專利名稱：口部粘膜電穿孔裝置及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能夠?qū)⒅委焺┻f送至受試者的電穿孔裝置。
背景技術(shù)：
已知大量人病原體在粘膜表面處引起感染，因此使得通過胃腸道、泌尿生殖道和呼吸道進(jìn)入機(jī)體。結(jié)果，接觸感染的其他首要方式是通過血液-負(fù)載的途徑，例如注射、輸液和叮咬。粘膜感染劑的例子包括感冒病毒、流感、食物中毒劑、結(jié)核病、性傳播疾病和瘟疫。粘膜是機(jī)體的最大器官中的一種?？傮w來說，它們覆蓋超過400m2的表面積(等同于一個半網(wǎng)球場)，并且包括胃腸道、泌尿生殖道和呼吸道的內(nèi)層。這些粘膜表面盡管位于體內(nèi)，但是實際上是已知為"系統(tǒng)"環(huán)境的機(jī)體的外部和無菌內(nèi)腔之間的物理屏障。關(guān) 鍵營養(yǎng)物、氧氣和其他分子穿過這些粘膜屏障被不斷地攝??；然而，粘膜的另外重要功能是防范病原體入侵。每日這些粘膜被外部元素轟擊，并且直到獨特的粘膜免疫系統(tǒng)來決定什么是潛在有害的和什么是有益的。粘膜免疫的重要性存在于粘膜應(yīng)答和系統(tǒng)免疫應(yīng)答之間的相互影響。一些研究已經(jīng)證實，系統(tǒng)性刺激免疫系統(tǒng)(即通過注射或?qū)W院-負(fù)載的途徑)導(dǎo)致僅在機(jī)體的無菌內(nèi)部環(huán)境內(nèi)產(chǎn)生保護(hù)性抗體和T細(xì)胞-沒有產(chǎn)生粘膜應(yīng)答。另一方面，粘膜免疫應(yīng)答的刺激可以導(dǎo)致在粘膜和系統(tǒng)環(huán)境中產(chǎn)生保護(hù)性B和T細(xì)胞，使得在它們進(jìn)入機(jī)體之前就停止感染。粘膜產(chǎn)生特定類型的抗體，稱為分泌型IgA或slgA。粘膜浸在大量slgA中，這起到防御第一線的作用以使侵入的病原體中和。試驗證據(jù)表明slgA的存在和對于各種病原體引起的感染的抗性有關(guān)，所述病原體包括細(xì)菌、病毒、寄生蟲和真菌。還表明使病毒中和并防止它們粘附于粘膜內(nèi)層的上皮細(xì)胞(從而防止感染)，以及介導(dǎo)病原體的排泄和防止成熟病毒顆粒的集合。粘膜免疫的另外重要部分是T細(xì)胞-介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。特異性識別病原體的T-細(xì)胞可以幫助抗體清除感染或直接殺死入侵者本身。粘膜中產(chǎn)生的T細(xì)胞能夠通過它們膜上的特別"導(dǎo)航"受體在粘膜組織內(nèi)運動。這表示如果免疫應(yīng)答產(chǎn)生于胃腸道內(nèi)層，此處產(chǎn)生的T細(xì)胞可以運動至其他粘膜位點，例如肺腔或鼻腔，從而在較大面積內(nèi)提供保護(hù)。盡管粘膜表面具有重要的作用，但是只有少量疫苗特異性靶向該免疫系統(tǒng)區(qū)域，因此保持需要這樣的疫苗，該疫苗導(dǎo)向粘膜表面以在粘膜組織處提供保護(hù)性免疫應(yīng)答。發(fā)明概述提供能夠電穿孔哺乳動物的粘膜細(xì)胞的電穿孔裝置。這種裝置包括電極顯微針板、反電極板、主殼體和能量源。主殼體物理相連所述顯微針板和反電極板,其中主殼體流體相連注射器，所述注射器能夠儲存用于遞送的藥劑。能量源電相連顯微針板，并且能夠產(chǎn)生電勢和通過所述顯微針板將所述電勢遞送至所述細(xì)胞。在另一方面，提供使用提供的裝置將藥劑施用至哺乳動物的粘膜細(xì)胞的方法。