葡萄糖特異性改善的可溶性吡咯喹啉醌依賴性葡萄糖脫氫酶突變體、聚核苷酸及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及可溶性化咯哇嘟釀依賴性葡萄糖脫氨酶（PQQ-sGDH)突變體，具體而 言就是W醋酸巧不動桿菌野生型PQQ-sGMl編碼基因或其編碼蛋白同源性在90%W上的 DNA作為模板，利用PCR擴增進行定點突變，獲得一系列具有良好的葡萄糖底物特異性和/ 或熱穩(wěn)定性且對麥芽糖的交叉反應性顯著降低的PQQ-sGMl突變體。同時還提供編碼所述 PQQ-sGDH突變體的聚核巧酸、包含所述聚核巧酸的表達載體、包含所述表達載體的轉化細 胞W及利用所述PQQ-sGDH突變體檢測樣品中葡萄的方法、試劑和裝置。
【背景技術】
[0002] 血糖濃度是糖尿病的一個非常重要的標志物。血糖濃度的測定在糖尿病的臨床診 斷和管理中極為重要。血糖的檢測通常設及酶催化下的葡萄糖氧化。根據(jù)酶的類型不同， 可分為葡萄糖氧化酶（GOD)和葡萄糖脫氨酶（GDH)。在利用試紙條和血糖儀檢測血糖時， GOD雖然具有較高的特異性，也不受到葡萄糖之外的糖類物質的干擾，但是極易受到血液中 氧氣的干擾而導致測定結果不準確。而GDH則不受到血液中氧氣的干擾，因而得到廣泛應 用。
[0003] 對GDH而言，根據(jù)其輔酶的不同，它大致可分為化咯哇嘟釀依賴性葡萄糖脫氨酶 (PQQ-GDH)，黃素腺嚷嶺二核巧酸依賴性葡萄糖脫氨酶（FAD-GDH)和煙酷胺腺嚷嶺二核巧 酸依賴性葡萄糖脫氨酶（NAD-GDH)。作為GDH中的一種，PQQ-GDH使用化咯哇嘟釀（PQ曲作 為輔酶。
[0004]PQQ-GDH的EC編號早前為EC1. 1. 99. 17,后被更改為EC1. 1. 5. 2。目前科學家 們已在細菌中發(fā)現(xiàn)兩類PQQ-GDH(EC1. 1.5. 2):第一種為膜結合的PQQ-GDH(PQQ-mGDH);第 二種是可溶性的PQQ-GDH(PQQ-sGDH)。運兩種PQQ-GDH的生化性質差異較大。PQQ-sGDH 只在不動桿菌屬細菌的周質空間（periplasmicspace)中發(fā)現(xiàn)，如醋酸巧不動桿菌 (Acinetobactercalcoacelicus)和鮑曼氏不動桿菌（A.baumannii)，[^下^醋酸巧不動桿 菌為例進行說明。
[0005] 醋酸巧不動桿菌同時含有上述兩種不同的PQQ-GDH，其中，PQQ-mGDH只在細菌細 胞內(nèi)是有活性的，而PQQ-sGDH只在細菌細胞外表現(xiàn)出活性。此外，它們的序列并不存在顯 著的同源性。PQQ-sGDH是由兩個相同的亞基組成的，每個亞基含有3個巧離子，每個亞基 的分子量為50kD，每個亞基的N端是一個由24個氨基酸殘基組成的信號膚，在分泌到周 質空間中后被切除。PQQ-sGDH可W催化多種單糖和二糖氧化成相應的酬，酬再進一步水解 成醒糖酸，并且，該酶可W將氧化反應時產(chǎn)生的電子提供給吩嗦硫酸甲醋（PM巧、2, 6-二氯 說酪值CI巧、沃斯特藍（Wurster'Sblue)W及短鏈泛釀分子如泛釀Q1和泛釀Q2W及某 些人工電子受體，如N-甲基二甲基苯基化挫酬硫酸甲醋（N-methylphenazoniummeth^ sul化te)，W及導電聚合物等。相比于PQQ-mGDH，PQQ-sGDH具有良好的水溶性和較廣的電 子受體特異性，因此，它非常適合用于試紙條或血糖儀的葡萄糖測定之中。
