專利名稱：一種電穿孔轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種電穿孔轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
隨著生物技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的外源重組質(zhì)粒需要轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞(細(xì)菌、酵母或動(dòng)物細(xì)胞)中用于表達(dá)外源基因或研究某些基因的功能。大腸桿菌的轉(zhuǎn)化常用化學(xué)轉(zhuǎn)化法和電穿孔轉(zhuǎn)化法，酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化采用電穿孔轉(zhuǎn)化法和原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法，而動(dòng)物細(xì)胞可用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法和電穿孔轉(zhuǎn)染法?，F(xiàn)有的動(dòng)物細(xì)胞尤其是哺乳動(dòng)物細(xì)胞普遍采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，電穿孔轉(zhuǎn)染法使用比較少，而昆蟲(chóng)細(xì)胞一般采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，沒(méi)有關(guān)于電穿孔轉(zhuǎn)染法的報(bào)道。昆蟲(chóng)細(xì)胞在基因工程表達(dá)外源基因方面日益受到人們的重視，昆蟲(chóng)細(xì)胞與桿狀病毒組合形成了一個(gè)強(qiáng)大而通用的表達(dá)系統(tǒng)，具有大多數(shù)高等真核生物相似的翻譯后修飾、 加工外源蛋白的能力。桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)安全性高，對(duì)外源基因克隆容量大，重組病毒易于篩選，具有多角體啟動(dòng)子控制下，能夠穩(wěn)定而高效表達(dá)，容易從無(wú)血清培養(yǎng)上清中純化， 無(wú)內(nèi)毒素污染等特點(diǎn)。昆蟲(chóng)細(xì)胞一桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)作為表達(dá)系統(tǒng)之一，已廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、醫(yī)藥衛(wèi)生和農(nóng)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新等各個(gè)領(lǐng)域。但是，hvitrogen公司的Bac-to-Bac、 Clonetech公司的pBacI^ak、BD公司的BaculoGold以及其他公司的桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，將外源基因重組到穿梭質(zhì)粒上后，與線性化野生型病毒基因組共同轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞或者直接將重組桿狀病毒基因組轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞時(shí)，都采用脂質(zhì)體如Cellfectin來(lái)完成，這種試劑雖然每次用量較少，但一個(gè)包裝都比較昂貴，未使用完放置時(shí)間較長(zhǎng)也會(huì)過(guò)期或失效。而一般基因工程實(shí)驗(yàn)室都有電穿孔儀器用于細(xì)菌或酵母的轉(zhuǎn)化，而用于動(dòng)物細(xì)胞尤其是昆蟲(chóng)細(xì)胞的電穿孔轉(zhuǎn)染外源基因極為少見(jiàn)，理論上是可以轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，但是沒(méi)有詳細(xì)的操作方法和說(shuō)明。 采用電穿孔方法轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞不僅可以充分利用現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)室儀器，而且避免了重復(fù)購(gòu)置轉(zhuǎn)染試劑以及試劑過(guò)期失效造成的浪費(fèi)。在轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的操作上，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染動(dòng)物細(xì)胞的周期較長(zhǎng)，一般超過(guò)5小時(shí)以上；而電穿孔轉(zhuǎn)染僅需5分鐘，周期短。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用電穿孔技術(shù)將質(zhì)?；蚧蚪M轉(zhuǎn)化到昆蟲(chóng)細(xì)胞的方法。本發(fā)明中昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)來(lái)包括來(lái)自于草地夜蛾kSpodoptera frugiperda)的 Sf-9、Sf-21昆蟲(chóng)細(xì)胞系以及商品化的High Five 昆蟲(chóng)細(xì)胞系；桿狀病毒來(lái)自于苜宿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographa californica NPV，AcNPV)，并由此構(gòu)建的桿狀病毒基因組(Bacmid)轉(zhuǎn)化形成五coli DH10BAC,以及穿梭質(zhì)粒pFastBac，用于將外源基因通過(guò)同源重組整合到Bacmid中，從而形成重組的桿狀病毒基因組。將病毒基因組轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞后形成具有感染性的重組桿狀病毒。所述方法按如下步驟進(jìn)行