所述方法包括使所述顯微針板接觸所述粘膜；將所述藥物組成遞送至所述粘膜；以及應(yīng)用電穿孔，從而通過所述顯微針板由所述能量源產(chǎn)生電脈沖至所述粘膜。附圖簡述圖I示出待在小鼠中進(jìn)行的免疫(通過標(biāo)準(zhǔn)注射)和攻擊時間表。圖2顯示圖，該圖示出趨化因子佐劑在粘膜肺部感染的小鼠模型中誘導(dǎo)特異性針對流感APR/8/34的細(xì)胞內(nèi)免疫。圖3a顯示圖，該圖示出流感A/PR/8/34-特異性血清長期存活的IgA和IgG預(yù)-攻擊；圖3b顯示圖，該圖示出流感A/PR/8/34中和抗體預(yù)-攻擊；圖3c顯示線圖，該圖示出數(shù)天內(nèi)平均重量損失；以及圖3d顯示線圖，該圖示出在攻擊后各種的存活率。圖4顯示關(guān)于Indian Rhesus獼猴免疫目錄的時間表和另外的信息?！?br> 圖5顯示圖，該圖示出DNA疫苗的已知頂(肌肉)/EP(電穿孔)遞送的ELISpot數(shù)據(jù)優(yōu)于僅僅頂遞送。圖6顯示圖和圖像，它們示出產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答圖6a顯示圖，該圖示出ELISpot數(shù)據(jù)；圖6b顯示圖，該圖示出T細(xì)胞增殖水平；圖6c示出來自RlO或SIV肽培養(yǎng)基的板；以及圖6d示出表明CFSE增殖的圖像。圖7顯示圖像，該圖像示出在BAL中由⑶4+T細(xì)胞引起的CTACKCo-免疫增強(qiáng)細(xì)胞因子分泌圖7a顯示圖，該圖示出外周中的細(xì)胞應(yīng)答；圖7b顯示圖，該圖示出BAL中的細(xì)胞應(yīng)答。圖8顯示圖，該圖示出CTACK在肺部引誘高水平的細(xì)胞因子分泌⑶8+T細(xì)胞圖8a顯示圖，該圖示出107a+⑶8+水平；圖8b顯示圖，該圖示出IFN-Y⑶+水平；圖8c顯示圖，該圖示出TNF+⑶8+水平；以及圖8d顯示圖，該圖示出IL-2+⑶8+水平。圖9顯示照片，其通過熒光的方式示出陽性GFP表達(dá)。圖 10 顯不4x4 陣列(Inovio Pharmaceuticals, Inc. ,Blue Bell,Pennsylvania)。

圖11顯示圖，該圖示出使用SynCon 流感疫苗免疫的獼猴血清中的HAI滴度水平。示出的結(jié)果為兩周后的次級免疫圖Ila為涉及A/HlNl/Mexico/2009株的HAI滴度；以及圖Ilb為涉及A/HlNl/NewCaledonia的HAI滴度。圖12a顯示照片，其示出淺層注射GFP質(zhì)粒和電穿孔后豚鼠口部粘膜組織中的GFP表達(dá)。在3天后處理收獲全部面頰頂部，并且在熒光顯微鏡下觀察以確定陽性GFP表達(dá)。圖12b顯示圖，該圖示出在豚鼠中3次免疫后H5-特異性IgA滴度。圖13是口部電穿孔/注射裝置的3/4視圖，其包括脈沖發(fā)生器、注射和電穿孔裝置。圖14是繪圖，其示出口部電穿孔/注射裝置的垂直剖視圖A-A。圖15是電穿孔/注射裝置的分解組件。圖16是電穿孔/注射裝置的主電極顯微針板。圖17示出涉及開口的0Μ-Ι/ΕΡ裝置。圖18顯示圖，該圖示出a)唾液；b)大便；c)血液中的IgA滴度。發(fā)明詳述提供能夠電穿孔哺乳動物的粘膜細(xì)胞的電穿孔裝置。這種裝置包括電極顯微針板、反電極板、主殼體和能量源。主殼體物理相連所述顯微針板和反電極板,其中主殼體流體相連注射器，所述注射器能夠儲存用于遞送的藥劑。能量源電相連顯微針板，并且能夠產(chǎn)生電勢和通過所述顯微針板將所述電勢遞送至所述細(xì)胞。在實施方案中，在所述主殼體和所述顯微針板之間還存在物理相連的活塞。所述活塞是可驅(qū)動的，并且通過驅(qū)動能夠通過所述顯微針板弓I起甚至所述藥劑的分布。