[0006] 然而，醋酸巧不動桿菌的野生型PQQ-SGDH也有自身的缺陷，即底物特異性較差： 不僅能與葡萄糖發(fā)生氧化反應，而且也能氧化麥芽糖、半乳糖、乳糖、甘露糖、木糖和核糖等 單糖和二糖分子發(fā)生氧化反應。運種反應性可能會使得一些糖尿病患者在測定自身血糖水 平時獲得錯誤的測量值。特別是當糖尿病患者靜脈注射含麥芽糖或半乳糖或木糖制劑或者 進行基于艾考糊精（icodextrin)的腹腔透析時，利用WPQQ-sGMl作為氧化酶的血糖儀測 定的血糖值會錯誤性地升高，如果運些病人根據(jù)錯誤的血糖值接收治療，可能會造成異常 的低血糖癥、昏迷，甚至死亡。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 針對現(xiàn)有技術的不足之處，本發(fā)明在醋酸巧不動桿菌野生型PQQ-sGDH編碼基因 或與其編碼蛋白的氨基酸序列同源性在90%W上的DNA序列的基礎上，利用定點突變PCR 獲得PQQ-sGDH突變體，所述突變體具有良好的葡萄糖底物特異性和/或熱穩(wěn)定性，對麥芽 糖等糖的交叉反應性顯著下降，將所述突變體用于血液等樣品中的葡萄糖測試時，所測得 的葡萄糖值準確性顯著提高。
[0008] 野生型PQQ-sGDH最先是從醋酸巧不動桿菌菌株LMD79. 41中分離出來，其氨基酸 序列和DNA序列分別在SEQIDNO1和SEQIDNO2中給出。
[0009] 本發(fā)明中諸如"T372C"之類的符號均表示一種替代突變，WT372C為例進行說明， 其意思為372位點上的蘇氨酸燈虹，T)被半脫氨酸（切s，C)取代。再WM52X為例，其意 思為452位點上的天冬酷胺（Asn，腳被除N之外的任何一種氨基酸狂）取代，即X選自丙 氨酸（Ala,A)、精氨酸（Arg，時、天冬氨酸（Asp,D)、半脫氨酸（切S，C)、谷氨酷胺（Gin,Q)、谷 氨酸（Glu，E)、組氨酸化is，H)、異亮氨酸（Ile，I)、甘氨酸（Gly，G)、亮氨酸化eu，L)、賴氨 酸化ys，K)、甲硫氨酸（Met,M)、苯丙氨酸（Phe，F(xiàn))、脯氨酸（Pro,P)、絲氨酸（Ser，S)、蘇氨酸 燈虹，T)、色氨酸燈rp，W)、酪氨酸燈yr，Y)或鄉(xiāng)氨酸（Val，V)中的任何一種氨基酸。
[0010] 本發(fā)明中諸如"T372C+K455R"之類的符號均表示一種組合替代突變，W T372C+K455R為例進行說明，其意思為372位點上的T被C取代和455位點上的K被R取 代，其中"+ "表示"+ "前后的兩種替代突變同時發(fā)生。
[0011] 本發(fā)明中提及的"同源性"，是指來自除醋酸巧不動桿菌之外的微生物的野生 型PQQ-sGDH在氨基酸序列上與沈QIDNO1具有至少90 %的同源性。比如，鮑曼氏 不動桿菌野生型PQQ-sGMl就滿足運個條件，其野生型氨基酸序列已在中國專利申請 CN200610067817. 6中公開。運種同源性可利用ClustalW軟件進行氨基酸序列比對就可得 出。
[0012] 本發(fā)明中的"氨基酸位點編號"是基于醋酸巧不動桿菌的野生型PQQ-sGDH序列 SEQIDNO1計算出的。至于來自于其他微生物（如鮑曼氏不動桿菌）的野生型PQQ-sGDH 的氨基酸位點編號，可通過ClustalW軟件進行氨基酸序列比對找出運兩種細菌的氨基酸 位點編號的對應關系。本發(fā)明基于便于描述的原因，僅僅利用SEQIDNO1進行氨基酸位 點編號。
[0013] 本發(fā)明的目的在于提供一種可溶性化咯哇嘟釀依賴性葡萄糖脫氨酶（PQQ-sGDH) 突變體，所述PQQ-sGDH突變體源自于醋酸巧不動桿菌的野生型PQQ-sGDH氨基酸序列SEQ IDNO1，或者源自于其他微生物的與SEQIDNO1具有至少90%同源性的野生型氨基 酸序列，所述PQQ-sGDH突變體的氨基酸位點編號對應于來自醋酸巧不動桿菌的野生型PQQ-sGDH氨基酸序列SEQIDN01，所述PQQ-sGDH突變體攜帶的突變包括選自W下一組突 變中的一種：（1)T372C; (2)T372N; (3)T372D，且所述PQQ-sGDH還在 99、167、170、192、193、 270、318、365、366、367、372、402、452和455位點中至少一個位點發(fā)生替換突變。
