一種利用表面展示谷氨酸脫氫酶的全細胞測定l-谷氨酸含量的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術和分析技術領域，具體地說是一種利用表面展示谷氨酸脫氫 酶的全細胞測定L-谷氨酸含量的方法。
【背景技術】
[0002] L-谷氨酸是一種重要的氨基酸，在生物體的新陳代謝中占有重要地位，參與動物、 植物和微生物中的許多重要化學反應。L-谷氨酸是蛋白質(zhì)的主要構(gòu)成成分。L-谷氨酸鹽在 自然界普遍存在，多種食品以及人體內(nèi)都含有L-谷氨酸鹽，L-谷氨酸主要用于生產(chǎn)味精、 香料，以及用作代鹽劑、營養(yǎng)增補劑和生化試劑等。L-谷氨酸本身可用作藥物，參與腦內(nèi)蛋 白質(zhì)和糖的代謝，促進氧化過程，該品在體內(nèi)與氨結(jié)合成無毒的谷酰胺，使血氨下降，減輕 肝昏迷癥狀。
[0003] 目前，定量檢測L-谷氨酸的常用方法有瓦式呼吸儀和谷氨酸自動分析儀法，雖然 該方法精度比較高，但其設備投入大、技術要求高。高效液相色譜檢測法測定谷氨酸的線性 范圍為10-200μΜ，熒光檢測谷氨酸的線性范圍和檢測限分別為4-20μΜ和3μΜ，但是這 些方法耗時長，設備費用高，而且檢測靈敏度和選擇性都不理想。近年來開發(fā)出多種檢測 L-谷氨酸的生物傳感器，如氧電極上固定有谷氨酸氧化酶的傳感器檢測谷氨酸的線性范圍 和檢測限分別為68-1271 μ Μ和68 μ Μ，修飾聚鄰苯二胺/谷氨酸脫氫酶的電化學傳感器檢 測谷氨酸的線性范圍和檢測限分別為5-78和3. 8 μ Μ，該方法的缺點是需要花費大量的時 間、人力和財力進行酶的純化和固定。因此，建立一種快速、靈敏、特異的L-谷氨酸檢測方 法勢在必行。
[0004] 細菌表面展示是指將外源蛋白或多肽與細菌表面錨定蛋白融合或嵌合并活性表 達于細菌表面。此技術解決了上述酶提取和純化過程復雜以及固定化穩(wěn)定性低等難題。至 今為止已開發(fā)出多種不同類型的錨定蛋白，例如：冰核蛋白和α-凝集素等，該技術在微 生物學、分子生物學和疫苗學等多個領域的基礎和應用研究中得到了廣泛應用。冰核蛋白 (ice-nucleation protein, ΙΝΡ))是丁香假單胞菌等菌株的外膜蛋白，可加速純水的冰晶 形成。INP由C端結(jié)構(gòu)域、N端結(jié)構(gòu)域和中間重復單元組成，其N端通過糖基磷脂酰肌醇而 錨定在細菌表面，此性質(zhì)有利于大分子蛋白的表面呈現(xiàn)。
[0005] 谷氨酸脫氫酶（Gldh) (EC 1.4. 1.2-1. 4. 1.4)在生物體內(nèi)廣泛存在。L-谷氨酸 在Gldh的催化下，借助于輔酶煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP+)，被氧化成α -酮戊 二酸，輔酶NADP+則被還原為還原態(tài)的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH)。目前國內(nèi) 外對于Gldh在微生物表面展示的研究還未見報道。在酶的來源方面，研究人員從嗜熱菌 Thermococcus waiotapuensis中分離得到一種耐高溫的Gldh,以L-谷氨酸為底物進行酶 促反應時最適溫度是70°C。另外，與已報道的Gldh相比，該酶對L-谷氨酸的特異性高，即 當以L-谷氨酸以外的其他類似物作為底物時，Gldh不發(fā)揮催化活性。因此，在生物催化和 生物傳感領域，該酶將具有廣闊的應用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明目的在于提供一種利用表面展示有谷氨酸脫氫酶的全細胞測定L-谷氨酸 含量的方法。
[0007] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案為：
[0008] -種利用表面展示有谷氨酸脫氫酶的全細胞測定L-谷氨酸含量的方法，通過構(gòu) 建谷氨酸脫氫酶細菌表面展示系統(tǒng)，并利用紫外分光光度計檢測信號，從而計算得到L-谷 氨酸的含量。
[0009] 具體的是，構(gòu)建基于冰核蛋白的谷氨酸脫氫酶細菌表面展示全細胞；再向含全細 胞和輔酶NADP +的Tris-HCl (pH 8. 0)緩沖液中加入待測樣品，酶促反應后測定340nm處的 光吸收值，根據(jù)標準曲線得出待測樣品中L-谷氨酸的含量。
[0010] 所述表面展示系統(tǒng)為編碼目標蛋白谷氨酸脫氫酶的基因序列gldh以及負責跨膜 定位和轉(zhuǎn)運的冰核蛋白N端結(jié)構(gòu)域的基因序列inaPb-N ;
[0011] 其中以菌株 Thermococcus waiotapuensis 基因組 DNA 為模板，Gldh-F/Gldh-R 為 引物，進行PCR擴增，得到編碼谷氨酸脫氫酶的基因片段gldh ;
[0012] 引物是 Gldh-F: 5' -CGCGGATCCATGGTTGAACTCGACCCGTTTGAAATGG-3' 和 Gldh-R: 5' -CCCAAGCTTTCAGTGCTTGACCCATCCGCGG-3 '。