在本發(fā)明的一個方面，提供口部電穿孔(EP)裝置，其能夠優(yōu)選以可容忍的方式產(chǎn)生電穿孔，從而在粘膜層處引起電場。在該方面的一個實施方案中，存在口部粘膜注射和電穿孔裝置(0Μ-Ι/ΕΡ)，其適于遞送治療劑(或預(yù)防劑)，例如DNA疫苗，并且轉(zhuǎn)染到口腔內(nèi)部上的粘膜組織/細(xì)胞中。在DNA免疫過程中，裝置將穿過患者的面頰區(qū)域附著。具有主電極顯微針板特征的主體在口腔的內(nèi)部上，并且臨近的返回電極板夾具特征在面頰的外部上。DNA疫苗將通過顯微針板注射；然后這將進(jìn)行施加至相同電極顯微針板的低電壓EP脈沖，該設(shè)計將DNA疫苗和電穿孔共同定位至相同區(qū)域。研究表明DNA疫苗和EP以DNA疫苗轉(zhuǎn)染到周圍細(xì)胞中的量共同定位是非常重要的。在一些實施方案中，顯微針板的顯微針由導(dǎo)電材料制成，所述導(dǎo)電材料包括鍍金和銀的黃銅、鍍金和銀的銅、不銹鋼或鈦、或其他通常已知的導(dǎo)電金屬或金屬樣材料。在一·些實施方案中，能量源能夠以至少一種電能脈沖通過所述顯微針板遞送至所述粘膜細(xì)胞，所述電能脈沖具有IV至30V、2mA至IOOmA或ImS至250mS的特性。粘膜或粘膜組織可以是頰粘膜、鼻粘膜、食道粘膜、直腸粘膜、陰道粘膜、外陰粘膜、小腸粘膜、腸粘膜、胃粘膜、膀胱粘膜、尿道粘膜或眼組織粘膜，并優(yōu)選頰組織粘膜，例如口腔的內(nèi)表面。在另一方面，提供使用提供的裝置將藥劑施用至哺乳動物的粘膜細(xì)胞的方法。所述方法包括使所述顯微針板接觸所述粘膜；將所述藥物組成遞送至所述粘膜；以及應(yīng)用電穿孔，從而通過所述顯微針板由所述能量源產(chǎn)生電脈沖至所述粘膜。在體內(nèi)電穿孔的過程中，電脈沖直接應(yīng)用至組織以增強(qiáng)細(xì)胞外分子的攝取。利用非常高的伏特/厘米的電場強(qiáng)度來進(jìn)行存在類型的體內(nèi)EP，由于神經(jīng)密度校對，因此在粘膜組織中使用這樣大的電場強(qiáng)度對于患者將是痛苦的。使用當(dāng)前0Μ-Ι/ΕΡ裝置，它們可以裝備以遞送非常低場強(qiáng)的EP，例如使用在皮內(nèi)(ID)注射位點處應(yīng)用的低能量的電脈沖，這在2010年4月16日早期提交的共同擁有的PCT申請-名稱“CONTACTLESSELECTROPERMEABILIZATION ELECTRODE AND METHOD”，申請?zhí)?PCT/US10/31431 中有所描述，其通過引用的方式全部并入本文。這種皮內(nèi)EP可以使用非常低的電壓來進(jìn)行，并且對于患者具有最小的痛苦。在早期試驗中，在粘膜組織上，這些更低EP場強(qiáng)已經(jīng)顯示在具有類似結(jié)果(數(shù)據(jù)未示出)的情況下轉(zhuǎn)染到粘膜組織中。EP參數(shù)可以包括下列范圍的電壓0. I伏特(V)至30V，0. IV 至 20V，0. IV 至 15V,0. IV 至 10V,0. IV 至 9V,0. IV 至 8V,0. IV 至 7V,0. IV 至 6V,
