、金屬(包括合金)、天然及合成的聚合物(例如，聚苯乙烯、纖維素、脫乙酰殼聚糖、葡聚糖、和尼龍等)等。該室可由不同材料制成的層構(gòu)成。例如，可使用無機(jī)絕緣材料，如玻璃、石英玻璃、氧化鋁、藍(lán)寶石、鎂橄欖石、氧化硅、碳化硅、氮化硅等。可使用有機(jī)材料，如聚酰胺、聚碳酸酯、(變性)聚苯醚、聚對苯二甲酸丁二醇酯、增強(qiáng)的聚對苯二甲酸乙二酯、聚醚砜、聚苯硫醚、多芳基化合物、聚醚酰亞胺、聚醚醚酮、聚酰亞胺、聚酯、聚乙烯、聚丙烯、聚異丁烯、不飽和聚酯、氟樹脂、聚氯乙烯、聚偏1，1-二氯乙烯、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯醇、聚乙烯醇縮醛、丙烯酸類樹脂、聚丙烯腈、聚苯乙烯、縮醛樹脂、酚樹脂、尿素樹脂、環(huán)氧樹脂、三聚氰胺樹脂、苯乙烯-丙烯腈共聚物、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物、有機(jī)硅樹脂、聚砜等。此外，優(yōu)選，本發(fā)明的電穿孔室能夠抵抗不同于大氣壓的壓力(例如，甚至在將不同于大氣壓的壓力施加于該室時，該室不會破碎、斷裂、或變形)。特別優(yōu)選，該室能夠抵抗減壓。特別優(yōu)選，本發(fā)明的電穿孔室是由聚丙烯、有機(jī)硅樹脂、和玻璃制成的，且提供有鉑或不銹鋼制成的電極。
優(yōu)選，本發(fā)明的電穿孔室提供有溫度控制部分。例如，溫度控制部分可使用傳感器檢測溫度的變化，并可人工或自動控制室的溫度。溫度控制部分通常是用于降低室溫度的冷卻部分。冷卻部分可以是利用，例如，冰、冷卻凝膠等的任何裝置。
本發(fā)明的電穿孔室提供有至少一對(兩個)電極。因此，在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的室可提供有多于一對(兩個)的電極(例如，兩對(四個)電極、三對(六個)電極、四對(八個)電極、五對(十個)電極、或多于五對電極)。例如，在室具有四邊形橫截面的情況下，如果電極是沿著每個相對的內(nèi)側(cè)壁提供的，則可將兩對(四個)電極與該室連接。此外，在室具有六邊形橫截面的情況下，如果電極是沿著每個相對的內(nèi)側(cè)壁提供的，則可將三對(六個)電極與該室連接。因此，本發(fā)明的室中可提供任意對數(shù)的電極。且，電極具有任意的空間位置關(guān)系。
本發(fā)明電穿孔室中所提供電極之間的距離可具有任何長度，而且可根據(jù)進(jìn)行核酸轉(zhuǎn)移的細(xì)胞和/或組織的大小而改變。特別優(yōu)選，電極之間的距離足以容納植物組織(例如，植物種子)。電極之間足以容納植物種子的距離可以是，例如，至少約5mm或更多，優(yōu)選至少約6mm或更多，優(yōu)選至少約7mm或更多，優(yōu)選至少約8mm或更多，優(yōu)選至少約9mm或更多，優(yōu)選至少約1cm或更多，優(yōu)選至少約2cm或更多，優(yōu)選至少約3cm或更多，優(yōu)選至少約4cm或更多，優(yōu)選至少約5cm或更多，優(yōu)選至少約6cm或更多，優(yōu)選至少約7cm或更多，優(yōu)選至少約8cm或更多，優(yōu)選至少約9cm或更多，優(yōu)選至少約10cm或更多，優(yōu)選至少約15cm或更多，優(yōu)選至少約20cm或更多。電極之間距離的上限可以是，但不限于，例如，約25cm、約20cm、約15cm、約10cm、約9cm、約8cm、約7cm、約6cm、約5cm、約4cm、約3cm、約2cm、約1cm、約9mm、約8mm、約7mm、或約6mm。長度可以是這些確切描述值間的中間值(例如，1.5cm等)。
在其中一個實(shí)施方案中，電極之間的距離可被改變，從而使植物種子可容納于電極之間。電極之間的距離可通過任何方式改變。例如，可利用螺釘?shù)葘㈦姌O之間的距離調(diào)節(jié)至適宜距離。
電極可由任何材料制成，只要該材料具有導(dǎo)電的能力。電極材料的例子包括，但不限于，例如，鉑金、金、不銹鋼、碳、和導(dǎo)電聚合物。特別優(yōu)選電極是由鉑制成的。
舉例性的電穿孔室是長1cm×寬2cm×高2cm的直角平行六面體形，并提供有鉑電極，其中鉑電極之間的距離是約1cm。該電穿孔室特別用于具有中間大小(約5-15mm)的植物種子(例如，小麥、稻、玉米等)。使用該室，可同時處理許多(例如，約10-30粒)中間大小的植物種子。
另一舉例性電穿孔室為內(nèi)徑1cm×高4cm的微管形，并提供有不銹鋼電極，其中不銹鋼電極之間的距離是約1cm。這種微管形室可很容易通過使用粘合劑等將不銹鋼箔(例如，約5×40mm(厚度約0.1mm))與商業(yè)購得的微管連接而生產(chǎn)。該微管形室可經(jīng)受離心，從而使細(xì)胞、組織和/或種子沉淀在室底部。因此，很容易進(jìn)行溶液的更換。當(dāng)處理較小(約0.1-5mm時)的植物種子(例如，擬南芥(Arabidopsis thaliana)等)時，這種微管形室特別有用。使用該室，可同時處理很多較小的植物種子。
這里所用的“將細(xì)胞/組織(包括植物組織)保持在不同于大氣壓的壓力下”是指將細(xì)胞/組織(包括植物組織)保持在較之大氣壓(通常，1個大氣壓＝101.325kPa＝約0.1MPa)更高(增壓)或更低(減壓)的壓力下的步驟。
盡管不希望受到任何理論的束縛，但認(rèn)為通過將細(xì)胞/組織(包括植物組織)保持在不同于大氣壓的壓力下，可改變施加于細(xì)胞/組織上的周圍氣壓，從而使含有核酸，如DNA等的緩沖溶液滲透到組織或細(xì)胞之間的腔內(nèi)；且因此，它可通過電穿孔經(jīng)過核酸轉(zhuǎn)移/轉(zhuǎn)化，進(jìn)入到具有細(xì)胞壁的細(xì)胞和組織(特別是，植物細(xì)胞和植物組織)中，而這通常被認(rèn)為是不可能的。
這里所用術(shù)語“減壓”是指將細(xì)胞/組織(包括植物組織(例如，種子))保持在低于大氣壓的壓力下進(jìn)行核酸轉(zhuǎn)移/轉(zhuǎn)化的步驟。在本發(fā)明中，可以，但不限于，在比大氣壓低0.02MPa的壓力下，優(yōu)選在比大氣壓低0.04MPa的壓力下，更優(yōu)選在比大氣壓低0.06MPa的壓力下，更優(yōu)選在比大氣壓低0.08MPa的壓力下，最優(yōu)選在比大氣壓低0.096MPa的壓力下進(jìn)行減壓。減壓的運(yùn)行時間是，但不限于，1分鐘-120分鐘，優(yōu)選10分鐘-100分鐘，更優(yōu)選15分鐘-90分鐘，更優(yōu)選30-70分鐘，最優(yōu)選約60分鐘。
這里所用術(shù)語“增壓”是指將細(xì)胞/組織(包括植物組織(例如，種子))保持在比大氣壓更高的壓力下進(jìn)行核酸轉(zhuǎn)移/轉(zhuǎn)化的步驟。
按照本發(fā)明其中一個方面，提供一種電穿孔裝置。本發(fā)明的電穿孔裝置可以明顯較高的效率將核酸轉(zhuǎn)移到任何細(xì)胞或組織中，且特別用于將核酸轉(zhuǎn)移到具有細(xì)胞壁的細(xì)胞或組織(例如，植物細(xì)胞或植物組織)中，而這通常是利用電穿孔進(jìn)行核酸轉(zhuǎn)移所不能進(jìn)行的。在其中一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的電穿孔裝置包括a)用于將細(xì)胞保持在不同于大氣壓的壓力下的部分和b)電穿孔部分。
用于將細(xì)胞保持在不同于大氣壓的壓力下的部分可以是能夠進(jìn)行減壓和/或增壓的任何裝置。還可利用商業(yè)購得的減壓裝置(例如，真空干燥器等)和/或增壓裝置。任何電穿孔裝置都可使用?？衫蒙虡I(yè)購得的電穿孔裝置(例如，CUY21EDIT基因轉(zhuǎn)移裝置，Nepagene，Ichikawa-shi，Chiba-ken，日本)。優(yōu)選如上所述，電穿孔部分中提供的兩個電極(第一電極和第二電極)之間的距離足以容納植物種子。
在本發(fā)明另一實(shí)施方案中，提供一種包括兩個電極的電穿孔裝置，其中兩個電極之間的距離足以容納植物種子。電穿孔裝置可與將細(xì)胞/組織保持在不同于大氣壓的壓力下的裝置結(jié)合使用。在本實(shí)施方案中，電穿孔裝置和將細(xì)胞/組織保持在不同于大氣壓的壓力下的裝置并非必需存在與同一室內(nèi)。
常規(guī)的電穿孔裝置目的在于將高壓脈沖施加于非常小的細(xì)胞上。因此，室的內(nèi)壁和電極之間的距離需要被盡可能地減到最小。因此，室的內(nèi)部尺寸和常規(guī)電穿孔裝置中電極之間的距離通常為約1mm或2mm，或至多4mm。因此，這里提出的、包括具有足以容納植物種子的空間的室和其間距離足以容納植物種子的電極的電穿孔裝置迄今為止還是未知的。
此外，本發(fā)明的電穿孔裝置還可以是自動運(yùn)轉(zhuǎn)的。在本發(fā)明的自動電穿孔裝置中，緩沖溶液等的注入和/或更換可由自動分液機(jī)進(jìn)行。作為自動分液機(jī)，例如，可使用商業(yè)購得的epMotion5070工作站(Eppendorf Co.，Ltd.，Higashi-Kanda 3，Chiyoda-ku，Tokyo，日本)等。自動分液機(jī)不限于此。特別是，自動分液機(jī)可被有利用作容器中放置核酸和/或細(xì)胞的部分，該容器用于放置含有核酸及細(xì)胞的混合物。
用于放置含核酸及細(xì)胞的混合物的第一容器、用于將細(xì)胞保持在不同于大氣壓的壓力下的第二容器、以及用于向含核酸及細(xì)胞的混合物施加高壓脈沖的第三容器可以是任何容器。這些容器彼此可以相同或不同。這些容器的材料可以是能夠形成固體的任何材料。這種材料的例子包括，但不限于，玻璃、硅石、硅、陶瓷、二氧化硅、塑料、金屬(包括合金)、天然及合成的聚合物(例如，聚苯乙烯、纖維素、脫乙酰殼聚糖、葡聚糖、和尼龍等)等。該容器可由不同材料制成的層構(gòu)成。例如，可使用無機(jī)絕緣材料，如玻璃、石英玻璃、氧化鋁、藍(lán)寶石、鎂橄欖石、氧化硅、碳化硅、氮化硅等?？墒褂糜袡C(jī)材料，如聚酰胺、聚碳酸酯、(變性)聚苯醚、聚對苯二甲酸丁二醇酯、增強(qiáng)的聚對苯二甲酸乙二酯、聚醚砜、聚苯硫醚、多芳基化合物、聚醚酰亞胺、聚醚醚酮、聚酰亞胺、聚酯、聚乙烯、聚丙烯、聚異丁烯、不飽和聚酯、氟樹脂、聚氯乙烯、聚偏1，1-二氯乙烯、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯醇、聚乙烯醇縮醛、丙烯酸類樹脂、聚丙烯腈、聚苯乙烯、縮醛樹脂、酚樹脂、尿素樹脂、環(huán)氧樹脂、三聚氰胺樹脂、苯乙烯-丙烯腈共聚物、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物、有機(jī)硅樹脂、聚砜等。
優(yōu)選，本發(fā)明的第一容器是由高度透明且有利于觀察樣品的材料(例如，聚苯乙烯)生產(chǎn)的。優(yōu)選，本發(fā)明的第二容器是由能夠抵抗不同于大氣壓的壓力(特別是，減壓)的材料(例如，聚酰胺、聚碳酸酯、(變性)聚苯醚、聚對苯二甲酸丁二醇酯、增強(qiáng)的聚對苯二甲酸乙二酯、聚醚砜、聚苯硫醚、多芳基化合物、聚醚酰亞胺、聚醚醚酮、聚酰亞胺、和環(huán)氧樹脂)生產(chǎn)的，且更優(yōu)選是由高度透明且有利于觀察樣品的材料(如丙烯酸類樹脂)生產(chǎn)的。優(yōu)選，本發(fā)明的第三容器是由對細(xì)胞具有親和性的材料(例如，聚丙烯、有機(jī)硅樹脂、和玻璃)生產(chǎn)的，并提供有鉑、金、不銹鋼、碳、或?qū)щ娋酆衔镏瞥傻碾姌O。這些材料還可用任何適宜的材料覆蓋，從而提供所需性質(zhì)(例如，容器的絕緣，提高電極的導(dǎo)電性等)。
此外，優(yōu)選，本發(fā)明的第一和第二容器能夠抵抗不同于大氣壓的壓力。特別優(yōu)選，本發(fā)明的第一和第二容器能夠抵抗減壓。例如，第一容器可安裝在第二和/或第三容器中?？蛇x擇性地，含有核酸及細(xì)胞的混合物是從第一容器注入到第二容器(或安裝在其中的另一容器)和/或第三容器(或安裝在其中的另一容器)中的。
作為將細(xì)胞放在第二容器中的部分以及將含有核酸及細(xì)胞的混合物放在第三容器中的部分，可有利地使用皮帶運(yùn)輸機(jī)。本發(fā)明不限于此?？墒褂萌魏窝b置。在第一容器、第二容器、和第三容器中放置的液體可通過利用自動泵等吸出/排出而除去。
本發(fā)明的自動電穿孔裝置包括用于使各種操作裝置自動化的控制裝置。本發(fā)明的電穿孔裝置包括電源裝置?？刂蒲b置和電源裝置可安裝在包括電穿孔裝置的同一室內(nèi)，或可與電穿孔裝置隔開而且可與電穿孔裝置相連。
當(dāng)種子進(jìn)行電穿孔時，優(yōu)選在減壓或增壓前將種子浸在水(例如，自來水)中。處理前將種子浸在水中的時間為，但不限于，6h-48h，優(yōu)選12h-36h，更優(yōu)選18h-30h，甚至更優(yōu)選20h-26h，最優(yōu)選24h。
本發(fā)明用于核酸轉(zhuǎn)移的舉例性條件如下所述。將種子浸在自來水中，25℃過夜。第二天，將種子放在真空裝置中，接著在比大氣壓低0.096MPa的壓力下進(jìn)行減壓。之后，將高壓脈沖(100V、50μsec、電極之間的距離1cm)施加于通過減壓進(jìn)行電穿孔處理，即，核酸轉(zhuǎn)移/基因轉(zhuǎn)移的種子上約50次。電壓和脈沖的次數(shù)可根據(jù)農(nóng)作物而改變。進(jìn)行電穿孔的條件可由本領(lǐng)域那些技術(shù)人員根據(jù)需要適當(dāng)選擇。之后，在含有抗生素的培養(yǎng)基中篩選細(xì)胞或組織，接著，裝入盆中(在盆中栽培)，由此可獲得標(biāo)準(zhǔn)的全株植物。
這里所用術(shù)語“植物”是包括屬于植物界的生物的通稱，其特征在于含有葉綠體、具有剛性細(xì)胞壁、永久產(chǎn)生豐富的胚組織，且沒有移動的能力。例如，在“Genshoku Makino Shokubutsu Daizukan[Unabridged Makino′s Original Color Illustrated Reference Book ofPlants]，Hokuryukan(1982)，日本)等中將植物分類。其中所述的所有植物都可用于本發(fā)明。代表性地，植物是指形成細(xì)胞壁并通過葉綠體進(jìn)行合成代謝的開花植物?！爸参铩卑ㄈ魏螁巫尤~和雙子葉植物。單子葉植物的例子包括禾本科植物。優(yōu)選的單子葉植物的例子包括，但不限于，玉米、小麥、稻、燕麥、大麥、高梁、黑麥、和小米，更優(yōu)選玉米、小麥和稻。小麥的例子包括小麥變種Norin 61，其很難通過常規(guī)方法轉(zhuǎn)化。雙子葉植物的例子包括，但不限于十字花科、豆科、茄科、葫蘆科和旋花科的植物。十字花科植物的例子包括，但不限于，大白菜、油菜、卷心菜、和花椰菜。優(yōu)選的十字花科植物是大白菜和油菜。特別優(yōu)選的十字花科植物是油菜。豆科植物的例子包括，但不限于，大豆、紅豆、菜豆、和豇豆。優(yōu)選的豆科植物是大豆。茄科植物的例子包括，但不限于，番茄、茄子、和馬鈴薯。優(yōu)選的茄科植物是番茄。葫蘆科植物的例子包括，但不限于，日本香瓜、黃瓜、甜瓜和西瓜。優(yōu)選的葫蘆科植物是日本香瓜。旋花科植物的例子包括，但不限于，牽?；ā⒏适?、和bellbind。優(yōu)選的旋花科植物是牽?；?。除非特別說明，植物是指任何全株植物、植物器官、植物組織、植物細(xì)胞和種子。植物器官的例子包括根、葉、莖、花等。植物細(xì)胞的例子包括愈傷組織及培養(yǎng)細(xì)胞的懸浮液。在特定實(shí)施方案中，植物是指全株植物。