1)構(gòu)建含報(bào)告基因的重組桿狀病毒基因組報(bào)告基因經(jīng)過(guò)酶切重組到穿梭質(zhì)粒中形成含報(bào)告基因的重組穿梭質(zhì)粒后，將含報(bào)告基因的重組穿梭質(zhì)粒在大腸桿菌中通過(guò)同源重組構(gòu)建含報(bào)告基因的重組桿狀病毒基因組。2)電穿孔轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞
將重組桿狀病毒基因組和昆蟲(chóng)細(xì)胞在電穿孔緩沖液中混和，在電穿孔儀器中按照電穿孔條件進(jìn)行電穿孔轉(zhuǎn)染，從而將外源基因轉(zhuǎn)染到昆蟲(chóng)細(xì)胞中，所述的電穿孔緩沖液為 200-400mM 蔗糖，7-13mM Na3PO4, l_3mM MgCl2, pH6. 2-6. 6 ；電穿孔條件為電壓 100-140V，電擊時(shí)間25-35ms，溫度0-25"C。本發(fā)明所述的方法中穿梭質(zhì)粒為pFastBacl、pFastBac Dual、pBacPak、pAcSG及其衍生質(zhì)粒。本發(fā)明所述的方法中昆蟲(chóng)細(xì)胞為Sf-9細(xì)胞、Sf-21細(xì)胞、High Five細(xì)胞。與常規(guī)轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞普遍采用的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法相比，本發(fā)明采用電穿孔方法將外源質(zhì)粒轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞比較簡(jiǎn)便、周期短、成本低，不必購(gòu)買昂貴的轉(zhuǎn)染試劑，而且轉(zhuǎn)染效果和效率與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法相近。
以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明實(shí)施方案。

圖1是GFP基因擴(kuò)增電泳圖。泳道1為DNA Marker ；泳道2為GFP基因片段。圖2是重組穿梭質(zhì)粒GFP/pFastBac的雙酶切鑒定電泳圖。泳道1為DNA Marker ； 泳道2和3為重組穿梭質(zhì)?；蚱蔚腎與χΑο I雙酶切產(chǎn)物。圖3是重組桿狀病毒基因組的PCR電泳圖。泳道1為DNA Marker ；泳道2為1# 重組桿狀病毒基因組的PCR產(chǎn)物；泳道3為2#重組桿狀病毒基因組的PCR產(chǎn)物；泳道4為 3#重組桿狀病毒基因組的PCR產(chǎn)物；泳道5為4#重組桿狀病毒基因組的PCR產(chǎn)物。圖4是重組桿狀病毒基因組電穿孔轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞后顯微鏡觀察圖。A是紫外激發(fā)光下的細(xì)胞，B是可見(jiàn)光下的細(xì)胞。圖5是重組桿狀病毒基因組脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞后顯微鏡觀察圖。A是紫外激發(fā)光下的細(xì)胞，B是可見(jiàn)光下的細(xì)胞。圖6是重組桿狀病毒基因組電穿孔轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞子代細(xì)胞顯微鏡觀察圖。A是紫外激發(fā)光下的細(xì)胞，B是可見(jiàn)光下的細(xì)胞。圖7是重組桿狀病毒基因組脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞子代細(xì)胞顯微鏡觀察圖。A是紫外激發(fā)光下的細(xì)胞，B是可見(jiàn)光下的細(xì)胞。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1