O.IV 至 5V, O. IV 至 4V, O. IV 至 3V, O. IV 至 2V, O. IV 至 IV, 2V 至 30V, 2V 至 20V, 2V 至 15V,2V 至 10V, 2V 至 9V, 2V 至 8V, 2V 至 7V, 2V 至 6V, 2V 至 5V, 2V 至 4V, 2V 至 3V, 4V 至 30V, 4V至 20V，4V 至 15V，4V 至 10V，4V 至 9V，4V 至 8V，4V 至 7V，4V 至 6V，4V 至 5V，6V 至 30V，6V至 20V，6V 至 15V，6V 至 10V，6V 至 9V，6V 至 8V，8V 至 30V，8V 至 20V，8V 至 15V，8V 至 10V，8V至9V，10V至30V，10V至20V，或IOV至15V ;以及下列范圍的電流2mA至100mA，3mA至100mA, 4mA 至 100mA, 5mA 至 100mA, 6mA 至 100mA. 7mA 至 100mA, 8mA 至 100mA, 9mA 至 100mA，IOmA 至 100mA, 20mA 至 100mA, 30mA 至 100mA, 40mA 至 100mA, 60mA 至 100mA, 80mA 至 100mA，2mA 至 80mA, 3mA 至 80mA, 4mA 至 80mA, 5mA 至 80mA, 6mA 至 80mA, 7mA 至 80mA, 8mA 至 80mA,9mA 至 80mA, IOmA 至 80mA, 20mA 至 80mA, 30mA 至 80mA, 40mA 至 80mA, 60mA 至 80mA, 2mA 至60mA, 3mA 至 60mA, 4mA 至 60mA, 5mA 至 60mA, 6mA 至 60mA, 7mA 至 60mA, 8mA 至 60mA, 9mA 至60mA, IOmA 至 60mA, 20mA 至 60mA, 30mA 至 60mA, 40mA 至 60mA, 2mA 至 40mA, 3mA 至 40mA, 4mA至 40mA, 5mA 至 40mA, 6mA 至 40mA, 7mA 至 40mA, 8mA 至 40mA, 9mA 至 40mA, IOmA 至 40mA, 20mA至 40mA, 30mA 至 40mA, 2mA 至 30mA, 3mA 至 30mA, 4mA 至 30mA, 5mA 至 30mA, 6mA 至 30mA, 7mA至 30mA, 8mA 至 30mA, 9mA 至 30mA, IOmA 至 30mA, 20mA 至 30mA, 2mA 至 20mA, 3mA 至 20mA, 4mA至 20mA, 5mA 至 20mA, 6mA 至 20mA, 7mA 至 20mA, 8mA 至 20mA, 9mA 至 20mA, IOmA 至 20mA, 2mA至 10mA, 3mA 至 10mA, 4mA 至 10mA, 5mA 至 10mA, 6mA 至 10mA, 7mA 至 10mA, 8mA 至 10mA, 9mA至 10mA, 2mA 至 9mA, 3mA 至 9mA, 4mA 至 9mA, 5mA 至 9mA, 6mA 至 9mA. 7mA 至 9mA. 8mA 至 9mA,2mA 至 8mA, 3mA 至 8mA, 4mA 至 8mA, 5mA 至 8mA, 6mA 至 8mA. 7mA 至 8mA, 2mA 至 7mA, 3mA 至7mA, 4mA 至 7mA, 5mA 至 7mA, 6mA 至 7mA. 2mA 至 6mA, 3mA 至 6mA, 4mA 至 6mA, 5mA 至 6mA, 2mA至5mA, 3mA至5mA, 4mA至5mA, 2mA至4mA,或3mA至4mA。在一些實施方案中，使用的EP參數(shù)范圍為最高端的30伏特和IOOmA至2伏特和2mA。對于EP遞送，期望的組織接受兩次