在本發(fā)明另一實(shí)施方案中，例如，可使用茄科、禾本科、十字花科、薔薇科(Rosaceae)、豆科、葫蘆科、唇形科(Lamiacea)、百合科(Liliaceae)、藜科(Chenopodiaceae)、傘形科(Umbelliferae)、旋花科、菊科(Compositae)等的植物。本發(fā)明所用植物物種的例子包括任何樹種，果樹物種、桑科(Moraceae)植物(例如，橡樹)、和錦葵科(Malvaceae)植物(例如，棉花)。
在本發(fā)明的簡單方法中，植物組織(包括休眠組織(包括成熟種子、未成熟種子、冬芽、和塊莖)、種質(zhì)、生長點(diǎn)、和花芽)進(jìn)行電穿孔。在最簡單的方法中，種子進(jìn)行電穿孔。通過將已經(jīng)用本發(fā)明的電穿孔方法將核酸轉(zhuǎn)移到其中的種子直接種在土壤中進(jìn)行種植，該種子可很容易發(fā)育成核酸轉(zhuǎn)移物質(zhì)/轉(zhuǎn)化體。種子通常是由3部分組成的，即，胚、胚乳、和種皮(Yakichi Noguchi and Shinichiro Kawata，supervisors，Nogaku-Daijiten[Unabridged Dictionary ofAgriculture]，Yokendo(1987)，p.896(由Hideo Chizaka準(zhǔn)備的相應(yīng)部分))。胚包括植物的所有基因信息，并生長成全株植物。所有單子葉植物和所有雙子葉植物都有胚。當(dāng)通過本發(fā)明的電穿孔方法進(jìn)行核酸轉(zhuǎn)移時，經(jīng)證實(shí)所引入的核酸在胚中表達(dá)。因此，本發(fā)明的最簡單方法可用于在任何具有包括胚的種子的植物中很容易獲得核酸轉(zhuǎn)移的全株植物/轉(zhuǎn)化體。
十字花科植物的例子包括蘿卜屬(Raphanus)、芥屬(Brassica)、擬南芥屬、Wasabia、和薺屬(Capsella)的植物。具體的例子包括日本白蘿卜、油菜籽、擬南芥、日本辣根、和薺菜。
禾本科植物的例子包括稻屬(Oryza)、小麥屬(Triticum)、大麥屬(Hordeum)、黑麥屬(Secale)、甘蔗屬(Saccharum)、高粱屬(Sorghum)和玉米屬(Zea)的植物。具體的例子包括稻、大麥、黑麥、甘蔗、高粱、和玉米。
這里所用的術(shù)語“動物”共同指動物界(Aminalia)的生物，它們需要氧氣和有機(jī)食品，而且在移動能力方面不同于植物和礦物。動物分為脊椎動物和無脊椎動物。作為脊椎動物，可使用盲鰻目(Myxiniformes)、七鰓鰻目(Petromyzontiformes)、軟骨魚綱(Chondrichthyes)、硬骨魚綱(Osteichthyes)、兩棲動物、爬行動物、鳥類、哺乳動物等。更優(yōu)選，可使用哺乳動物(例如，單孔目(Monotremate)、有袋目(Marsupialia)、貧齒目(Edentata)、皮翼目(Dermoptera)、翼手目(Chiroptera)、食肉目(Carnivore)、食蟲目(Insectivore)、長鼻目(Proboscidea)、奇蹄目(Perissodactyla)、偶蹄目(Artiodactyla)、管齒目(Tubulidentata)、鱗甲目(Pholidota)、海牛目(Sirenia)、鯨目(Cetacean)、靈長目(Primates)、嚙齒目(Rodentia)、兔形目(Lagomorpha)等)。甚至更優(yōu)選使用靈長目(例如，黑猩猩、日本獼猴、人)。最優(yōu)選，使用來源于人的細(xì)胞或器官。作為無脊椎動物，可使用甲殼綱(Crustacea)、倍足綱(Diplopoda)、燭蛺綱(Pauropoda)、唇足綱(Chilopoda)、綜合綱(Symphyla)、昆蟲綱(Insecta)等。更優(yōu)選，使用昆蟲(例如，鱗翅目(Lepidoptera)，包括蠶(Bombyx mori Linnaeus)等)。
這里所用術(shù)語“轉(zhuǎn)基因生物”是指其中摻入特定基因的生物；術(shù)語“轉(zhuǎn)基因植物”是指其中摻入特定基因的植物；術(shù)語“轉(zhuǎn)基因動物”是指其中摻入特定基因的動物。
已經(jīng)通過本發(fā)明方法經(jīng)過核酸轉(zhuǎn)移/轉(zhuǎn)化的細(xì)胞和組織可利用本領(lǐng)域任何已知的方法分化、生長、和/或增殖。在植物物種中，使細(xì)胞或組織分化、生長、和/或增殖的步驟可通過，例如，培養(yǎng)植物細(xì)胞或植物組織或包括細(xì)胞或組織的全株植物而實(shí)現(xiàn)。植物在這里可通過本領(lǐng)域任何已知的方法培育。培育植物的方法在，例如“Moderu shokubutsuno Jikken Purotokoru，Ine ShiroinunazunaSaibo kogaku BessatsuShokubutsu Saibo Kogaku Sirizu 4；Ine no Saibaiho[ExperimentalProtocol for Model Plants For Rice and Arabidopsis thalianaCellularEngineering，Special Issue，Plant Cellular Engineering Series 4；RiceCultivating Methods]”(Kazutoshi Okuno)pp.28-32，和“Shiroinunazuna no saibaiho[Cultivating Methods forArabidopsis]”(Yasuo Niwa)pp.33-40(Supervised by Ko Shimamotoand Kiyotaka Okada)中舉例說明，且本領(lǐng)域那些技術(shù)人員可很容易地進(jìn)行。因此，這些方法沒有在這里詳細(xì)描述。例如，擬南芥可通過土壤培養(yǎng)、巖棉(rockwol)培養(yǎng)、或水培法培養(yǎng)來培育。當(dāng)撒播擬南芥的種子并在連續(xù)光照條件(冷白色熒光管(約6000lux))下培育時，第一朵花在播種后約4周長出，種子在開花后約16天成熟。一個種子罐包含約40-50個種子。在播種后約2-3個月植物死亡前，可獲得大約10,000個種子。在小麥的培育中，例如，已知除非小麥種子暴露于低溫下并在播種后接受短日照處理，否則植物不會抽穗和開花。因此，例如，當(dāng)在人工環(huán)境(例如，溫室或生長室)下培育小麥時，必需使小麥植株在早期發(fā)育階段經(jīng)過低溫和短日照處理(例如，光照期20℃，8小時(約2000lux)，黑暗期8℃，16小時等)。這種處理被稱作春化。每種植物所需的培育條件通常是本領(lǐng)域已知的，因此，無需在這里詳細(xì)描述。
在除了植物之外的物種(例如，動物物種)中，通過本發(fā)明方法經(jīng)過核酸轉(zhuǎn)移/轉(zhuǎn)化的細(xì)胞和組織可利用本領(lǐng)域任何已知的方法分化、生長、和/或增殖(見，例如，Yoshiharu Izumi等人，eds.，“SeibutsuKagaku Jikken no Tebiki 4.Dobutsu Soshiki Jikkenho[Guidelines for Biochemical Experiments 4.Experimental Protocol forAnimal Tissue]，Kagaku Dojin，1987，等)。例如，已經(jīng)通過電穿孔向其中轉(zhuǎn)移核酸的細(xì)胞和/或組織可在室溫(約25℃)下用商業(yè)購得的飼料使其生長。
如這里所用的，所轉(zhuǎn)移的基因是多核苷酸形成的。
這里所用術(shù)語“多核苷酸”、“寡核苷酸”及“核酸”具有相同的含義，是指任何長度的核苷酸的聚合物。這些術(shù)語還包括“衍生的寡核苷酸”或“衍生的多核苷酸”。術(shù)語“衍生的寡核苷酸”和“衍生的多核苷酸”可互換用于指含有核苷酸衍生物或核苷酸之間所具有的鍵不同于正常鍵的寡核苷酸或多核苷酸。具體而言，這種寡核苷酸的例子包括2′-O-甲基-核糖核苷酸、其中的磷酸二酯鍵轉(zhuǎn)化成硫代磷酸酯鍵的衍生寡核苷酸、其中的磷酸二酯鍵轉(zhuǎn)化成N3′-P5′氨基磷酸酯鍵的衍生寡核苷酸、其中的核糖及磷酸二酯鍵轉(zhuǎn)化成肽核酸鍵的衍生寡核苷酸、其中的尿嘧啶被C-5丙炔基尿嘧啶取代的衍生寡核苷酸、其中的尿嘧啶被C-5噻唑尿嘧啶取代的衍生寡核苷酸、其中的胞嘧啶被C-5丙炔基胞嘧啶取代的衍生寡核苷酸、其中的胞嘧啶被吩噁嗪修飾的胞嘧啶取代的衍生寡核苷酸、其中的核糖被2′-O-丙基核糖取代的衍生寡核苷酸、和其中的核糖被2′-甲氧基乙氧基核糖取代的衍生寡核苷酸。除非另有說明，特定的核酸序列還暗含包括其保守修飾的變體(例如，簡并密碼子置換)及其互補(bǔ)序列，以及明確指出的序列。具體而言，簡并密碼子置換可通過產(chǎn)生其中一個或多個所選(或全部)密碼子的第三個位置被混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代的序列而實(shí)現(xiàn)(Batzer等人，Nucleic Acid Res.，195081，1991；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.，2602605-2608，1985；Rossolini等人，Mol.Cell.Probes，891-98，1994)。在這里術(shù)語“核酸”與“基因”、“cDNA”、“mRNA”、“寡核苷酸”、和“多核苷酸”互換使用。具體的核酸序列還暗含包括“剪接變體”。類似地，由核酸編碼的特定蛋白暗含包括由該核酸剪接變體編碼的任何蛋白?！凹艚幼凅w”，就像它名稱所暗示的那樣，是基因的選擇性剪接產(chǎn)物。轉(zhuǎn)錄后，原始的核酸轉(zhuǎn)錄物可被剪接，這樣不同(可變)的核酸剪接產(chǎn)物編碼不同的多肽。用于生產(chǎn)剪接變體的機(jī)理可改變，但包括外顯子的可變剪接。通過連讀轉(zhuǎn)錄從同一核酸衍生的可變多肽也包括在該定義內(nèi)。剪接反應(yīng)的任何產(chǎn)物，包括剪接產(chǎn)物的重組形式也包括在該定義中。
這里所用“基因”是指確定遺傳性狀的因子。基因通常以預(yù)定的順序排列在染色體上。確定蛋白一級結(jié)構(gòu)的基因被稱作結(jié)構(gòu)基因。控制結(jié)構(gòu)基因表達(dá)的基因被稱作調(diào)節(jié)基因。這里所用“基因”還指“多核苷酸”、“寡核苷酸”、及“核酸”。這里所用的基因“同源性”是指兩個或多個基因序列之間的同一性程度。因此，兩個基因之間的同源性越大，它們序列之間的同一性或相似性就越大。兩個基因是否具有同源性是通過直接比較它們的序列或在核酸的情況下，通過嚴(yán)格條件下的雜交方法而確定的。當(dāng)直接互相比較兩個基因序列時，如果基因的DNA序列彼此通常具有至少50％、優(yōu)選至少70％、更優(yōu)選至少80％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性，則基因具有同源性。
堿基序列之間同一性的比較和堿基序列之間同源性的計算在這里是使用具有缺省參數(shù)的序列分析工具BLAST計算的。
這里所用的基因、多核苷酸、多肽等的“表達(dá)”表示基因等在體內(nèi)經(jīng)過某些作用并轉(zhuǎn)化成其它形式。優(yōu)選，基因、多核苷酸等經(jīng)過轉(zhuǎn)錄并翻譯成多肽形式，然而，mRNA通過轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)生可以是表達(dá)的體現(xiàn)。更優(yōu)選，這種多肽的形式可通過翻譯后的加工獲得。
這里所用“核苷酸”可天然存在或非天然存在?！把苌塑账帷被颉昂塑账犷愃莆铩笔侵覆煌谔烊淮嬖诘暮塑账?，但具有與天然存在的核苷酸相似的功能的核苷酸。這種衍生核苷酸及核苷酸類似物是本領(lǐng)域熟知的。這種衍生核苷酸及核苷酸類似物的例子包括，但不限于，硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基-膦酸酯、手性甲基-膦酸酯、2-O-甲基-核糖核苷酸、及肽核酸(PNA)。
這里所用術(shù)語“片段”是指相對于全長多肽或多核苷酸(其長度為n)而言具有1-n-1序列長度的多肽或多核苷酸.根據(jù)目的不同，可適當(dāng)改變片段的長度。例如，多肽長度的下限是，例如，3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50和更多氨基酸。其沒有在這里明確舉例說明的整數(shù)(例如，11等)也可適當(dāng)作為下限。多核苷酸的下限是，例如，5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、75、100和更多核苷酸。其沒有在這里明確舉例說明的整數(shù)(例如，11等)也可適當(dāng)作為下限。
本發(fā)明中所用的一般分子生物學(xué)技術(shù)可通過參考Ausubel F.A.等人，eds.，Current Protocols in Molecular Biology，Wiley，New York，NY，1988；Sambrook J.等人，Molecular CloningA LaboratoryManual，2nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY，1987等，由本領(lǐng)域那些技術(shù)人員很容易地進(jìn)行。
在這里討論基因時，“載體”是指能夠?qū)⒛繕?biāo)多核苷酸序列引入到靶細(xì)胞中的載體。這種載體包括能夠在宿主細(xì)胞，如原核生物細(xì)胞、酵母細(xì)胞、動物細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、個體動物和植物，優(yōu)選植物細(xì)胞中自我復(fù)制，或被摻入到其染色體中，并具有位于適合本發(fā)明多核苷酸轉(zhuǎn)錄的位點(diǎn)處的啟動子的載體。