[0014] 進一步地，所述PQQ-sGDH突變體攜帶的突變包括選自W下一組突變中的一種： (1)T372C，且所述PQQ-sGDH還在 99、167、170、192、193、270、318、365、366、367、372、402、 452和455位點中至少一個位點發(fā)生替換突變；（2)T372D，且所述PQQ-sGDH還在99、167、 170、192、193、270、318、365、366、367、372、402、452 和 455 位點中至少兩個位點發(fā)生替換突 變。
[0015] 進一步地，所述PQQ-sGDH突變體攜帶的突變包括選自W下一組突變中的一種： (1)T372C，且所述PQQ-sGDH還在 99、167、170、192、193、270、318、365、366、367、372、402、 452和455位點中至少兩個位點發(fā)生替換突變；（2)T372D+D167X+N452X+M365X;
[0016] (4)T372D+N452X+M365X+S170X+Q270X；
[0017] (5)T372D+N452X巧367X+S170X+Q270X+Q192X;
[0018] 化）T372D+N452X巧366X+S170X+Q270X+G99X+Q192X。
[0019] 進一步地，所述PQQ-sGDH突變體攜帶的突變包括選自W下一組突變中的一種： (DT372C+D167X+N452X+M365X；
[0020] (2)T372C+N452X+M365X+S170X+Q270X；
[0021] (3)T372C+N452X+T366X+S170X+Q270X；
[0022] (4)T372C+N452X巧367X+S170X+Q270X+Q192X;
[0023] 巧）T372D+N452X巧366X+S170X+Q270X+G99X+Q192X+A31拙；
[0024] 化）T372D+N452X巧366X+S170X+Q270X+G99X+Q192X+R402X。
[002引進一步地，所述PQQ-sGDH突變體攜帶的突變包括選自W下一組突變中的一種：
[0026] (1)T372C+D167E+N452P+M365V+Q270H+Q192X;
[0027] (2)T372C+N452X+T366X+S170X+Q270X+Q192X；
[0028] (3)T372C+N452X+T366X+S170X+Q270X+L193X〇
[0029] 進一步地，所述PQQ-sGDH突變體攜帶的突變包括選自W下一組突變中的一種：
[0030] (1)T372C+N452X巧366X+S170X+Q270X+Q192X+G99X;
[0031] (2)T372C+N452X+M365X巧366X+S170X+Q270X+L193X。
[003引進一步地，所述PQQ-sGDH突變體攜帶的突變包括選自W下一組突變中的一種：
[0033] (DT372C+N452X巧366X+S170X+Q270X+G99X+A31拙+Q192X ;
[0034] (2)T372C+N452X巧366X+S170X+Q270X+G99X+R402X+Q192X ;
[0035] (3)T372C+N452X+M365X巧366X+S170X+Q270X+Q192X+L193X。
[0036] 所述PQQ-sGDH突變體攜帶的突變?nèi)舭?9位點，則99位點的G可被除G之外的 任何一種氨基酸狂）取代，其