(2)脈沖，每次100ms，脈沖之間使用IOOms延遲。 0Μ-Ι/ΕΡ裝置具有固定至主殼體(零件#1)頭部的主電極顯微針板(零件#3&圖15)。電壓返回電極板和臂(零件#5和#6)設(shè)置在口腔的附近和外部。主殼體(零件#1)可以安裝至標(biāo)準(zhǔn)1-ml lure-鎖注射器(零件#8)。在使用中，顯微針板陣列(零件#3&圖15)放置在和頰粘膜內(nèi)層(面頰的內(nèi)表面)緊密接觸的口腔的內(nèi)部上。電壓返回電極(零件#5)將接觸面頰的外部相鄰表面。顯微針板陣列(零件#3&圖15)、主殼體(零件#1)和所附注射器(零件#8)形成注射/電穿孔裝置。較大顯微針陣列的設(shè)計允許在較大區(qū)域內(nèi)注射DNA疫苗。顯微針的較小尺寸和較短長度使DNA疫苗放置控制的特異性深度。活塞(零件#2)和其密封ο-環(huán)(零件#9)形成通常歧管區(qū)域和驅(qū)動器，它們將甚至確保通過顯微針板(零件#3&圖15)分布DNA疫苗。主電極(零件#3&圖15)的要求是它們具有擁有特異性長度和直徑的多個顯微針。電極也必須由導(dǎo)電材料(例如鍍金/銀的黃銅或銅、不銹鋼和/或鈦)制成。DNA疫苗必須放置在粘膜的上部大部分層。主電極(零件#3&圖15)可以通過多種生產(chǎn)工藝來制造例如化學(xué)蝕刻、放電機(jī)械加工(EDM)和在犧牲圖案上的化學(xué)鍍鎳。主殼體和支撐部件可以由注塑材料(例如ABS、聚碳酸酯和聚烯烴)制成。圖4-8示出支持下列情況的結(jié)果優(yōu)化的SIV DNA構(gòu)建體+EP引誘的IFN_g ( 12，000SFC/106)和增殖性CD8+T細(xì)胞應(yīng)答( 20% )(和CTACK無差別)。在第四次免疫后這些應(yīng)答最高。通過下列方式加入優(yōu)化的CTACK DNA沒有在外周中進(jìn)一步增強(qiáng)誘導(dǎo)的應(yīng)答-IFN-g ELISpot-CFSE 增殖-PBMC細(xì)胞因子分泌-血清中的IgA加入優(yōu)化的CTACK DNA改變粘膜中應(yīng)答的顯型，這通過下列方式來測量-BAL細(xì)胞因子分泌-更多多功能⑶8+T細(xì)胞
-更高頻率地應(yīng)答⑶4+和⑶8+T細(xì)胞-糞便&BAL樣品中的IgA
實施例在下面實施例中進(jìn)一步示出本發(fā)明。應(yīng)該理解，盡管表明本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，但是這些實施例僅僅通過示意性方式給出。從上面討論和這些實施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確認(rèn)該發(fā)明的基本的特性，并且在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可以對本發(fā)明進(jìn)行多種改變和修改，以使其適應(yīng)多種用途和條件。因此，除了本文示出和描述的那些，從上面的描述本領(lǐng)域技術(shù)人員將明白本發(fā)明的多種修改。這種修改也旨在落入所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。進(jìn)行試驗以評價通過EP增強(qiáng)的粘膜(口部)途徑使用流感HA抗原免疫的動物的 血液、鼻分泌物、唾液和大便中的IgA滴度。在唾液中觀察到明顯的IgA滴度表明在局部粘膜區(qū)域中成功地提高粘膜免疫應(yīng)答。在大便樣品中檢測到IgA應(yīng)答表明在較遠(yuǎn)位點提高粘膜應(yīng)答。在血清中檢測到IgA滴度表明也提高系統(tǒng)應(yīng)答。H5IgA ELISA在三次粘膜EP-增強(qiáng)的免疫后,在使用4x4裝置(Inovio Pharmaceuticals, Inc.,Blue Bell,Pennsylvania)電穿孔的4只動物的3只和使用卡鉗電穿孔裝置電穿孔的4只動物的4只的唾液中觀察到陽性H5特異性IgA滴度。在僅注射組中只有一只動物是陽性的。參見圖18a-18c。在使用4x4裝置進(jìn)行三次免疫后，兩只動物在它們的血液樣品中具有靶向特異性陽性IgA滴度。來自4x4裝置和卡鉗組的一只動物在它們的大便中具有靶向特異性IgA應(yīng)答。沒有陰性對照或僅注射組動物具有陽性IgA大便或血液樣品。