這里所用術(shù)語“表達(dá)載體”是指含有結(jié)構(gòu)基因和用于調(diào)節(jié)其表達(dá)的啟動子的核酸序列，以及此外處于允許它們在宿主細(xì)胞內(nèi)活動的狀態(tài)的各種調(diào)節(jié)元件。調(diào)節(jié)元件可優(yōu)選包括終止子、選擇標(biāo)記如藥物-抗性基因、和增強(qiáng)子。本領(lǐng)域那些技術(shù)人員熟知生物(例如，植物)表達(dá)載體的類型和調(diào)節(jié)元件的類型可根據(jù)宿主細(xì)胞而改變。用于篩選的選擇標(biāo)記的例子包括，但不限于，藥物-抗性基因，如編碼產(chǎn)生對抗生素卡那霉素抗性的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶的neo基因(Beck等，Gene，19327，1982)；編碼產(chǎn)生對抗生素潮霉素抗性的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶的hyg基因(Gritz和Davies，Gene，25179，1983)；和編碼產(chǎn)生對除草劑膦絲菌素抗性的膦絲菌素乙?；D(zhuǎn)移酶的基因(EP 242236)；編碼鏈霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶的spt基因；鏈霉素抗性基因；和壯觀霉素抗性基因(例如，H.S.Chawla，Introduction to Plant Biotechnology 2nd363，SciencePublishers，Inc.，hard cover，2002)；和選擇標(biāo)記基因，如編碼β-葡糖醛酸糖苷酶的GUS基因(Jefferson等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，63901，1986)、螢光素酶基因(Ow等人，Science，234856，1986)、和GFP(綠色熒光蛋白)編碼基因(例如，從Funakoshi Co.，Ltd.，Hongo，Bunkyo-ku，Tokyo，日本購得)。
用于本發(fā)明篩選的制劑的例子包括，但不限于，卡那霉素、潮霉素、遺傳霉素、慶大霉素、鏈霉素和壯觀霉素。
“重組載體”是指可將目標(biāo)多核苷酸序列轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞的載體。這種載體的例子包括能夠自我復(fù)制或能夠被摻入到宿主細(xì)胞(例如，植物細(xì)胞和全株植物)內(nèi)的染色體中的載體，并包括位于適合本發(fā)明多核苷酸轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)的啟動子。
植物細(xì)胞“重組載體”的例子包括Ti質(zhì)粒、煙草花葉病病毒(tobaccomosaic virus)載體、和雙生病毒(Gemini virus)載體。
“終止子”是位于基因的蛋白-編碼區(qū)下游，并在DNA被轉(zhuǎn)錄到mRNA中時，參與轉(zhuǎn)錄終止以及聚腺苷酸序列加成的序列。已知終止子有助于mRNA的穩(wěn)定性，并對基因表達(dá)量產(chǎn)生影響。這種終止子的例子包括，但不限于，CaMV35S終止子、胭脂氨酸合酶基因的終止子(Tnos)、和煙草PR1a基因的終止子。這里所用的“啟動子”是確定基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的堿基序列，且是直接調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄頻率的DNA區(qū)。轉(zhuǎn)錄是由與啟動子結(jié)合的RNA聚合酶啟動的。啟動子區(qū)通常位于推定蛋白編碼區(qū)的第一個外顯子上游約2kbp內(nèi)。因此，可通過使用DNA分析軟件預(yù)測基因組堿基序列中的蛋白編碼區(qū)而估計啟動子區(qū)。推定啟動子區(qū)通常位于結(jié)構(gòu)基因的上游。優(yōu)選，推定啟動子區(qū)位于第一個外顯子的翻譯起始位點(diǎn)上游的約2kbp內(nèi)。
當(dāng)在本說明書中提到基因表達(dá)時，“位點(diǎn)特異性”通常是指基因相對于生物(例如，植物)內(nèi)位點(diǎn)(例如，在植物的情況下；根、莖、干、葉、花、種子、胚芽、胚、果實(shí)等)的表達(dá)特異性?！皶r間特異性”是指基因相對于生物(例如，植物)發(fā)育階段(例如，在植物的情況下，生長階段，和發(fā)芽后的天數(shù))的表達(dá)特異性。這種特異性可使用適當(dāng)選擇的啟動子被引入到所需生物中。
這里相對于本發(fā)明啟動子表達(dá)所用的術(shù)語“組成型”是指啟動子的特征，即啟動子以基本恒定的量在生物的所有組織中表達(dá)，而不管生物的生長階段是幼年階段還是成熟階段。具體而言，當(dāng)在與本說明書實(shí)施例中描述的那些相同的條件下進(jìn)行RNA印跡分析時，按照本發(fā)明的定義，例如，如果在任何時間(例如，兩個或多個時間點(diǎn)(例如，第5天和第15天))的相同或相應(yīng)位點(diǎn)觀察到基本相同量的表達(dá)，則表達(dá)被認(rèn)為是組成型的。組成型啟動子被認(rèn)為在正常生長環(huán)境中維持生物的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面發(fā)揮作用。這里相對于啟動子表達(dá)所用的啟動子表達(dá)的“應(yīng)激反應(yīng)”是指啟動子的特征，即當(dāng)生物經(jīng)過至少一次應(yīng)激時，啟動子的表達(dá)量發(fā)生改變。特別是，增加表達(dá)量的特征被稱作“應(yīng)激誘導(dǎo)型”。減少表達(dá)量的特征被稱作“應(yīng)激抑制型”?！皯?yīng)激抑制型”表達(dá)是以在正常情況下觀察表達(dá)作為前提的。因此，這個概念與“組成型”表達(dá)重疊。這些特征可通過提取生物任何部分的RNA并通過RNA印跡分析RNA表達(dá)量或通過蛋白質(zhì)印跡測定表達(dá)蛋白的量而測定。當(dāng)用含有應(yīng)激誘導(dǎo)型啟動子及編碼目標(biāo)多肽的核酸的載體轉(zhuǎn)化植物或其一部分(特別是細(xì)胞/組織等)時，具有誘導(dǎo)啟動子活性的刺激物可用于引起特定的基因在預(yù)定條件下表達(dá)。
這里所用術(shù)語“增強(qiáng)子”是指用于提高目標(biāo)基因表達(dá)效率的序列。作為用于植物中的增強(qiáng)子，含有在CaMV35S啟動子內(nèi)上游序列的增強(qiáng)子區(qū)是優(yōu)選的?？墒褂靡粋€或多個增強(qiáng)子，或不使用增強(qiáng)子。
這里所用術(shù)語“可操縱連接”表示所需序列位于其表達(dá)(操縱)處于轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)序列(例如，啟動子、增強(qiáng)子等)控制下的位置。為了使啟動子與基因可操縱連接，通常，啟動子直接位于基因的上游。然而，間插序列可存在于啟動子和結(jié)構(gòu)基因之間，因此啟動子無需與結(jié)構(gòu)基因鄰接。
引入基因的存在可通過DNA印跡或PCR加以證實(shí)。引入基因的轉(zhuǎn)錄還可通過RNA印跡或PCR檢測。如果需要，蛋白，其是基因產(chǎn)物，的表達(dá)可通過，例如，蛋白質(zhì)印跡加以證實(shí)。
在下文中，將通過實(shí)施例描述本發(fā)明。下面的實(shí)施例僅用于舉例說明的目的。因此，本發(fā)明的范圍不限于上述說明或下面的實(shí)施例，除了通過附加的權(quán)利要求來限定之外。
實(shí)施例(方法和材料)(1)轉(zhuǎn)移基因在本發(fā)明中，主要使用含有抗生素抗性基因和/或GUS基因的質(zhì)粒DNA。本發(fā)明不限于此。在下面的實(shí)施例中，使用下列3種質(zhì)粒。pBI221(Clontech)含有花椰菜花葉病毒(Cauflower mosaic virus)(CMV)的35S啟動子，β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)基因，和胭脂氨酸合酶基因(NOS)的終止子。該質(zhì)粒主要以GUS活性為基礎(chǔ)用于監(jiān)控基因的轉(zhuǎn)移。pWI-H5K(其限制性酶切圖在圖1中表示)是通過除去pWI-GUS中的GUS基因(Masashi Ugaki等，Nucleic Acids Res.，19371-377，1991)并向其中插入NPT II基因而構(gòu)造的。pWI-H5K含有hpt(潮霉素抗性基因)，CMV的終止子，NPT II(卡那霉素和慶大霉素抗性基因)，和CMV的35S啟動子和終止子。pBC1已經(jīng)由CornelUniversity(美國)的Fromm博士(現(xiàn)在，F(xiàn)romm博士屬于Monsanto公司)研究。pBC1含玉米乙醇脫氫酶基因的啟動子和內(nèi)含子的一部分，GUS基因，NOS的終止子，CMV的35S啟動子，和hpt(潮霉素抗性基因)，NOS的終止子(Hagio等，Plant Cell Rep.，14329-334，1995)。作為質(zhì)粒DNA，可使用pWI-GUS質(zhì)粒中的GUS基因被GFP(綠色熒光蛋白)基因取代的質(zhì)粒，pigA3GFP質(zhì)粒(Tamura，Journal ofSericultural Science of Japan，691-12，2000)等。
(2)種子的預(yù)處理(第1天)實(shí)施例中所用的種于是由本發(fā)明人生產(chǎn)的或從種子和幼苗公司購買的。通過目測(大小不同)選擇約10-30粒適宜的成熟種子，并浸在自來水中25℃過夜，使種子吸水。優(yōu)選，吸水所用的自來水含有用于防止各種細(xì)菌增殖的次氯酸鈉水溶液(調(diào)節(jié)至約0.01％的有效氯濃度)。在生產(chǎn)小麥轉(zhuǎn)化體目的的實(shí)驗(yàn)中，優(yōu)選吸水是在10℃下進(jìn)行2個晚上。
(3)電穿孔裝置本發(fā)明所用的電穿孔裝置可以是商業(yè)購得的電穿孔裝置(例如，CUY21EDIT基因轉(zhuǎn)移裝置，Nepagene Co.，Ltd.，Ichikawa-shi，Chiba-ken，日本)。
在本實(shí)施例中，用于進(jìn)行電穿孔的電穿孔室可以是具有任何大小的電穿孔室，這樣它就可容納被轉(zhuǎn)化的植物組織。優(yōu)選是能夠被冷卻的室。在本實(shí)施例中，使用具有鉑電極和長1cm×寬2cm×高2cm尺寸的電穿孔室。
(4)緩沖溶液的制備(第2天)在每個實(shí)驗(yàn)中，使用1.5ml或更少的緩沖溶液和150μg的質(zhì)粒DNA。所述緩沖溶液是由250mM氯化鈣、12.5mM亞精胺、0.5％聚乙烯吡咯烷酮、和0.3％Tween 20組成的。
(5)減壓將緩沖溶液和已經(jīng)開始發(fā)芽的種子放在直徑35mm×深10mm的培養(yǎng)皿中，接著使用低于大氣壓0.096MPa或0.06MPa的壓力減壓1小時。
(6)電穿孔減壓后，將種子和緩沖溶液從培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移到室中，室依次在冰上維持1分鐘。之后，將具有50μsec脈沖寬度的100V或50V脈沖電壓(即，矩形電波，其中施加電壓50μsec，然后停止施加電壓75μsec，重復(fù)該循環(huán))施加于電極之間，電極之間的距離為1cm。脈沖次數(shù)是50或99。進(jìn)一步使該室在冰上維持2分鐘。之后，除去緩沖溶液，并將種子放回到原始培養(yǎng)皿中。將2ml 0.5％的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)水溶液傾注在包含種子的培養(yǎng)皿中。所述PVP水溶液含有次氯酸鈉水溶液，其被調(diào)節(jié)至約0.01％的有效氯濃度，用于防止各種細(xì)菌增殖。
將培養(yǎng)皿在4℃下保存約1小時，并在25℃維持過夜。
(7)種子的后處理(第3天)在接下來的一天，除去緩沖溶液，并向培養(yǎng)皿中加入2ml新的具有相同組成的緩沖溶液。使培養(yǎng)皿在25℃下維持過夜。
(8)GUS分析(第4天)在接下來的一天，除去緩沖溶液，向培養(yǎng)皿中加入2ml X-Gluc溶液(100mM磷酸緩沖溶液，pH7.0，0.05％X-Gluc(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷酸環(huán)己基銨鹽)、0.5mM鐵氰化鉀、0.5mM亞鐵氰化鉀、0.3％Triton X-100、20％甲醇)。使培養(yǎng)皿在25℃維持過夜。GUS基因的表達(dá)是在第5天和之后通過染色加以證實(shí)的。
(9)使用含抗生素的培養(yǎng)基篩選(第4天和之后)種子是如下生長的，沒有進(jìn)行GUS分析。
a)將種子轉(zhuǎn)移到9cm×15mm的培養(yǎng)皿中，其中已經(jīng)鋪了一片濾紙。
b)將10ml含有抗生素的蒸餾水溶液加入到培養(yǎng)皿中。當(dāng)用遺傳霉素篩選小麥種子時，其濃度為2000rpm或1200ppm。當(dāng)用遺傳霉素篩選稻的種子時，其濃度為200ppm。
c)種子是下列條件下，在培養(yǎng)室中生長的(光照期25℃，16h，約2000lux；黑暗期25℃，8h)或(光照期20℃，8h，約2000lux；黑暗期8℃，16h)。
(10)轉(zhuǎn)化體的生長(第11天和之后)用含抗生素的培養(yǎng)基篩選后，將植物種在直徑8.5cm×高5.5cm、含有園藝土的罐(花盆)中(New Magic Soil；Sakata Seed Corporation，Tsuzuki-ku，Yokohama-shi，日本)，它們在單獨(dú)的生長室中生長，條件如下(光照期15℃，8h，約5000lux(鈉燈)；黑暗期15℃，16h)或(光照期20℃，8h，約2000lux；黑暗期8℃，16h)。
(11)DNA提取基因轉(zhuǎn)移是使用如下PCR加以證實(shí)的。收集轉(zhuǎn)化植物的葉和莖，并提取葉和莖的DNA。DNA提取可通過任何熟知的技術(shù)進(jìn)行。一般的DNA提取技術(shù)是CTAB技術(shù)(Hirofumi Uchimiya，“ShokubutsuIdenshi Sosa Manyuaru Toransugenikku Shokubutsu noTsukurikata[Manual of Plant Genetic Engineering；How To ProduceTransgenic Plants]”，Kodansha Scientific，pp.71-74，hardcover，1989)。
(12)PCR分析電穿孔后，在第14天提取各植物葉子的DNA。在PCR中使用一對引物(5’-ctgcgtgcaatccatcttg-3’(SEQ ID NO.1)，5’-actcgtcaagaaggcgatagaag-3’(SEQ ID NO.2))檢測NPT II基因。還可使用另一對引物(5’-catgattgaacaagatggattgcacgcaggttctc-3’(SEQ IDNO.3)，5’-cagaagaactcgtcaagaaggcgatagaaggcgat-3’(SEQ ID NO.4))。這種引物對可更優(yōu)選以更特異的方式用于檢測NPT II基因。作為聚合酶，按照制造商的說明(Perkin Elmer Japan Co.，Ltd.(Nishi-ku，Yokohama-shi，日本)使用AmpliTaqGold(注冊商標(biāo))。用于擴(kuò)增的熱循環(huán)是在下列設(shè)置下使用的