[0013] 所述編碼目標蛋白谷氨酸脫氫酶的基因序列gldh以及負責跨膜定位和轉(zhuǎn)運的冰 核蛋白N端結(jié)構(gòu)域的基因序列inaPb-N融合，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達菌株，在誘導劑的存在下表 達出融合蛋白，得到谷氨酸脫氫酶細菌表面展示全細胞。
[0014] 檢測原理是L-谷氨酸在菌體表面的谷氨酸脫氫酶的催化下，借助于輔酶煙酰胺 腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP +)被氧化成α-酮戊二酸，輔酶NADP+則被還原為還原態(tài)的煙酰 胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH)。NADPH在340nm處有特征吸收峰，因此可以根據(jù)340nm處 的吸光值來求得L-谷氨酸的含量。
[0015] 本發(fā)明的效果是：
[0016] 1.本發(fā)明利用冰核蛋白表面展示系統(tǒng)將谷氨酸脫氫酶穩(wěn)定地展示在細菌的表面， 從而解決了胞內(nèi)酶提取過程復雜和穩(wěn)定性低的難題，本發(fā)明細菌表面展示的谷氨酸脫氫酶 在4°C條件下放置一個月之后，全細胞能保持100%的活性，進而為下一步的測定提供最優(yōu) 的材料。
[0017] 2.本發(fā)明細菌表面展示的谷氨酸脫氫酶特異性好，以其他氨基酸（如：天冬氨酸、 組氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、賴氨酸、酪氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、甲硫氨酸、纈氨酸、亮氨酸和甘 氨酸）為底物時，表面展示有谷氨酸脫氫酶的全細胞無活性，即其他氨基酸對L-谷氨酸的 測定沒有干擾。
[0018] 3.本發(fā)明測定L-谷氨酸含量的方法靈敏度高，具有較寬的檢測范圍（4-400 μ M) 和較低的檢測限（2 μ Μ)。
[0019] 4.通過本發(fā)明提供的細菌表面展示系統(tǒng)建立了 L-谷氨酸快速檢測的方法。此 方法靈敏度高、特異性好、操作簡單、成本低，可用于鮮味劑、食品調(diào)味劑等食品行業(yè)，營養(yǎng) 藥物、表面活性劑等日用品和醫(yī)藥行業(yè)，以及發(fā)酵、生物轉(zhuǎn)化、生物能源等生物過程領域中 L-谷氨酸的監(jiān)測。
【附圖說明】
[0020] 圖1為本發(fā)明實施例提供的編碼谷氨酸脫氫酶的基因的PCR產(chǎn)物電泳圖。其中， A是DL5000分子量標準；B是基因 gldh的PCR產(chǎn)物膠回收條帶。
[0021] 圖2為本發(fā)明實施例提供的谷氨酸脫氫酶細菌表面展示系統(tǒng)的載體構(gòu)建流程圖。
[0022] 圖3為本發(fā)明實施例提供的紫外分光光度計檢測L-谷氨酸的標準曲線圖。
【具體實施方式】
[0023] 本發(fā)明目的、功能及優(yōu)點將結(jié)合實施例，參照附圖做進一步說明。
[0024] 本發(fā)明構(gòu)建谷氨酸脫氫酶細菌表面展示系統(tǒng)，利用紫外分光光度計檢測信號，從 而得到L-谷氨酸的含量，進而用于L-谷氨酸的快速檢測，具體為：
[0025] 1.構(gòu)建基于冰核蛋白的谷氨酸脫氫酶細菌表面展示全細胞；
[0026] 2.制作L-谷氨酸檢測的標準曲線；
[0027] 3.測定實際樣品中的L-谷氨酸，根據(jù)標準曲線計算得出L-谷氨酸的含量。
[0028] 實施例1
[0029] 細胞表面展示谷氨酸脫氫酶菌體的獲得：
[0030] 1.重組表達載體的構(gòu)建。
[0031] 編碼Gldh的基因最初來自于T. waiotapuensis的基因組。gldh基因通過PCR反 應擴增得到，反應程序為：94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸2min，35個循環(huán)。PCR反 應的正向引物P1和反向引物P2分別是 ：
[0032] P1 為 5, -CGCGGATCCATGGTTGAACTCGACCCGTTTGAAATGG-3'
[0033] P2 為 5, -CCCAAGCTTTCAGTGCTTGACCCATCCGCGG-3,，
[0034] 其中，BamHI和Hindlll作為限制性內(nèi)切酶的酶切位點。PCR反應體系為：ddH20 34. 7 μ L，模板 DNA lyL，10XPCR Buffer(Mg2+Free)5yL，MgCl2(25mmol/L)3yL，弓 | 物 PI(20pmol/μ L)1 μ L,引物 P2(20pmol/μ L)1 μ L, dNTPMixture (各 2. 5mmol/ L) 4 μ L，TaKaRa Taq? (5U/ μ L) 0. 3 μ L。將PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后純化回收（參 見圖1)。PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)入到pMD18-T載體中得到的重組載體被命名為pMDGldh，TA-克隆后 的質(zhì)粒由BamHI和Hindlll限制性內(nèi)切酶在相應的位點進行酶切。然后將其導入到具有相 同酶切位點的pTInaPb-N載體（該載體由本實驗室利用pET-28a(+)和IN