權(quán)利要求
1.一種電穿孔哺乳動物的粘膜細(xì)胞的裝置，其中所述裝置包括 電極顯微針板， 反電極板， 與所述顯微針板和反電極板物理相連的主殼體，其中所述主殼體流體相連注射器，所述注射器能夠儲存用于遞送的藥劑，以及 能量源，其電相連所述顯微針板，并且能夠產(chǎn)生電勢和通過所述顯微針板將所述電勢遞送至所述細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的裝置，其中所述顯微針板的顯微針由包含鍍金和銀的黃銅、鍍金和銀的銅、不銹鋼或鈦的導(dǎo)電材料制成。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2中任一項所述的裝置，還包括 在所述主殼體和所述顯微針板之間物理相連的活塞， 其中所述活塞是可驅(qū)動的，并且能夠通過所述顯微針板弓丨起甚至所述藥劑的分布。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的裝置，其中所述能量源能夠以至少一種電能脈沖通過所述顯微針板遞送至所述粘膜細(xì)胞，所述電能脈沖具有IV至30V、2mA至IOOmA或ImS至250mS的特性。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項所述的裝置，其中所述粘膜包括頰粘膜、鼻粘膜、食道粘膜、直腸粘膜、陰道粘膜、外陰粘膜、小腸粘膜、腸粘膜、胃粘膜、膀胱粘膜、尿道粘膜或眼組織粘膜。
6.一種使用根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項所述的裝置將藥劑施用至哺乳動物的粘膜細(xì)胞的方法，所述方法包括 使所述顯微針板接觸所述粘膜； 將所述藥物組成遞送至所述粘膜； 應(yīng)用電穿孔，從而通過所述顯微針板由所述能量源產(chǎn)生電脈沖至所述粘膜。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述接觸步驟包括使所述顯微針板接觸所述哺乳動物的口腔的內(nèi)表面。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7中任一項所述的方法，其中所述應(yīng)用步驟包括應(yīng)用電穿孔，從而引起具有IV至30V、2mA至IOOmA或ImS至250mS的特性的電脈沖。
全文摘要
本發(fā)明涉及電穿孔(EP)裝置，其能夠優(yōu)選以可容忍的方式產(chǎn)生電穿孔，從而在粘膜層處引起電場。另外，其包括使用口部EP裝置連同編碼免疫原序列的基因構(gòu)造體來產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答(細(xì)胞和/或體液)。
文檔編號A61N1/30GK102892461SQ201180021234
公開日2013年1月23日 申請日期2011年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月28日
發(fā)明者S·V·克默雷爾, J·麥科伊, K·布羅德里克 申請人:因諾維奧制藥公司