(a)95℃10分鐘(循環(huán)1次)；(b)95℃1分鐘，64℃2分鐘和72℃2分鐘(循環(huán)50次)；(c)72℃7分鐘(循環(huán)1次)；和(d)在4℃下保存。
(13)DNA印跡分析電穿孔后，對來源于各植物的DNA進(jìn)行DNA印跡分析，所述植物已經(jīng)通過(12)中的PCR分析被證實(shí)具有引入基因。DNA印跡是本領(lǐng)域熟知的，因此其條件可由本領(lǐng)域那些技術(shù)人員根據(jù)需要適當(dāng)選擇。在DNA印跡分析中，使用對引入的NPT II基因特異的序列(如序列表中SEQ ID NO.5所示)作為探針。
(14)遺傳分析通過DNA印跡分析證實(shí)具有引入基因的植物進(jìn)一步生長，接著自花授粉。結(jié)果，獲得很多成熟的種子。在這些種子之中，隨機(jī)選擇約10粒種子，并在含土壤的罐中培育。提取幼株葉子的DNA。將所述DNA用作模板在(12)所述的條件下進(jìn)行PCR。
(實(shí)施例1)(小麥的轉(zhuǎn)化)對小麥(變種Norin 61)的成熟種子進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。使種子吸水，在25℃下過夜。將2ml包含30粒已經(jīng)開始發(fā)芽的種子以及pWI-GUS(用于GUS分析)或pWI-H5K(用于生長)的質(zhì)粒DNA(200μg/2ml)的電穿孔緩沖溶液放在培養(yǎng)皿中。在低于大氣壓0.096MPa的壓力下減壓1小時。之后，將種子和緩沖溶液從培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移到室中。將該室在冰上放置1分鐘。之后，在下列條件下施加電脈沖脈沖寬度為50μsec，脈沖次數(shù)為50。進(jìn)一步使該室在冰上維持2分鐘。之后，將種子和緩沖溶液放回到原始培養(yǎng)皿中。將培養(yǎng)皿在4℃下保存約1小時，之后，在25℃維持過夜。在接下來的一天，除去緩沖溶液。將2ml蒸餾水加入到培養(yǎng)皿中，其依次在25℃維持過夜。在接下來的一天，除去蒸餾水。將2ml X-Gluc溶液加入到培養(yǎng)皿中，其依次在25℃維持過夜?；虮磉_(dá)水平是使用GUS活性作為指數(shù)測定的。結(jié)果在下面表1中表示。
表1

按照上述結(jié)果，可了解到當(dāng)施加100V電壓時，可進(jìn)行具有最高效率的轉(zhuǎn)化(注意電極之間的距離為1cm)。
類似的結(jié)果在圖2中表示。圖2表示在下列條件下進(jìn)行電穿孔的結(jié)果脈沖寬度為50μsec，脈沖次數(shù)為50，壓力為低于大氣壓0.096MPa(減壓)，且所施加的電壓為100V(A)、50V(B)、20V(C)、或0V(D)。當(dāng)所施加的電壓為100V時，轉(zhuǎn)化效率最高。
圖3表示1在(電壓100V，脈沖寬度50μsec，脈沖次數(shù)50；壓力低于大氣壓0.096MPa(減壓))的條件下經(jīng)過轉(zhuǎn)化的小麥種子；2在(電壓100V，脈沖寬度50μsec，脈沖次數(shù)50；沒有減壓)的條件下只經(jīng)過電穿孔的小麥種子；和3對照小麥種子的照片。從圖3可以看出，只有當(dāng)減壓與電穿孔結(jié)合時，才能獲得轉(zhuǎn)化。
用于生長的種子沒有經(jīng)過GUS活性實(shí)驗(yàn)，且減壓后，使種子在含有2000ppm遺傳霉素的蒸餾水中生長(如(7)種子的后處理，(9)使用含抗生素的培養(yǎng)基篩選，和(10)轉(zhuǎn)化體的生長中所述)。結(jié)果在圖4中表示。提取幼苗中的DNA，接著進(jìn)行PCR，以便證實(shí)引入基因的存在(如(11)DNA提取，和(12)PCR分析所述)。
SEQ ID NO.1和2用于進(jìn)行PCR。結(jié)果，證實(shí)了NPT II基因被引入到全株植物中。
上述實(shí)驗(yàn)的再現(xiàn)性是通過以基本相同的方式重復(fù)實(shí)驗(yàn)而研究的。結(jié)果，獲得基本相同的結(jié)果。該重復(fù)實(shí)驗(yàn)具體過程的詳述在下面描述。開始，將一片7cm直徑的濾紙放在90×15mm的培養(yǎng)皿中。將150粒小麥Norin 61的種子放在濾紙上。將10ml水加入到培養(yǎng)皿中，其依次被放置在黑暗的地方，10℃下共2天，使種子吸水。所加入的水含有用于防止各種細(xì)菌增殖的次氯酸鈉溶液(調(diào)節(jié)至約0.01％的有效氯濃度)。在第2天，幼根和幼芽頂破種皮。因此，證實(shí)了種子已經(jīng)開始發(fā)芽。在此第2天，用自來水充分洗滌種子。洗滌之后立即進(jìn)行本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)移處理。將2ml含有30粒小麥種子和pWI-H5KDNA(200μg/2ml)的電穿孔緩沖溶液放在培養(yǎng)皿中。減壓是在低于大氣壓0.096MPa的壓力下進(jìn)行1小時。之后，將種子和緩沖溶液從培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移到室中，其依次在冰上維持1分鐘。之后，在下列條件下施加電脈沖電壓為100V，其中電極之間的距離為1cm；脈沖寬度為50μsec；脈沖次數(shù)為50。將該室在冰上再維持2分鐘。之后，將種子和緩沖溶液放回到原始培養(yǎng)皿中。在4℃下保存培養(yǎng)皿約1小時，并在25℃維持過夜。在接下來的一天，除去緩沖溶液，并將2ml蒸餾水加入到培養(yǎng)皿中，其依次在25℃維持過夜。該過程總共進(jìn)行5次，這樣總共150個小麥種子經(jīng)過本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)移處理。
接下來，將10ml 0.5％聚乙烯吡咯烷酮(PVP)水溶液作為防止變成褐色的試劑放在90×15-mm培養(yǎng)皿中。將經(jīng)過核酸轉(zhuǎn)移處理的小麥種子放在培養(yǎng)皿中。所述PVP水溶液含有用于防止各種細(xì)菌增殖的次氯酸鈉溶液(調(diào)節(jié)至約0.01％的有效氯濃度)。將培養(yǎng)皿放在黑暗的地方，10℃下共2天。2天后，將10ml含有1200ppm遺傳霉素的水溶液放在新的90×15mm培養(yǎng)皿中，并將上述小麥種子轉(zhuǎn)移到該培養(yǎng)皿中。所述遺傳霉素水溶液含有用于防止各種細(xì)菌增殖的次氯酸鈉溶液(調(diào)節(jié)至約0.02％的有效氯濃度)。接下來，使培養(yǎng)皿中的種子在春化的條件下，在培養(yǎng)室中生長2周(光照期20℃、8h、約2000lux；和黑暗期8℃，16h)。
此外，將在上述使用遺傳霉素抗生素的篩選過程中發(fā)芽的存活小麥植株移植到含土壤的罐中，并生長約3-4個月。這種生長是在與上述相同的培養(yǎng)室中進(jìn)行的，條件為(光照期20℃、8h、約2000lux；和黑暗期8℃，16h)。裝入罐中后約1個月，收集已生長的小麥植株的葉子。提取所收集葉子的DNA。將提取的DNA用作模板進(jìn)行PCR。結(jié)果，證實(shí)了引入基因的存在。該P(yáng)CR分析是使用(12)PCR分析中所述的引物對和擴(kuò)增條件進(jìn)行的。結(jié)果在圖5表示。
約5,000粒小麥種子經(jīng)過相似處理。結(jié)果，獲得205株具有遺傳霉素抗性的個體植株。在它們之中，87株個體在PCR分析中顯示引入基因的存在。使在PCR中顯示引入基因存在的87株個體生長，之后，經(jīng)過DNA印跡分析。從87株個體中隨機(jī)選擇8株個體。提取8株個體的DNA，并經(jīng)過DNA印跡分析。結(jié)果，引入的NPT II基因的存在在所有8株個體中均被證實(shí)。結(jié)果在圖6表示。
在DNA印跡分析中顯示引入基因存在的這8株個體進(jìn)一步生長。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)所有8株個體都具有種子生育力。這些具有種子生育力的小麥轉(zhuǎn)化體的照片在圖7中表示。將從這些小麥轉(zhuǎn)化體(第一代T0代)中獲得的種子(第二代T1代)播撒在土壤中。種子生長為幼株。提取6株幼株葉子的DNA，經(jīng)過PCR分析。結(jié)果，引入基因的存在在6株幼株中均得以證實(shí)。該P(yáng)CR分析是使用(12)PCR分析中所述的引物對和擴(kuò)增條件進(jìn)行的。結(jié)果在圖8中表示。從圖8可以看出，證實(shí)了所有6株幼株都顯示出引入的NPT II基因的存在。因此，證實(shí)了本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)移方法可將目標(biāo)外源性基因以適宜的方式摻入到基因組中，且所引入的外源性基因可被傳遞到下一代中。
(實(shí)施例2)將日本產(chǎn)稻(變種Koshihikari)的成熟種子用作原料。
使種子吸水，25℃下過夜。將2ml包含30粒已經(jīng)開始發(fā)芽的種子和pWI-GUS或pWI-H5K的質(zhì)粒DNA(200μg/2ml)的電穿孔緩沖溶液放在培養(yǎng)皿中。在低于大氣壓0.096MPa的壓力下減壓1小時。之后，將種子和緩沖溶液從培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移到室中。將該室在冰上放置1分鐘。之后，在下列條件下施加電脈沖電壓為50V，其中電極之間的距離為1cm，脈沖寬度為50μsec，脈沖次數(shù)為99。使該室進(jìn)一步在冰上維持2分鐘。之后，將種子和緩沖溶液放回到原始培養(yǎng)皿中。4℃下保存培養(yǎng)皿約1小時，之后，在25℃維持過夜。在接下來的一天，除去緩沖溶液。向培養(yǎng)皿中加入2ml蒸餾水，其依次在25℃維持過夜。在接下來的一天，除去蒸餾水。將2ml X-Gluc溶液加入到培養(yǎng)皿中，其依次在25℃維持過夜?；虮磉_(dá)水平是使用GUS活性作為指數(shù)測定的。結(jié)果在下面表2表示。
表2

根據(jù)上述結(jié)果，可了解到當(dāng)施加50V的電壓時，可進(jìn)行具有最高效率的轉(zhuǎn)化(注意電極之間的距離為1cm)。
相似的結(jié)果在圖9中表示。圖9表示在下列條件下進(jìn)行電穿孔的結(jié)果脈沖寬度為50μsec，脈沖次數(shù)為99，壓力為低于大氣壓0.096MPa(減壓)，且所施加的電壓為50V(A)、20V(B)、10V(C)、或0V(D)。當(dāng)所施加的電壓為50V時，轉(zhuǎn)化效率最高。
圖10表示1在(電壓50V，脈沖寬度50μsec，脈沖次數(shù)99；壓力低于大氣壓0.096MPa(減壓))的條件下經(jīng)過轉(zhuǎn)化的稻種子；2在(電壓50V，脈沖寬度50μsec，脈沖次數(shù)99；沒有減壓)的條件下只經(jīng)過電穿孔的稻種子；和3對照稻種子的照片。從圖10可以看出，只有當(dāng)減壓與電穿孔結(jié)合時，才能獲得轉(zhuǎn)化。
用于生長的種子沒有經(jīng)過GUS活性實(shí)驗(yàn)，且減壓后，使種子在含有200ppm遺傳霉素的蒸餾水中生長(如(7)種子的后處理，(9)使用含抗生素的培養(yǎng)基篩選，和(10)轉(zhuǎn)化體的生長中所述)。結(jié)果在圖11中表示。
上述實(shí)驗(yàn)的再現(xiàn)性是通過以基本相同的方式重復(fù)實(shí)驗(yàn)而研究的。結(jié)果，獲得基本相同的結(jié)果。該重復(fù)實(shí)驗(yàn)具體過程的詳述在下面描述。開始，將一片7cm直徑的濾紙放在90×15mm的培養(yǎng)皿中。將100粒稻(糙米)的種子放在濾紙上。將10ml水加入到培養(yǎng)皿中，其依次被放置在25℃下、光照期16h、共1天，使種子吸水。所加入的水含有用于防止各種細(xì)菌增殖的次氨酸鈉溶液(調(diào)節(jié)至約0.01％的有效氯濃度)。在接下來的一天，用自來水充分洗滌種子。洗滌后立即進(jìn)行本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)移處理。將1ml包含20粒稻種子和pWI-H5KDNA(100μg/2ml)的電穿孔緩沖溶液放在培養(yǎng)皿中。在低于大氣壓0.096MPa的壓力下減壓1小時。之后，將種子和緩沖溶液從培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移到室中，其依次在冰上維持1分鐘。之后，在下列條件下通過電穿孔施加電脈沖電壓為50V，其中電極之間的距離為1cm；脈沖寬度為50μsec；脈沖次數(shù)為99。將該室在冰上再維持2分鐘。之后，將種子和緩沖溶液放回到原始培養(yǎng)皿中。在4℃下保存培養(yǎng)皿約1小時，并在25℃維持過夜。在接下來的一天，除去緩沖溶液，并將2ml蒸餾水加入到培養(yǎng)皿中，其依次在25℃維持過夜。該過程總共進(jìn)行5次，這樣共100粒稻種子經(jīng)過本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)移處理。
接下來，將10ml 0.5％聚乙烯吡咯烷酮(PVP)水溶液作為防止變成褐色的試劑放在90×15-mm培養(yǎng)皿中。將經(jīng)過核酸轉(zhuǎn)移處理的稻種子放在培養(yǎng)皿中。所述PVP水溶液含有用于防止各種細(xì)菌增殖的次氯酸鈉溶液(調(diào)節(jié)至約0.01％的有效氯濃度)。將培養(yǎng)皿放置在25℃下，光照期16h，共2天。2天后，將10ml含有200ppm遺傳霉素的水溶液放在新的90×15-mm培養(yǎng)皿中，并將上述稻種子轉(zhuǎn)移到該培養(yǎng)皿中。所述遺傳霉素水溶液含有用于防止各種細(xì)菌增殖的次氯酸鈉溶液(調(diào)節(jié)至約0.02％的有效氯濃度)。接下來，使培養(yǎng)皿中的種子在25℃下生長2周，光照期16h。
此外，將在上述使用遺傳霉素抗生素的篩選過程中發(fā)芽的存活稻植株移植到含土壤的罐中，并生長約3-4個月。這種生長是在一般的培育條件下，在密閉的溫室中，在25℃下進(jìn)行的。裝入罐中后約1個月，收集已生長的稻植株的葉子。提取所收集葉子的DNA。將提取的DNA用作模板進(jìn)行PCR。結(jié)果，證實(shí)了引入基因的存在。該P(yáng)CR分析是使用(12)PCR分析中所述的引物對和擴(kuò)增條件進(jìn)行的。PCR分析證實(shí)了NPT II基因的存在。