(1)重組穿梭質(zhì)粒GFP/pFastBac的構(gòu)建和重組桿狀病毒基因組的獲得以PEGFP-N2質(zhì)粒(來(lái)源于BD bioscience Clontech公司)為模板，使用TaqPlus DNA聚合酶(來(lái)源于TIANGEN公司，J8422)擴(kuò)增GFP基因，并引入I與功ο I酶切位點(diǎn)，引物序列為 GFPPl 5，-CGGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG -3，；GFPP2: 5，-CCGCTCGAGTTACTTG TACAGCTCGTCCATG-3，。PCR擴(kuò)增條件95°C，5min 預(yù)變性；95°C變性 30sec，50°C退火 45sec， 72°C延伸2min ；30個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。采用BIO-RAD PCR擴(kuò)增儀，PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察，獲得了預(yù)期750bp大小的GFP基因(見(jiàn)附圖1)，膠回收純化 GFP基因。重組穿梭質(zhì)粒GFP/pFastBac的構(gòu)建取GFP基因和穿梭質(zhì)粒pFastBacl (來(lái)源于 Invitrogen公司，為昆蟲(chóng)細(xì)胞的表達(dá)質(zhì)粒)各1 μ g分別用IOU BanR I (來(lái)源于TAKALA公司，CKB701A)與IOU xho I (來(lái)源于TAKALA公司，CK1701A)于37°C酶切3小時(shí)后，分別進(jìn)行膠回收；取膠回收純化的GFP片段雙酶切產(chǎn)物IOOng和純化的穿梭質(zhì)粒pFastBacl雙酶切產(chǎn)物150ng用T4 DNA連接酶IU (來(lái)源于TAKALA公司，CK5021B) 16°C連接過(guò)夜；連接產(chǎn)物通過(guò)熱休克法轉(zhuǎn)化CaCl2制備的五coli DH5 α，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于Amp+/Gem+-LB雙抗性平板，37°C培養(yǎng)16小時(shí)，挑取2個(gè)單菌落接種AmpYGem+-LB雙抗性培養(yǎng)液中增菌后，使用質(zhì)粒抽提試劑盒(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)提取和純化質(zhì)粒，用I與勸ο I 雙酶切鑒定重組穿梭質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳觀察，獲得了預(yù)期大小的片段(見(jiàn)附圖2)，表明 GFP基因重組到pFastBac質(zhì)粒上。重組桿狀病毒基因組GFP/BAC的獲得將重組穿梭質(zhì)粒GFP/pFastBac，通過(guò)熱休克法轉(zhuǎn)化CaCl2制備的五coli DH10BAC(來(lái)源于INVITR0GEN公司)，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含 100 μ g/ml x-gal 與 40 μ g/ml IPTG 的 KanYGem+Aet+-LB 三抗性平板上，37 "C 培養(yǎng)過(guò)夜，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。挑取4個(gè)白斑菌落，在上述三抗性平板上劃線，37°C培養(yǎng)， 重復(fù)三輪劃線篩選后，挑取4個(gè)白斑菌落使用Taq酶(TIANGEN公司，J8428)和通用引物進(jìn)行菌落 PCR 鑒定。通用引物序列M13 Forward 5，-GTTTTCCCAGTCACGAC-3，，Ml3 Reverse 5，-CAGGAAACAGCTATGAC-3，。PCR 擴(kuò)增條件為94°C 5min ；94 "C 45s，55°C45s， 72°C 5min (30個(gè)循環(huán))；72°C IOmin0 PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察，獲得了預(yù)期3106bp大小的片段，包含有轉(zhuǎn)座子基因、啟動(dòng)子序列和GFP基因(見(jiàn)附圖3)，對(duì)應(yīng)的菌落則含有重組桿狀病毒基因組GFP/BAC。將含有重組桿狀病毒基因組GFP/BAC的菌落接種于5ml液體Kan"Gem7Tet+-LB中，37°C振蕩培養(yǎng)18小時(shí)，取1. 5ml菌液轉(zhuǎn)于1. 5ml Eppendorf管中，14000g，離心1分鐘，棄上清，菌體沉淀用堿裂解法提取重組病毒基因組 GFP/BAC (參見(jiàn)分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第二版)。獲得的GFP/BAC基因組于-20°C凍存?zhèn)溆谩?2)重組桿狀病毒基因組的電穿孔轉(zhuǎn)染和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞
重組桿狀病毒基因組電穿孔轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞酚氯仿抽提的GFP/BAC基因組，乙醇沉淀濃縮至lOOng/μ 1，共30μ 1，加入等體積電穿孔緩沖液平衡，電穿孔緩沖液為300mM蔗糖， IOmM Na3PO4, ImM MgCl2, pH6. 4。用生長(zhǎng)液(Grace 粉 4. 572%, NaHCO3 0. 0；35%、水解乳蛋白 0. 33%、酵母浸提物0. 33%、胎牛血清10%、青霉素4U、鏈霉素10U，NaOH調(diào)pH至6. 4)吹下細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的昆蟲(chóng)細(xì)胞Sf-9細(xì)胞，吸出并轉(zhuǎn)入離心管中，IOOOrpm離心5分鐘，棄去上清生長(zhǎng)液，使用電穿孔緩沖液清洗離心沉淀的細(xì)胞兩次，IOOOrpm離心5分鐘，棄去電穿孔緩沖液后，用ΙΟΟμΙ電穿孔緩沖液重懸沉淀的Sf-9細(xì)胞，細(xì)胞密度為IO4個(gè)/μ 1，加入平衡后的GFP/BAC基因組混勻，轉(zhuǎn)移至2mm電轉(zhuǎn)杯中，冰水浴5分鐘；電穿孔儀器為BIO-RAD Xcell,電穿孔條件為電壓140V、電擊時(shí)間25ms、溫度4°C ；電轉(zhuǎn)結(jié)束后，電轉(zhuǎn)杯置于冰水浴中5min后，吸出細(xì)胞鋪于六孔板中，用生長(zhǎng)液0. 