約2,000粒稻種子經(jīng)過相似處理。結(jié)果，獲得55株具有遺傳霉素抗性的個體植株。在它們之中，33株個體在PCR分析中顯示引入基因的存在。使在PCR中顯示引入基因存在的33株個體生長，之后，經(jīng)過DNA印跡分析。從33株個體中隨機(jī)選擇6株個體。提取6株個體的DNA，經(jīng)過DNA印跡分析。結(jié)果，引入的NPT II基因的存在在2株個體中被證實(shí)。結(jié)果在圖12中表示。
在DNA印跡分析中顯示引入基因存在的稻個體進(jìn)一步生長。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)稻個體具有種子生育力。這些具有種子生育力的稻轉(zhuǎn)化體的照片在圖13中表示。將從這些稻轉(zhuǎn)化體(第一代T0代)中獲得的種子(第二代T1代)播撒在土壤中。種子生長為幼株。提取8株幼株葉子的DNA，經(jīng)過PCR分析。結(jié)果，確定了引入基因的存在。該P(yáng)CR分析是使用(12)PCR分析中所述的引物對和擴(kuò)增條件進(jìn)行的。結(jié)果在圖14中表示。從圖14可以看出，證實(shí)了所有8株幼株都顯示出引入的NPT II基因的存在。因此，證實(shí)了本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)移方法可將目標(biāo)外源性基因以適宜的方式摻入到基因組中，且所引入的外源性基因可被傳遞到下一代中。
(實(shí)施例3)將印度產(chǎn)稻(變種IR24)的成熟種子用作原料。
使種子吸水，25℃下過夜。將2ml包含30粒已經(jīng)開始發(fā)芽的種子和pWI-GUS的質(zhì)粒DNA(200μg/2ml)的電穿孔緩沖溶液放在培養(yǎng)皿中。減壓是在低于大氣壓0.096MPa的壓力下進(jìn)行1小時。之后，將種子和緩沖溶液從培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移到室中。將室在冰上放置1分鐘。之后，在下列條件下施加電脈沖電壓為50V，其中電極之間的距離是1cm，脈沖寬度為50μsec，脈沖次數(shù)為99。進(jìn)一步使該室在冰上維持2分鐘。之后，將種子和緩沖溶液放回到原始培養(yǎng)皿中。將培養(yǎng)皿在4℃下保存約1小時，之后，在25℃維持過夜。在接下來的一天，除去緩沖溶液。將2ml蒸餾水加入到培養(yǎng)皿中，其依次在25℃維持過夜。在接下來的一天，除去蒸餾水。將2ml的X-Gluc溶液加入到培養(yǎng)皿中，其依次在25℃維持過夜。結(jié)果在圖15中表示。從圖15可看出，只有當(dāng)減壓與電穿孔結(jié)合時，才能獲得轉(zhuǎn)化。
減壓后，使用含有200ppm遺傳霉素的蒸餾水篩選種子。
(實(shí)施例4)將大豆(變種Oosuzu)的成熟種子用作原料。使種子吸水，25℃過夜。
將2ml包含10粒已經(jīng)開始發(fā)芽的種子和pBC1或pWI-GUS的質(zhì)粒DNA(100μg/2ml)的電穿孔緩沖溶液放在培養(yǎng)皿中。減壓是在低于大氣壓0.096MPa的壓力下進(jìn)行1小時。之后，將種子和緩沖溶液從培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移到室中。將該室在冰上放置1分鐘。之后，在下列條件下施加電脈沖電壓為50V，其中電極之間的距離是1cm，脈沖寬度為50μsec，脈沖次數(shù)為50。進(jìn)一步使該室在冰上維持2分鐘。之后，將種子和緩沖溶液放回到原始培養(yǎng)皿中。將培養(yǎng)皿在4℃下保存約1小時，之后，在25℃維持過夜。在接下來的一天，除去緩沖溶液。將2ml蒸餾水加入到培養(yǎng)皿中，其依次在25℃維持過夜。在接下來的一天，除去蒸餾水。將2ml的X-Gluc溶液加入到培養(yǎng)皿中，其依次在25℃維持過夜。轉(zhuǎn)化成功的結(jié)果在圖16中表示。
(實(shí)施例5)將玉米(變種Petercorn)的成熟種子用作原料。使種子吸水，25℃過夜。將2ml包含3粒已經(jīng)開始發(fā)芽的種子和質(zhì)粒DNA(100μg/2ml)的電穿孔緩沖溶液放在培養(yǎng)皿中。減壓是在低于大氣壓0.096MPa的壓力下進(jìn)行1小時。之后，將種子和緩沖溶液從培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移到室中。將該室在冰上放置1分鐘。之后，在下列條件下施加電脈沖電壓為100V，其中電極之間的距離是1cm，脈沖寬度為50μsec，脈沖次數(shù)為50。進(jìn)一步使該室在冰上維持2分鐘。之后，將種子和緩沖溶液放回到原始培養(yǎng)皿中。將培養(yǎng)皿在4℃下保存約1小時，之后，在25℃維持過夜。在接下來的一天，除去緩沖溶液。將2ml蒸餾水加入到培養(yǎng)皿中，其依次在25℃維持過夜。在接下來的一天，除去蒸餾水。將2ml的X-Gluc溶液加入到培養(yǎng)皿中，其依次在25℃維持過夜。
(實(shí)施例6)使用大白菜(變種Muso)的成熟種子作為原料。使種子吸水，25℃過夜。將2ml包含30粒已經(jīng)開始發(fā)芽的種子和質(zhì)粒DNA(100μg/2ml)的電穿孔緩沖溶液放在培養(yǎng)皿中。減壓是在低于大氣壓0.096MPa的壓力下進(jìn)行1小時。之后，將種子和緩沖溶液從培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移到室中。將該室在冰上放置1分鐘。之后，在下列條件下施加電脈沖電壓為100V，其中電極之間的距離是1cm，脈沖寬度為50μsec，脈沖次數(shù)為50。進(jìn)一步使該室在冰上維持2分鐘。之后，將種子和緩沖溶液放回到原始培養(yǎng)皿中。將培養(yǎng)皿在4℃下保存約1小時，之后，在25℃維持過夜。在接下來的一天，除去緩沖溶液。將2ml蒸餾水加入到培養(yǎng)皿中，其依次在25℃維持過夜。在接下來的一天，除去蒸餾水。將2ml的X-Gluc溶液加入到培養(yǎng)皿中，其依次在25℃維持過夜。轉(zhuǎn)化成功的結(jié)果在圖17中表示。
用于生長的種子沒有經(jīng)過GUS活性實(shí)驗(yàn)，且減壓后，使種子在含有適量遺傳霉素的蒸餾水中生長(如(7)種子的后處理，(9)使用含抗生素的培養(yǎng)基篩選，和(10)轉(zhuǎn)化體的生長中所述)。提取幼苗的DNA，接著進(jìn)行PCR，從而證實(shí)引入基因的存在(如(11)DNA提取，和(12)PCR分析中所述)。在PCR中顯示引入基因存在的個體進(jìn)一步生長，之后，經(jīng)過DNA印跡。從隨機(jī)選擇的某些已經(jīng)生長的個體中提取DNA，接著進(jìn)行DNA印跡分析。
(實(shí)施例7)使用番茄(變種Minicarol)的成熟種子作為原料。使種子吸水，25℃過夜。將2ml包含30粒已經(jīng)開始發(fā)芽的種子和質(zhì)粒DNA(100μg/2ml)的電穿孔緩沖溶液放在培養(yǎng)皿中。減壓是在低于大氣壓0.096MPa的壓力下進(jìn)行1小時。之后，將種子和緩沖溶液從培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移到室中。將該室在冰上放置1分鐘。之后，在下列條件下施加電脈沖電壓為100V，其中電極之間的距離是1cm，脈沖寬度為50μsec，脈沖次數(shù)為50。進(jìn)一步使該室在冰上維持2分鐘。之后，將種子和緩沖溶液放回到原始培養(yǎng)皿中。將培養(yǎng)皿在4℃下保存約1小時，之后，在25℃維持過夜。在接下來的一天，除去緩沖溶液。將2ml蒸餾水加入到培養(yǎng)皿中，其依次在25℃維持過夜。在接下來的一天，除去蒸餾水。將2ml的X-Gluc溶液加入到培養(yǎng)皿中，其依次在25℃維持過夜。轉(zhuǎn)化成功的結(jié)果在圖18表示。
(實(shí)施例8)將日本香瓜(變種Kinsho甜瓜)的成熟種子用作原料。使種子吸水，25℃過夜。種子開始發(fā)芽。
將2ml包含40粒種子和質(zhì)粒DNA(100μg/2ml)的電穿孔緩沖溶液放在培養(yǎng)皿中。減壓是在低于大氣壓0.096MPa的壓力下進(jìn)行1小時。之后，將種子和緩沖溶液從培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移到室中。將該室在冰上放置1分鐘。之后，在下列條件下施加電脈沖電壓為100V，其中電極之間的距離是1cm，脈沖寬度為50μsec，脈沖次數(shù)為50。
進(jìn)一步使該室在冰上維持2分鐘。之后，將種子和緩沖溶液放回到原始培養(yǎng)皿中。
將培養(yǎng)皿在4℃下保存約1小時，之后，在25℃維持過夜。在接下來的一天，除去緩沖溶液。將2ml蒸餾水加入到培養(yǎng)皿中，其依次在25℃維持過夜。在接下來的一天，除去蒸餾水。將2ml的X-Gluc溶液加入到培養(yǎng)皿中，其依次在25℃維持過夜。
(實(shí)施例9)使用牽?；?變種“Sun Smile”和“Youzirotairin”)的成熟種子作為原料。使種子吸水，25℃過夜。將2ml包含10粒已經(jīng)開始發(fā)芽的種子和質(zhì)粒DNA(100μg/2ml)的電穿孔緩沖溶液放在培養(yǎng)皿中。減壓是在低于大氣壓0.096MPa的壓力下進(jìn)行1小時。之后，將種子和緩沖溶液從培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移到室中。將該室在冰上放置1分鐘。之后，在下列條件下施加電脈沖電壓為100V，其中電極之間的距離是1cm，脈沖寬度為50μsec，脈沖次數(shù)為50。進(jìn)一步使該室在冰上維持2分鐘。之后，將種子和緩沖溶液放回到原始培養(yǎng)皿中。將培養(yǎng)皿在4℃下保存約1小時，之后，在25℃維持過夜。在接下來的一天，除去緩沖溶液。將2ml蒸餾水加入到培養(yǎng)皿中，其依次在25℃維持過夜。在接下來的一天，除去蒸餾水。將2ml的X-Gluc溶液加入到培養(yǎng)皿中，其依次在25℃維持過夜。轉(zhuǎn)化成功的結(jié)果在圖19中表示。
(實(shí)施例10)使用擬南芥(變種Col-0)的成熟種子作為原料。使種子吸水，25℃過夜。將2ml包含1000粒已經(jīng)開始發(fā)芽的種子和質(zhì)粒DNA(100μg/2ml)的電穿孔緩沖溶液放在培養(yǎng)皿中。減壓是在低于大氣壓0.096MPa的壓力下進(jìn)行1小時。之后，將種子和緩沖溶液從培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移到微管形室中。將該室在冰上放置1分鐘。之后，在下列條件下施加電脈沖電壓為100V，其中電極之間的距離是1cm，脈沖寬度為50μsec，脈沖次數(shù)為50。進(jìn)一步使該室在冰上維持2分鐘。之后，將種子和緩沖溶液放回到原始培養(yǎng)皿中。將培養(yǎng)皿在4℃下保存約1小時，之后，在25℃維持過夜。在接下來的一天，除去緩沖溶液。將2ml蒸餾水加入到培養(yǎng)皿中，其依次在25℃維持過夜。在接下來的一天，除去蒸餾水。將2ml的X-Gluc溶液加入到培養(yǎng)皿中，其依次在25℃維持過夜。
用于生長的種子沒有經(jīng)過GUS活性實(shí)驗(yàn)，且減壓后，使種子在含有適量遺傳霉素的蒸餾水中生長(如(7)種子的后處理，(9)使用含抗生素的培養(yǎng)基篩選，和(10)轉(zhuǎn)化體的生長中所述)。提取幼苗的DNA，接著進(jìn)行PCR，從而證實(shí)引入基因的存在(如(11)DNA提取，和(12)PCR分析中所述)。在PCR中顯示引入基因存在的個體進(jìn)一步生長，之后，經(jīng)過DNA印跡。從隨機(jī)選擇的某些已經(jīng)生長的個體中提取DNA，接著進(jìn)行DNA印跡分析。
在DNA印跡分析中顯示引入基因存在的擬南芥?zhèn)€體進(jìn)一步生長，產(chǎn)生具有種子生育力的擬南芥?zhèn)€體。將從這些擬南芥轉(zhuǎn)化體(第一代T0代)中獲得的種子(第二代T1代)播撒在土壤中。種子長成幼株。提取幼株葉子的DNA，經(jīng)過PCR分析。結(jié)果，確定了引入基因的存在。該P(yáng)CR分析是使用(12)PCR分析中所述的引物對和擴(kuò)增條件進(jìn)行的。
(實(shí)施例11)使用日本香瓜(變種Kinsho甜瓜)的成熟種子作為原料。使種子吸水，25℃過夜。將2ml包含30粒已經(jīng)開始發(fā)芽的種子和質(zhì)粒DNA(100μg/2ml)的電穿孔緩沖溶液放在培養(yǎng)皿中。使種子進(jìn)行沒有減壓，在低于大氣壓0.06MPa下減壓1小時，在低于大氣壓0.096MPa下減壓1小時的處理。之后，將種子和緩沖溶液從培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移到室中。將該室在冰上放置1分鐘。之后，在下列條件下施加電脈沖電壓為100V，其中電極之間的距離是1cm，脈沖寬度為50μsec，脈沖次數(shù)為50。進(jìn)一步使該室在冰上維持2分鐘。之后，將種子和緩沖溶液放回到原始培養(yǎng)皿中。將培養(yǎng)皿在4℃下保存約1小時，之后，在25℃維持過夜。在接下來的一天，除去緩沖溶液。將2ml蒸餾水加入到培養(yǎng)皿中，其依次在25℃維持過夜。在接下來的一天，除去蒸餾水。將2ml的X-Gluc溶液加入到培養(yǎng)皿中，其依次在25℃維持過夜。結(jié)果在表3中表示。
表3

1-對于經(jīng)過核酸轉(zhuǎn)移的種子而言，X-Gluc染色均未被證實(shí)。
2+對于30粒經(jīng)過核酸轉(zhuǎn)移的種子中的15?；蚋喾N子而言，X-Gluc染色被證實(shí)。
在表3中，基因表達(dá)水平是以用X-Gluc溶液染色的程度為基礎(chǔ)評價的。正如從表3結(jié)果所看到的那樣，大約0.096MPa減壓對于日本香瓜是優(yōu)選的。
接下來，研究對于日本香瓜轉(zhuǎn)化而言優(yōu)選的電壓。使日本香瓜在與上述相同的條件(0.096MPa減壓)下經(jīng)過核酸轉(zhuǎn)移，區(qū)別在于下列電壓條件。結(jié)果在下面的表4中表示。
表4

1-對于經(jīng)過核酸轉(zhuǎn)移的種子而言，X-Gluc染色均未被證實(shí)。
2±對于30粒經(jīng)過核酸轉(zhuǎn)移的種子中的1-14粒種子而言，X-Gluc染色的微弱水平被證實(shí)。
3+對于30粒經(jīng)過核酸轉(zhuǎn)移的種子中的15?；蚋喾N子而言，X-Gluc染色被證實(shí)。
按照上述結(jié)果，證實(shí)了當(dāng)施加約100V的電壓時，其中電極之間的距離是約1cm，轉(zhuǎn)化可最有效地進(jìn)行。
(實(shí)施例12)對小麥(變種Norin 61)的成熟種子進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其中比較減壓條件。使種子吸水，25℃過夜。將2ml包含30粒已經(jīng)開始發(fā)芽的種子和質(zhì)粒DNA(100μg/2ml)的電穿孔緩沖溶液放在培養(yǎng)皿中。將放在2ml不含質(zhì)粒DNA的電穿孔緩沖溶液中的發(fā)芽種子用作對照。使種子進(jìn)行沒有減壓，在低于大氣壓0.06MPa下減壓1小時，或在低于大氣壓0.096MPa下減壓1小時的處理(注意對照種子沒有經(jīng)過減壓)。之后，將種子和緩沖溶液從培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移到室中。將該室在冰上放置1分鐘。之后，在下列條件下施加電脈沖電壓為100V，其中電極之間的距離是1cm，脈沖寬度為50μsec，脈沖次數(shù)為50。進(jìn)一步使該室在冰上維持2分鐘。之后，將種子和緩沖溶液放回到原始培養(yǎng)皿中。將培養(yǎng)皿在4℃下保存約1小時，之后，在25℃維持過夜。在接下來的一天，除去緩沖溶液。將2ml蒸餾水加入到培養(yǎng)皿中，其依次在25℃維持過夜。在接下來的一天，除去蒸餾水。將2ml的X-Gluc溶液加入到培養(yǎng)皿中，其依次在25℃維持過夜。結(jié)果在圖20中表示。基因表達(dá)水平是通過用X-Gluc溶液染色的程度作為指數(shù)確定的。從圖20可以看出，在小麥中，優(yōu)選在低于大氣壓約0.096MPa下減壓。且，在低于大氣壓約0.06MPa下減壓的情況中，對于小麥種子證實(shí)了X-Gluc染色。
(實(shí)施例13)對日本產(chǎn)稻(變種Koshihikari)的成熟種子進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其中比較減壓條件。使種子吸水，25℃過夜。將2ml包含30粒已經(jīng)開始發(fā)芽的種子和質(zhì)粒DNA(100μg/2ml)的電穿孔緩沖溶液放在培養(yǎng)皿中。將放在2ml不含質(zhì)粒DNA的電穿孔緩沖溶液中的發(fā)芽種子用作對照。使種子進(jìn)行沒有減壓，在低于大氣壓0.06MPa下減壓1小時，或在低于大氣壓0.096MPa下減壓1小時的處理(注意對照種子沒有經(jīng)過減壓)。之后，將種子和緩沖溶液從培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移到室中。將該室在冰上放置1分鐘。之后，在下列條件下施加電脈沖電壓為50V，其中電極之間的距離是1cm，脈沖寬度為50μsec，脈沖次數(shù)為99。進(jìn)一步使該室在冰上維持2分鐘。之后，將種子和緩沖溶液放回到原始培養(yǎng)皿中。將培養(yǎng)皿在4℃下保存約1小時，之后，在25℃維持過夜。在接下來的一天，除去緩沖溶液。將2ml蒸餾水加入到培養(yǎng)皿中，其依次在25℃維持過夜。在接下來的一天，除去蒸餾水。將2ml X-Gluc溶液加入到培養(yǎng)皿中，其依次在25℃維持過夜。結(jié)果在圖21中表示?；虮磉_(dá)水平是通過用X-Gluc溶液染色的程度作為指數(shù)確定的。從圖21可以看出，對于稻而言，優(yōu)選在低于大氣壓約0.096MPa下減壓。且，在低于大氣壓約0.06MPa下減壓的情況中，對于稻種子證實(shí)了X-Gluc染色。
(實(shí)施例14)(蠶的轉(zhuǎn)化)使用蠶(節(jié)肢動物門(Arthropoda)的家蠶)卵。將2ml含有50個蠶卵和質(zhì)粒DNA(200μg/2ml)的電穿孔緩沖溶液放在培養(yǎng)皿中，其中所述蠶卵是從在冰箱中保存的休眠卵中任意選擇的或是從產(chǎn)卵后0-10天之間的非-休眠卵中任意選擇的。作為質(zhì)粒DNA，使用pWI-GUS質(zhì)粒中的GUS基因被GFP(綠色熒光蛋白)編碼基因取代的質(zhì)粒?？蛇x擇性地，使用pigA3GFP質(zhì)粒(Tamura，Journal of SericulturalScience of Japan，691-12，2000)。使用GFP(綠色熒光蛋白)編碼基因(例如，從Funakoshi Co.，Ltd.，Hongo，Bunkyo-ku，Tokyo，日本購得)。減壓在低于大氣壓0.096MPa的壓力下進(jìn)行5分鐘。之后，將卵和緩沖溶液從培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移到室中。將該室在冰上放置1分鐘。之后，在下列條件下施加電脈沖電壓是50V，其中電極之間的距離為1cm，脈沖寬度為50μsec，脈沖次數(shù)為5。進(jìn)一步使該室在冰上維持2分鐘。
之后，僅僅將已經(jīng)過電穿孔的卵轉(zhuǎn)移到具有濾紙的培養(yǎng)皿中。使卵在25℃下生長2-3周。作為飼料，使用商業(yè)購得的人造飼料(KatakuraKogyo，K.K.，Okufu，Sayama-shi，Saitama，日本)等。用紫外線或藍(lán)光照射孵出的幼蟲，從而證實(shí)從核酸轉(zhuǎn)移物質(zhì)發(fā)射出的綠色熒光。
使已經(jīng)被證實(shí)發(fā)出綠色熒光的幼蟲進(jìn)一步生長為成蟲。使成蟲與其中已經(jīng)轉(zhuǎn)移了相同核酸的個體等配對。用紫外線或藍(lán)光照射下一代個體，從而通過從其發(fā)射出的綠色熒光的存在證實(shí)引入核酸的遺傳。
(實(shí)施例15)(大腸桿菌(E.coli)的轉(zhuǎn)化)使用大腸桿菌(原核生物)。將2ml含有大腸桿菌(約106-108個細(xì)胞/ml)和pBC1質(zhì)粒DNA(10ng/ml)的電穿孔緩沖溶液放在培養(yǎng)皿中。減壓是在低于大氣壓0.096MPa的壓力下進(jìn)行1分鐘。之后，將大腸桿菌和緩沖溶液從培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移到室中。將該室在冰上放置1分鐘。之后，在下列條件下施加電脈沖電壓是200V，其中電極之間的距離為1cm，脈沖寬度為2μsec，且脈沖次數(shù)為1。使該室進(jìn)一步在冰上維持2分鐘。
之后，將已經(jīng)過電穿孔的大腸桿菌轉(zhuǎn)移到補(bǔ)充了100ppm氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上，接著在37℃培養(yǎng)過夜(見，商業(yè)購得的實(shí)驗(yàn)指南，如Molecular Cloning，ver.2，LB瓊脂培養(yǎng)基)。提取大腸桿菌中的質(zhì)粒DNA和基因組DNA。氨芐青霉素抗性基因的存在是通過PCR等加以證實(shí)的。
(實(shí)施例16)電穿孔裝置和室在下文中，將參考附圖描述本發(fā)明的電穿孔裝置和電穿孔室。這里解釋所用的附圖僅用于舉例說明。本發(fā)明的范圍不受這些附圖的限制。
圖22表示本發(fā)明實(shí)施方案的電穿孔室。該裝置包括用于將細(xì)胞保持在不同于大氣壓的壓力下的部分和電穿孔部分。在容器(106)中提供有至少一對彼此互相面對的電極(104，105)。值得注意的是，雖然在圖22中描述了一對(兩個)電極(104，105)，但是在容器(106)中可提供不止一對電極。任選地，該容器(106)提供有溫度控制部分(128)。要進(jìn)行核酸轉(zhuǎn)移的細(xì)胞(109)以及所轉(zhuǎn)移的核酸分子(110)，任選連同緩沖溶液(111)被放置在容器(106)中。在其中一個實(shí)施方案中，容器(106)被放置在另一容器(108)內(nèi)。它可在容器(108)中維持不同于大氣壓的壓力。容器(108)的內(nèi)部壓力可通過使用維持不同于大氣壓的壓力的部分(126)，利用氣孔(107)將空氣引入到容器(108)中(增壓)，或從容器(108)中排出(減壓)而改變。如果容器(106)還包括能夠被密封的蓋子和具有用于維持不同于大氣壓的壓力的部分的氣孔，則容器(106)和容器(108)可以相同(即，容器(106)可替換容器(108))。所述裝置還包括用于產(chǎn)生高壓脈沖的部分(101)。所述高壓脈沖產(chǎn)生部分(101)分別經(jīng)由兩根電線(102，103)與一對電極(104，105)相連。當(dāng)高壓脈沖產(chǎn)生部分(101)被打開產(chǎn)生高壓脈沖時，與其相連的電極(104)和電極(105)可分別起陽極和陰極，或陰極和陽極的作用。優(yōu)選，高壓脈沖產(chǎn)生部分(101)包括用于顛倒電流方向的極性轉(zhuǎn)換部分(127)，雖然它可能并不是必需的。通過打開/關(guān)閉極性轉(zhuǎn)換部分(127)，可以兩個方向?qū)⒏邏好}沖施加于細(xì)胞(109)及核酸(110)。
圖23表示本發(fā)明另一實(shí)施方案的電穿孔裝置。本裝置包括用于將細(xì)胞保持在不同于大氣壓的壓力下的部分和電穿孔部分，它們分開安裝在單一的容器(212)內(nèi)。在該裝置中，用于將細(xì)胞保持在不同于大氣壓的壓力下的部分包括容器(206-a)。要進(jìn)行核酸轉(zhuǎn)移的細(xì)胞(209)被放在容器(206-a)中。除細(xì)胞(209)之外，被轉(zhuǎn)移的核酸和/或緩沖液被任選放在容器(206-a)中。在其中一個實(shí)施方案中，容器(206-a)放在另一容器(208)內(nèi)。容器(208)內(nèi)部可維持在不同于大氣壓的壓力下。容器(208)的內(nèi)部壓力可通過使用維持不同于大氣壓的壓力的部分(226)，利用氣孔(207)將空氣引入到容器(208)中(增壓)，或從容器(208)中排出(減壓)而改變。如果容器(206-a)還包括能夠被密封的蓋子和具有用于維持不同于大氣壓的壓力的部分的氣孔，則容器(206-a)和容器(208)可以相同(即，容器(206-a)可替換容器(208))。
已經(jīng)通過上述部分經(jīng)過減壓和/或增壓的細(xì)胞依次被電穿孔部分處理。所述電穿孔部分包括容器(206-b)。容器(206-b)可與容器(206-a)相同或不同。換句話說，用于減壓和/或增壓的容器(206-a)可被用作容器(206-b)。任選，容器(206-a，206-b)提供有溫度控制部分(228-a/228-b)。容器(206-b)內(nèi)提供有至少一對互相面對的電極(204，205)。值得注意的是，雖然在圖23中描述了一對(兩個)電極(204，205)，但是容器(206-b)中可提供不止一對電極。經(jīng)過核酸轉(zhuǎn)移的細(xì)胞(209)以及所轉(zhuǎn)移的核酸分子(210)，任選連同緩沖溶液(211)被放在容器(206-b)中。所述裝置還包括用于產(chǎn)生高壓脈沖的部分(201)。所述高壓脈沖產(chǎn)生部分(201)分別經(jīng)由兩根電線(202，203)與一對電極(204，205)相連。當(dāng)打開高壓脈沖產(chǎn)生部分(201)產(chǎn)生高壓脈沖時，與其相連的電極(204)和電極(205)可分別起陽極和陰極，或陰極和陽極的作用。優(yōu)選，高壓脈沖產(chǎn)生部分(201)包括用于顛倒電流方向的極性轉(zhuǎn)換部分(227)，雖然它可能并不是必需的。通過打開/關(guān)閉極性轉(zhuǎn)換部分(227)，可以兩個方向?qū)⒏邏好}沖施加于細(xì)胞(209)及核酸(210)上。
圖24表示本發(fā)明另一實(shí)施方案的電穿孔裝置。本裝置僅包括用于將核酸轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中的電穿孔部分。該裝置結(jié)合用于將細(xì)胞保持在不同于大氣壓的壓力下。該裝置包括容器(306)。容器(306)內(nèi)提供有至少一對電極(304，305)。值得注意的是，雖然圖24中描述了一對(兩個)電極(304，305)，但是在容器(306)中可提供不止一對電極。任選，容器(306)提供有溫度控制部分(328)。要進(jìn)行核酸轉(zhuǎn)移的細(xì)胞(309)以及所轉(zhuǎn)移的核酸分子(310)，任選連同緩沖溶液(311)被放在容器(306)中。細(xì)胞(309)已經(jīng)通過任何其它裝置經(jīng)過了減壓和/或增壓。所述裝置還包括用于產(chǎn)生高壓脈沖的部分(301)。所述高壓脈沖產(chǎn)生部分(301)分別經(jīng)由兩根電線(302，303)與一對電極(304，305)相連。當(dāng)打開高壓脈沖產(chǎn)生部分(301)產(chǎn)生高壓脈沖時，與其相連的電極(304)和電極(305)可分別起陽極和陰極，或陰極和陽極的作用。優(yōu)選，高壓脈沖產(chǎn)生部分(301)包括用于顛倒電流方向的極性轉(zhuǎn)換部分(327)，雖然它可能并不是必需的。通過打開/關(guān)閉極性轉(zhuǎn)化部分(327)，可以兩個方向?qū)⒏邏好}沖施加于細(xì)胞(309)及核酸(310)上。在所述裝置中，電極(304)和電極(305)之間的距離(α)足以容納植物種子。該距離是按照上述定義的。
圖25表示本發(fā)明其中一個實(shí)施方案的直角平行六面體的電穿孔室。該室是由能夠抵抗不同于大氣壓的壓力的材料(例如，聚丙烯等)制成的。在電穿孔室(406)內(nèi)提供有至少一對互相面對的電極(413，414)，這樣電極與室內(nèi)壁緊密連接。值得注意的是，雖然在圖25中描述了一對(兩個)電極(413，414)，但是在容器(406)中可提供不止一對電極。電極(413，414)優(yōu)選是沿著彼此面對的兩個內(nèi)壁放置的平板形式。線(404)和線(405)，它們是由與電極(413，414)相同或不同的金屬制成的，任選從電極(413)和電極(414)伸展。線(404)和線(405)與分別與和高壓脈沖產(chǎn)生部分(401)連接的電線(402)和電線(403)相連?？梢圆惶峁┚€(404)和線(405)。如果不提供，則與高壓脈沖產(chǎn)生部分(401)相連的電線(402)和電線(403)可直接與電極(413)和電極(414)連接。當(dāng)打開高壓脈沖產(chǎn)生部分(401)產(chǎn)生高壓脈沖時，所連接的電極(413)和電極(414)可分別起陽極和陰極或陰極和陽極的作用。該室具有足夠容納植物種子的大小。室的大小可由內(nèi)部尺寸，即其橫截面的長(a)×寬(b)×高(c)表示?？扇菁{植物種子的大小是按照上面所定義的。優(yōu)選，能夠容納植物種子的室的大小是長1cm×寬2cm×高2cm。要進(jìn)行核酸轉(zhuǎn)移的細(xì)胞和被轉(zhuǎn)移的核酸分子，任選連同緩沖溶液被放在容器(406)中。任選，容器(406)提供有溫度控制部分(428)。