5ml沖洗電轉(zhuǎn)杯中的細(xì)胞，加入到六孔板同一孔中，繼續(xù)加入生長(zhǎng)液至:3ml，27°C恒溫培養(yǎng)，3天后熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染情況(見(jiàn)附圖 4)，熒光細(xì)胞數(shù)為0. 87 XlOVml,占所在孔細(xì)胞數(shù)量的的比例為86. 14%。重組桿狀病毒基因組脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞重組桿狀病毒基因組脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染前對(duì)小時(shí)，將Sf-9細(xì)胞置六孔板于27°C進(jìn)行培養(yǎng)，每孔細(xì)胞數(shù)為IO6個(gè)。酚氯仿抽提GFP/BAC 基因組，乙醇沉淀濃縮至10 μ 1，濃度為1001^/^1，然后加入9(^1無(wú)血清生長(zhǎng)液平衡。取 6μ 1脂質(zhì)體Cellfectin(來(lái)源于Invitrogen公司，383437)，加入100 μ 1無(wú)血清生長(zhǎng)液，混勻，再與GFP/BAC混合，常溫下靜置30分鐘。同時(shí)，棄去六孔板Sf-9細(xì)胞的生長(zhǎng)液，用無(wú)血清生長(zhǎng)液清洗Sf-9細(xì)胞表面兩次，加入0. 8ml無(wú)血清生長(zhǎng)液至Cellfectin與GFP/BAC混合液中，混勻后移至Sf-9細(xì)胞表面，27°C靜置培養(yǎng)證后，吸出細(xì)胞表面生長(zhǎng)液，加入新鮮生長(zhǎng)液，27°C恒溫培養(yǎng)，3天后熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染情況(見(jiàn)附圖5)，熒光細(xì)胞數(shù)為1. 24X IO6/ ml,占所在孔細(xì)胞數(shù)量的的比例為86. 53%。比較兩種不同的轉(zhuǎn)染Sf-9細(xì)胞方法發(fā)現(xiàn)，重組桿狀病毒基因組的電穿孔轉(zhuǎn)染和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞均能成功，并有相近結(jié)果，但是電穿孔法比脂質(zhì)體法簡(jiǎn)便、快速。(3)重組桿狀病毒的制備和傳代
將含有綠色熒光的細(xì)胞，連同上清的生長(zhǎng)液(含有重組桿狀病毒)一起從六孔板中，吸出并轉(zhuǎn)入離心管中，IOOOrpm離心5分鐘。收集上清液，上清液含有重組桿狀病毒液，標(biāo)記為第一代重組病毒為P1，于4°C保存。Sf-9細(xì)胞以IO6個(gè)/孔鋪入六孔板中，27°C靜置培養(yǎng) 24小時(shí)后，每孔接入500 μ 1重組桿狀病毒液。27°C恒溫培養(yǎng)，3天后熒光顯微鏡觀察傳代情況(見(jiàn)附圖6、7)。結(jié)果表明電穿孔法和脂質(zhì)體法獲得的Pl重組桿狀病毒能夠繼續(xù)感染 Sf-9細(xì)胞，而且傳代后子代病毒可以繼續(xù)表達(dá)外源基因GFP。實(shí)施例2
(1)重組穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建和重組桿狀病毒基因組的獲得，方法同實(shí)施例1，采用的穿梭質(zhì)粒為pBacPak。(2)重組桿狀病毒基因組的電穿孔轉(zhuǎn)染和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞，方法同實(shí)施例1， 昆蟲(chóng)細(xì)胞為sf-21，采用的電穿孔緩沖液為400mM蔗糖，7mM Na3PO4, 3mM MgCl2, pH值為6. 4 ； 電穿孔條件為電壓140V，電擊時(shí)間25ms，溫度4°C。結(jié)果熒光細(xì)胞數(shù)為0. 77X 106/ml，占所在孔細(xì)胞數(shù)量的的比例為82. 68%。(3)重組桿狀病毒的制備和傳代，方法同實(shí)施例1。實(shí)施例3
(1)重組穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建和重組桿狀病毒基因組的獲得，方法同實(shí)施例1，采用的穿梭質(zhì)粒為pBacPak。(2)重組桿狀病毒基因組的電穿孔轉(zhuǎn)染和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞，方法同實(shí)施例1， 昆蟲(chóng)細(xì)胞為sf-21，采用的電穿孔緩沖液為200mM蔗糖，13mM Na3PO4, ImM MgCl2, pH值為 6. 4;電穿孔條件為電壓140V，電擊時(shí)間25ms，溫度4°C。結(jié)果熒光細(xì)胞數(shù)為0. 73X IO6/ ml,占所在孔細(xì)胞數(shù)量的的比例為82. 16%。(3)重組桿狀病毒的制備和傳代，方法同實(shí)施例1。實(shí)施例4:
(1)重組穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建和重組桿狀病毒基因組的獲得，方法同實(shí)施例1，采用的穿梭質(zhì)粒為 pFastBacl。(2)重組桿狀病毒基因組的電穿孔轉(zhuǎn)染和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞，方法同實(shí)施例1， 昆蟲(chóng)細(xì)胞為sf-9，采用的電穿孔緩沖液為300mM蔗糖，IOmM Na3PO4, ImM MgCl2, pH 6. 4 ；電穿孔條件為電壓100V，電擊時(shí)間35ms，溫度8°C。結(jié)果熒光細(xì)胞數(shù)為0. 28X 106/ml,占所在孔細(xì)胞數(shù)量的比例為23. 53%。(3)重組桿狀病毒的制備和傳代，方法同實(shí)施例1。實(shí)施例5
(1)重組穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建和重組桿狀病毒基因組的獲得，方法同實(shí)施例1，采用的穿梭質(zhì)粒為pAcSG。(2)重組桿狀病毒基因組的電穿孔轉(zhuǎn)染和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞，方法同實(shí)施例1， 昆蟲(chóng)細(xì)胞為High Five，采用的電穿孔緩沖液為300mM蔗糖，IOmM Na3PO4, ImM MgCl2, pH 6. 6;電穿孔條件為140V，電擊時(shí)間25ms，溫度0°C。結(jié)果熒光細(xì)胞數(shù)為0. 81 X 106/ml，
占所在孔細(xì)胞數(shù)量的的比例為81. 11%。(3)重組桿狀病毒的制備和傳代，方法同實(shí)施例1。實(shí)施例6
(1)重組穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建和重組桿狀病毒基因組的獲得，方法同實(shí)施例1，采用的穿梭質(zhì)粒為pAcSG。(2)重組桿狀病毒基因組的電穿孔轉(zhuǎn)染和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞，方法同實(shí)施例1， 昆蟲(chóng)細(xì)胞為High Five，采用的電穿孔緩沖液為300mM蔗糖，IOmM Na3PO4, 2mM MgCl2, pH 6. 2 ；電穿孔條件為電壓130V，電擊時(shí)間30ms，溫度25°C。結(jié)果熒光細(xì)胞數(shù)為0. 62 X IO6/ ml,占所在孔細(xì)胞數(shù)量的的比例為71. 75%。(3)重組桿狀病毒的制備和傳代，方法同實(shí)施例1。
權(quán)利要求
1.一種電穿孔轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞的方法，其特征在于所述方法按如下步驟進(jìn)行1)構(gòu)建含報(bào)告基因的重組桿狀病毒基因組報(bào)告基因經(jīng)過(guò)酶切重組到穿梭質(zhì)粒中形成含報(bào)告基因的重組穿梭質(zhì)粒后，在大腸桿菌中通過(guò)同源重組構(gòu)建含報(bào)告基因的重組桿狀病毒基因組；2)電穿孔轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞將重組桿狀病毒基因組和昆蟲(chóng)細(xì)胞在電穿孔緩沖液中混和，在電穿孔儀器中按照電穿孔條件進(jìn)行電穿孔轉(zhuǎn)染，從而將外源基因轉(zhuǎn)染到昆蟲(chóng)細(xì)胞中，所述的電穿孔緩沖液為 200-400mM 蔗糖，7-13mM Na3PO4, l_3mM MgCl2, pH6. 2-6. 6 ；電穿孔條件為電壓 100-140V，電擊時(shí)間 25-;35ms，溫度 0-25"C。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電穿孔轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞的方法，其特征是穿梭質(zhì)粒為 pFastBacl、pFastBac Dual、pBacPak、pAcSG 及其衍生質(zhì)粒。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的電穿孔轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞的方法，其特征是昆蟲(chóng)細(xì)胞為Sf-9 細(xì)胞、Sf-21細(xì)胞、High Five細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種電穿孔轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞的方法，本方法將構(gòu)建的含報(bào)告基因的重組桿狀病毒基因組和昆蟲(chóng)細(xì)胞在電穿孔緩沖液中混和，在電穿孔儀器中按照電穿孔條件進(jìn)行電穿孔轉(zhuǎn)染，從而將外源基因轉(zhuǎn)染到昆蟲(chóng)細(xì)胞中。此方法操作簡(jiǎn)單、周期短、成本低。
文檔編號(hào)C12N5/10GK102250842SQ20111013342
公開(kāi)日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2011年5月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月23日
發(fā)明者井申榮, 曾韋錕, 楊靖佳, 黃芬 申請(qǐng)人:昆明理工大學(xué)