圖26表示本發(fā)明其中一個實(shí)施方案的微管形電穿孔室。該室(506-a)是由能夠抵抗不同于大氣壓的壓力的材料(例如，聚丙烯等)制成的。在室(506-a)內(nèi)提供有至少一對互相面對的電極(504，505)，這樣電極與室內(nèi)壁緊密連接。值得注意的是，雖然在圖26中描述了一對(兩個)電極(504，505)，但是在容器(506-a)中可提供不止一對電極。電極(504，505)優(yōu)選是通過使用粘合劑將不銹鋼箔(約5×40mm(厚度約0.1mm))粘在微管內(nèi)壁上制成的。在特定的實(shí)施方案中，每個電極(504，505)的末端從微管(506-a)中伸出。電極(504)和電極(505)的末端分別與和高壓脈沖產(chǎn)生部分(501)連接的電線(502)和電線(503)相連。當(dāng)打開高壓脈沖產(chǎn)生部分(501)產(chǎn)生高壓脈沖時，所連接的電極(504)和電極(505)可分別起陽極和陰極或陰極和陽極的作用。該室具有足夠容納植物種子的大小。室的大小可由內(nèi)部尺寸，即其橫截面的直徑(e)×高(d)表示?？扇菁{植物種子的大小是按照上面所定義的。優(yōu)選，能夠容納植物種子的室的大小是直徑1cm×高4cm。要進(jìn)行核酸轉(zhuǎn)移的細(xì)胞和被轉(zhuǎn)移的核酸分子，任選連同緩沖溶液被放在容器(506-a)中。微管(506-a)任選包含用于密封關(guān)閉微管的蓋子(515)。任選，容器(506-a)提供有溫度控制部分(528)。
在上述實(shí)施例中，如圖26所示，微管(506-a)的體具有均勻的橫截面，然后向底部漸細(xì)。本發(fā)明的微管形電穿孔室可以是任何其它形式。例如，微管室的體可具有不均勻的橫截面和向底部漸細(xì)的形狀(506-b)。在另一實(shí)施方案中，該室的體具有從頂部到底部的均勻橫截面(506-c)。在另一實(shí)施方案中，該室的體具有506-d中所示的不均勻橫截面。
本發(fā)明的室可以是任何形狀，只要它的大小可使它容納植物種子。該室的大小是否能夠容納植物種子可通過測量與室內(nèi)壁相切的內(nèi)切圓直徑加以證實(shí)。該內(nèi)切圓與室內(nèi)壁上的至少3個任意點(diǎn)相切。例如，如圖27所示，當(dāng)室為三棱柱的形狀(606)時，與圖27所示三個點(diǎn)相切的最大內(nèi)切圓(616)直徑(f)是可容納植物種子的大小。例如，如圖27所示，在三棱柱室中提供了至少一對電極(604-a，605-a)。值得注意的是，雖然在圖27的三棱柱室中描述了一對(兩個)電極(604-a，605-a)，但是容器(606)中可提供不止一對電極。同樣，如圖27所示，當(dāng)室的形狀為五棱柱的形狀(607)時，與圖27所示5個點(diǎn)相切的最大內(nèi)切圓(617)直徑(g)是可容納植物種子的大小。例如，圖27所示五棱柱室中提供了至少一對電極(604-b，605-b)。值得注意的是，雖然在圖27的五棱柱室中描述了一對(兩個)電極(604-b，605-b)，但容器(607)中可提供不止一對電極。在室具有其它形狀的情況下，最大內(nèi)切圓的大小(直徑)是使該室容納植物種子的大小。
圖28是表示本發(fā)明自動電穿孔裝置的示意圖。該裝置包括a)用于放置含核酸分子及細(xì)胞的混合物的容器(706-a)；b)用于在容器a)中放置核酸分子的部分(724)；c)用于在容器a)中放置細(xì)胞的部分(725)；d)用于將細(xì)胞保持在不同于大氣壓的壓力下的容器(708)，所述容器能夠抵抗不同于大氣壓的壓力；e)用于在容器d)中放置細(xì)胞的部分(718-a)；f)用于將容器d)維持在不同于大氣壓的壓力下部分(726)；g)用于向含核酸分子及細(xì)胞的混合物施加高壓脈沖的容器(720)；h)用于在容器g)中放置含核酸分子及細(xì)胞的混合物的部分(718-b)；i)用于向容器g)中含核酸分子及細(xì)胞的混合物施加高壓脈沖的部分(701)；和j)用于自動操縱部分b)、c)、e)、f)、h)、和i)的部分(719)。
開始，制備容器(706-a)。將細(xì)胞從部分(725)注射到容器(706-a)中。任選，可在細(xì)胞注入之前、基本同時、或之后，將核酸分子從部分(724)注射到同一容器(706-a)中。細(xì)胞(和，任選地，核酸分子)或含有注射入細(xì)胞的容器(706-a)可通過部分(718-a)的作用被放在容器(708)中。容器(708)是由能夠抵抗不同于大氣壓的壓力的材料(例如，聚丙烯等)制成的。將具有注射入細(xì)胞(和，任選地，核酸分子)的容器(706-b)安裝在容器(708)中。在某些情況下，容器(708)和容器(706-b)可以是同一容器。在細(xì)胞已經(jīng)被放在容器(708)中后，可啟動部分(726)。使用部分(726)，將容器(708)的內(nèi)部維持在不同于大氣壓的壓力下。因此，放在容器(708)中的細(xì)胞(和，任選地，核酸分子)經(jīng)過減壓和/或增壓。已經(jīng)過減壓和/或增壓的細(xì)胞，或含細(xì)胞的容器是通過放置部分(718-b)從容器(708)轉(zhuǎn)移到容器(720)的(含有放在容器(720)中的細(xì)胞的容器被表示為706-c(這里，容器(720)和容器(706-c)可以是同一容器))。當(dāng)核酸分子不包含在容器(706-b/706-c)中時，核酸分子是在放置部分(718-b)啟動之前或之后，從部分(724)注射到容器(706-b/706-c)中的。任選，緩沖溶液可與核酸分子同時或依次注射到容器(706-b/706-c)中。當(dāng)含細(xì)胞及核酸分子的混合物已經(jīng)被放在容器(720)中時，啟動部分(701)。使用部分(701)，將高壓脈沖施加于容器(720)中含細(xì)胞及核酸分子的混合物上。結(jié)果，在細(xì)胞與核酸分子之間發(fā)生電穿孔。本發(fā)明的電穿孔裝置還包括用于自動控制上述部分(724、725、718-a、726、718-b、和701)的控制部分(719)。如圖28所示，控制部分(719)經(jīng)由電線(721-a、721-b、721-c、721-d、721-e、和721-f)與部分(724、725、718-a、726、718-b、和701)相連。控制信號是通過這些電線傳輸?shù)?。在本發(fā)明的自動電穿孔裝置中，部分(724)和部分(725)可彼此相同或不同。部分(718-a)和部分(718-b)可彼此相同或不同。容器(706-a)、容器(706-b)、和容器(706-c)可彼此相同或不同。此外，在本發(fā)明的電穿孔裝置中，容器(708)中的減壓和/或增壓以及容器(720)中的電穿孔可以任何順序進(jìn)行。優(yōu)選，容器(720)中的電穿孔可在容器(708)中的減壓和/或增壓之后進(jìn)行。
圖29表示本發(fā)明自動電穿孔裝置的更具體的實(shí)施方案。在圖29的實(shí)施方案中，細(xì)胞開始從部分(825)被放到容器(806-a)中。任選，在注射入細(xì)胞時，核酸分子可從部分(824)被放到容器(806-a)中。任選，容器(806-a)包括電極(804-a，805-a)。含有注射入細(xì)胞(和，任選地，核酸分子)的容器(806-a)是通過部分(818-a)，如皮帶運(yùn)輸機(jī)等，經(jīng)過容器(808)的入口(822-a)轉(zhuǎn)移到容器(808)中的。含有注射入細(xì)胞(和，任選地，核酸分子)的容器，其被放在容器(808)中，是由806-b(且，在容器(806-b)中提供的電極由804-b，805-b表示)表示的。當(dāng)把細(xì)胞放在容器(808)中時，容器(808)的入口(822-a)和出口(822-b)是閉合的，這樣容器(808)可密閉。在密閉容器(808)中，啟動部分(826)，將容器(808)的內(nèi)部維持在不同于大氣壓的壓力下。不同于大氣壓的壓力可通過部分(826)的作用，經(jīng)由氣孔(807)將空氣引入到容器(808)中(增壓)，或從容器(808)中排出(減壓)而產(chǎn)生。包含已經(jīng)如上所述經(jīng)過減壓和/或增壓的細(xì)胞(和，任選地，核酸分子)的容器(806-b)是通過部分(818-b)，如皮帶運(yùn)輸機(jī)等，經(jīng)由容器(808)的出口(822-b)向容器(820)轉(zhuǎn)移的。如果在此時，容器(806-b/806-c)不含核酸分子，則在此轉(zhuǎn)移步驟內(nèi)將核酸分子注射到容器(806-b/806-c)中。含有注射入細(xì)胞及核酸分子的容器，其已被放在容器(820)中，是由806-c(容器(806-c)中提供的電極是由804-c，805-c表示的)表示的。在細(xì)胞及核酸分子已經(jīng)被放在容器(820)中后，優(yōu)選閉合容器(820)的入口(823-a)和出口(823-b)。容器(820)包括用于產(chǎn)生高壓脈沖的部分(801)。所述高壓脈沖產(chǎn)生部分(801)經(jīng)由兩根電線(802，803)分別與電極(804-c)和電極(805-c)相連。當(dāng)打開高壓脈沖產(chǎn)生部分(801)產(chǎn)生高壓脈沖時，所連接的電極(804-c)和電極(805-c)可起陽極和陰極或陰極和陽極的作用。優(yōu)選，高壓脈沖產(chǎn)生部分(801)包括用于顛倒電流的極性轉(zhuǎn)換部分(827)，雖然它可能并不是必需的。通過打開/關(guān)閉極性轉(zhuǎn)換部分(827)，可以兩個方向?qū)⒏邏好}沖施加于細(xì)胞(809)及核酸分子(810)上。此外，本發(fā)明的自動電穿孔裝置包括用于自動控制上述部分(824、825、818-a、826、818-b、801)的控制部分(819)。如圖29所示，控制部分(819)經(jīng)由各電線(821-a、821-b、821-c、821-d、821-e、821-f)與部分(824、825、818-a、826、818-b、801)相連?？刂菩盘柺峭ㄟ^電線傳輸?shù)?。值得注意的是，在圖29中，用于在容器(806-a)中放置核酸分子的部分(824)和用于在容器(806-a)中放置細(xì)胞的部分(825)是作為獨(dú)立部分描述的，雖然部分(824，825)可以是同一部分(即，用于在容器(806-a)中放置細(xì)胞及核酸的單個部分)。值得注意的是，雖然在圖29中描述了一對(兩個)電極(804-a、805-a；804-b、805-b；804-c、805-c)，但是在容器(分別是806-a；806-b；806-c)中可提供不止一對電極。此外，在圖29中，放置部分(818-a、818-b)被描述為單一的皮帶運(yùn)輸機(jī)，雖然放置部分(818-a、818-b)可以是分開的部分。此外，用于改變壓力的容器(808)和/或用于進(jìn)行電穿孔的容器(820)可以與含有核酸分子和/或細(xì)胞的容器(806-a、806-b、806-c)同時在皮帶運(yùn)輸機(jī)上移動，或代替后者移動。可選擇性地，放置部分可使用沒有皮帶運(yùn)輸機(jī)等的自動泵，通過吸出/排出而將放在容器(806-a)、容器(806-b)、和容器(806-c)中的材料/懸浮液轉(zhuǎn)移。容器(806-a)、容器(806-b)、和容器(806-c)彼此可以相同或不同。當(dāng)它們是不同的容器時，內(nèi)含物(即，細(xì)胞和/或核酸分子)在每個容器之間轉(zhuǎn)移，如從容器(806-a)轉(zhuǎn)移到容器(806-b)和/或從容器(806-b)轉(zhuǎn)移到容器(806-c)等。轉(zhuǎn)移可通過，例如，簡單地傾斜容器，或使用自動分液器/自動移液管/自動泵等吸出/排出而進(jìn)行。任選，容器(806-a、806-b、806-c)提供有溫度控制部分(828-a、828-b、828-c)。
如上所述，此前已經(jīng)使用優(yōu)選實(shí)施方案舉例說明了本發(fā)明。應(yīng)了解本發(fā)明的范圍只受權(quán)利要求的限定。本說明書中引證的所有專利、專利申請、和公開出版物整體引入此處作為參考，其程度與這里詳細(xì)描述的相同。
工業(yè)實(shí)用性提供一種簡單且快速的核酸轉(zhuǎn)移方法。
本發(fā)明的簡單且快速的核酸轉(zhuǎn)移方法可用于本領(lǐng)域的研究和發(fā)展，從而很容易進(jìn)行大規(guī)模的處理和大規(guī)模的分析。此外，本發(fā)明可引起研究的顯著進(jìn)步，潛在導(dǎo)致創(chuàng)新重組體的開發(fā)。
序列表<110>National Institute of Agrobiological Sciences<120>包括減壓/增壓的使用的電穿孔方法<130>AR034PCT<150>JP P2002-207611<151>2002-07-16<160>5<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>1ctgcgtgcaa tccatcttg 19<210>2<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>2actcgtcaag aaggcgatag aag 23<210>3<211>35<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>3catgattgaa caagatggat tgcacgcagg ttctc 35<210>4<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>4cagaagaact cgtcaagaag gcgatagaag gcgat 35<210>5<211>882<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述探針<400>5tctagaggat cgtttcgcat gattgaacaa gatggattgc acgcaggttc tccggccgct60tgggtggaga ggctattcgg ctatgactgg gcacaacaga caatcggctg ctctgatgcc 120gccgtgttcc ggctgtcagc gcaggggcgc ccggttcttt ttgtcaagac cgacctgtcc 180ggtgccctga atgaactgca ggacgaggca gcccggctat cgtggctggc cacgacgggc 240gttccttgcg cagctgtgct cgacgttgtc actgaagcgg gaagggactg gctgctattg 300ggcgaagtgc cggggcagga tctcctgtca tctcaccttg ctcctgccga gaaagtatcc 360atcatggctg atgcaatgcg gcggctgcat acgcttgatc cggctacctg cccattcgac 420caccaagcga aacatcgcat cgagcgagca cgtactcgga tggaagccgg tcttgtcgat 480
caggatgatc tggacgaaga gcatcagggg ctcgcgccag ccgaactgtt cgccaggctc540aaggcgcgca tgcccgacgg cgacgatctc gtcgtgaccc atggcgatgc ctgcttgccg600aatatcatgg tggaaaatgg ccgcttttct ggattcatcg actgtggccg gctgggtgtg660gcggaccgct atcatgacat agcgttggct acccgtgata ttgctgaaga gcttggcggc720gaatgggctg accgcttcct cgtgctttac ggtatcgccg ctcccgattc gcagcgcatc780gccttctatc gccttcttga cgagttcttc tgagcgggac tctggggttc gaaatgaccg840accaagcgac gatgaattcg gcggccgcgg ggatcctcta ga 88權(quán)利要求
1.一種用于將核酸轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中的方法，包括下列步驟a)將細(xì)胞保持在不同于大氣壓的壓力下；并b)將細(xì)胞及核酸置于能夠引發(fā)電穿孔的條件下。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中將細(xì)胞保持在不同于大氣壓的壓力下的步驟是使細(xì)胞經(jīng)過減壓的步驟。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中將細(xì)胞保持在不同于大氣壓的壓力下的步驟是使細(xì)胞經(jīng)過增壓的步驟。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中將細(xì)胞保持在不同于大氣壓的壓力下的步驟是在將細(xì)胞及核酸置于能夠引發(fā)電穿孔的條件下的步驟之前進(jìn)行的。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中減壓步驟是在比大氣壓低約0.096MPa的壓力下進(jìn)行的。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟b)包括在至少兩個方向上向細(xì)胞及核酸施加高壓脈沖。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述細(xì)胞是植物細(xì)胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述植物細(xì)胞是休眠植物組織的細(xì)胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述休眠植物組織是種子。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述植物是單子葉植物。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述單子葉植物是禾本科植物。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述禾本科植物是小麥(Triticum aestivum L.)。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述禾本科植物是稻(Oryzasativa L.)。
14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述禾本科植物是玉米(Zeamays L.)。
15.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述植物是雙子葉植物。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述雙子葉植物是十字花科植物。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述十字花科植物是大白菜(Brassica rapa L.)。
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述十字花科植物是油菜(Brassica napus L.)。
19.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述雙于葉植物是豆科植物。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述豆科植物是大豆(Glycine max Merr)。
21.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述雙子葉植物是茄科植物。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述茄科植物是番茄(Lycopersicum esculentum Mill)。
23.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述雙子葉植物是葫蘆科植物。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述葫蘆科植物是日本香瓜(Cucumis melo L.)。
25.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述雙子葉植物是旋花科植物。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述旋花科植物是牽?；?Pharbitis nil Choisy)。
27.一種用于產(chǎn)生植物的方法，其中核酸被轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中，包括下列步驟a)將細(xì)胞保持在不同于大氣壓的壓力下；并b)將細(xì)胞及核酸置于能夠引發(fā)電穿孔的條件下。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，還包括使細(xì)胞分化、生長、和/或增殖的步驟。
29.根據(jù)權(quán)利要求27或28所述的方法，其中步驟a)包括將含有細(xì)胞的種子保持在不同于大氣壓的壓力下的步驟，且步驟b)包括將含有細(xì)胞及核酸的種子置于能夠引發(fā)電穿孔的條件下的步驟。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述種子是單子葉植物的種子。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述單子葉植物的種子是禾本科的種子。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中所述禾本科的種子是小麥(Triticum aestivum L.)種子。
33.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中所述禾本科的種子是稻(Oryza sativa L.)的種子。
34.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中所述禾本科的種子是玉米(Zea mays L.)種子。
35.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述種子是雙子葉植物的種子。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中所述雙子葉植物的種子是十字花科種子。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述十字花科的種子是大白菜(Brassica rapa L.)的種子。
38.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述十字花科的種子是油菜(Brassica napus L.)的種子。
39.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中所述雙子葉植物的種子是豆科的種子。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述豆科的種子是大豆(Glycine max Merr)的種子。
41.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中所述雙子葉植物的種子是茄科的種子。
42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中所述茄科的種子是番茄(Lycopersicum esculentum Mill)的種子。
43.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中所述雙子葉植物的種子是葫蘆科的種子。
44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中所述葫蘆科的種子是日本香瓜(Cucumis melo L.)的種子。
45.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中所述雙子葉植物的種子是旋花科的種子。
46.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中所述旋花科的種子是牽牛花(Pharbitis nil Choisy)的種子。
47.一種通過權(quán)利要求27-46任何一項(xiàng)所述的方法生產(chǎn)的植物。
48.根據(jù)權(quán)利要求47所述的植物，其不含體細(xì)胞克隆變異。
49.一種用于將核酸轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中的裝置，包括a)用于將細(xì)胞保持在不同于大氣壓的壓力下的部分；和b)用于電穿孔的部分。
50.根據(jù)權(quán)利要求49所述的裝置，其中用于將細(xì)胞保持在不同于大氣壓的壓力下的部分具有維持壓力低于大氣壓的能力。
51.根據(jù)權(quán)利要求49所述的裝置，其中所述細(xì)胞是植物細(xì)胞。
52.根據(jù)權(quán)利要求49所述的方法，其中b)的電穿孔部分包括起陽極作用的第一電極；和起陰極作用的第二電極，其中第一電極與第二電極之間距離的長度足以容納植物種子。
53.根據(jù)權(quán)利要求52所述的裝置，其中第一電極與第二電極之間的距離為至少約5mm。
54.根據(jù)權(quán)利要求52所述的裝置，其中第一電極與第二電極之間的距離長于約1cm。
55.根據(jù)權(quán)利要求52所述的裝置，其中第一電極和第二電極是鉑電極。
56.根據(jù)權(quán)利要求49所述的裝置，其中b)的電穿孔部分包括起陽極作用的第一電極；和起陰極作用的第二電極，其中第一電極與第二電極之間的距離可被改變，從而使植物種子可被容納于第一和第二電極之間。
57.根據(jù)權(quán)利要求56所述的裝置，其中第一電極和第二電極是鉑電極。
58.一種用于將核酸轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中，并將細(xì)胞保持在不同于大氣壓的壓力下的電穿孔裝置，該裝置包括起陽極作用的第一電極；和起陰極作用的第二電極，其中第一電極與第二電極之間距離的長度足以容納植物種子。
59.根據(jù)權(quán)利要求58所述的裝置，其中第一電極與第二電極之間的距離為至少約5mm。
60.根據(jù)權(quán)利要求58所述的裝置，其中第一電極與第二電極之間的距離長于約1cm。
61.根據(jù)權(quán)利要求58所述的裝置，其中第一電極和第二電極是鉑電極。
62.一種用于將核酸轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中，并將細(xì)胞保持在不同于大氣壓的壓力下的電穿孔裝置，該裝置包括起陽極作用的第一電極；和起陰極作用的第二電極，其中第一電極與第二電極之間的距離可被改變，從而使植物種子可被容納于第一和第二電極之間。
63.根據(jù)權(quán)利要求62所述的裝置，其中第一電極和第二電極是鉑電極。
64.一種能抵抗不同于大氣壓的壓力并具有足以容納植物種子大小的電穿孔室。
65.根據(jù)權(quán)利要求64所述的電穿孔室，其中與電穿孔室內(nèi)壁上的至少3個點(diǎn)相切的最大內(nèi)切圓直徑為至少約5mm。
66.根據(jù)權(quán)利要求64所述的電穿孔室，其中與電穿孔室內(nèi)壁上的至少3個點(diǎn)相切的最大內(nèi)切圓直徑長于約1cm。
67.根據(jù)權(quán)利要求64所述的電穿孔室，其中該室具有四邊形的橫截面，且室的內(nèi)部尺寸是約1cm×2cm×2cm。
68.根據(jù)權(quán)利要求64所述的電穿孔室，其中該室具有圓形的橫截面，且室的內(nèi)部尺寸是約1cm×4cm。
69.一種能夠抵抗不同于大氣壓的壓力的電穿孔室，其中該室的大小可被改變，從而使植物種子可被容納于室中。
70.一種用于自動進(jìn)行電穿孔的裝置，包括a)用于放置含核酸及細(xì)胞的混合物的容器；b)用于在容器a)中放置核酸的部分；c)用于在容器a)中放置細(xì)胞的部分；d)用于將細(xì)胞保持在不同于大氣壓的壓力下的容器，該容器能夠抵抗不同于大氣壓的壓力；e)用于在容器d)中放置細(xì)胞的部分；f)用于將容器d)的內(nèi)部區(qū)域維持在不同于大氣壓的壓力下的部分；g)用于向含核酸及細(xì)胞的混合物施加高壓脈沖的容器；h)用于在容器g)中放置含核酸及細(xì)胞的混合物的部分；i)用于向容器g)中含核酸及細(xì)胞的混合物施加高壓脈沖的部分；和j)用于自動運(yùn)行部分b)、c)、e)、f)、h)、和i)的部分，其中部分b)和部分c)彼此相同或不同；部分e)和部分h)彼此相同或不同；且容器a)、容器d)、和容器g)彼此相同或不同。
全文摘要
本發(fā)明的目的是建立一種比常規(guī)技術(shù)更簡單且更快速的轉(zhuǎn)化方法。該目的可通過以下方法解決，該方法包括下列步驟a)將細(xì)胞保持在不同于大氣壓的壓力下，并且b)將細(xì)胞及核酸置于能夠引發(fā)電穿孔的條件下。本發(fā)明取消了基因轉(zhuǎn)移后通常所需的培養(yǎng)的必要性。因此，本發(fā)明可獲得不能或很難通過常規(guī)技術(shù)轉(zhuǎn)化的物種的轉(zhuǎn)化體。本發(fā)明的簡單轉(zhuǎn)化方法可很容易進(jìn)行大規(guī)模的處理和大規(guī)模的分析，用于本領(lǐng)域的研究和發(fā)展。此外，本發(fā)明可引起研究的顯著進(jìn)步，潛在導(dǎo)致創(chuàng)新重組體的開發(fā)。
文檔編號C12M1/42GK1668752SQ03816759
公開日2005年9月14日 申請日期2003年7月14日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月16日
發(fā)明者萩尾高志, 田部井豐 申請人:獨(dú)立行政法人農(nóng)業(yè)生物資源研究所