水解酶法測(cè)定不對(duì)稱二甲基精氨酸及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物酶法測(cè)定不對(duì)稱二甲基精氨酸（NG，NGdimethyl-L-arginine， asymmetricdimethylarginine，ADMA)及試劑盒開(kāi)發(fā)。特別地，本發(fā)明涉及利用二甲基精氨 酸二甲氨基水解酶、鳥氨酸甲氨酰轉(zhuǎn)移酶、氨甲酰激酶將ADMA轉(zhuǎn)化為等物質(zhì)量的氨，進(jìn)而 通過(guò)二乙酰一肟-氨基硫脲比色法或谷氨酸脫氫酶速率法測(cè)定氨的含量，推知血清中ADMA 的濃度的方法和試劑盒。該發(fā)明為簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確，靈敏監(jiān)測(cè)不對(duì)稱二甲基精氨酸提供了重要依 據(jù)。
【背景技術(shù)】
[0002] 不對(duì)稱二甲基精氨酸（aNG，NGdimethyl-L-arginine，asymmetric dimethylarginine，，ADMA)，也叫非對(duì)稱二甲基精氨酸，分子式見(jiàn)圖1，由 Vallance(VallanceP，LeoneA，CalverA，CollierJ，MoncadaS.Lancet339,572-575, 1992) 1992年首次在血漿和尿液中檢測(cè)出ADMA。ADMA由含有精氨酸殘基的蛋白質(zhì)在蛋白 質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶（proteinargininemethyltransferases，PRMT)的作用下甲基化，甲 基化的蛋白水解后即可釋放出ADMA。ADMA能競(jìng)爭(zhēng)性抑制一氧化氮合酶（N0S)使一氧化氮 (N0)生成減少，在體內(nèi)起內(nèi)源性N0合成抑制劑的作用。一氧化氮（N0)是血管衍生中的活 性物質(zhì)，具有舒張血管，維持血管張力恒定和調(diào)節(jié)血壓的作用。體內(nèi)多種因素可引起ADMA 水平升高，ADMA的蓄積，導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙。已有研究表明，血漿ADMA水平在心血管 疾病出現(xiàn)臨床表現(xiàn)之前就已經(jīng)開(kāi)始升高。因此，ADMA作為一種前瞻性，獨(dú)立的心血管病診 斷指標(biāo)具有重大意義。ADMA水平的升高不僅能作為心血管疾病的先兆，還能作為動(dòng)脈粥樣 硬化，心衰，高血壓，糖尿病，腎衰肝臟衰竭，勃起功能障礙等疾病的一個(gè)重要危險(xiǎn)因子。
[0003] 目前，ADMA作為一種新型的內(nèi)皮功能不全和心血管疾病標(biāo)志物，引起了國(guó)際和國(guó) 內(nèi)的廣泛重視。
[0004] 體內(nèi)90 %ADMA的通過(guò)二甲基精酸二甲胺水解酶（dimethylarginine dimethylaminohydrolase，DDAH)的分解，分解的產(chǎn)物為胍氨酸和二甲胺或單甲胺（Ogawa， T,andKimoto,M.andSasaoka,K.J. ,BiolChem264 :10205-9,1989 ；MacAllister, R.J.andParry,H.andKimoto,M.andOgawa，T.，etal.BrJPharmacol119 :1533-40， 1996)〇
[0005] DDAH是一種存在于細(xì)胞質(zhì)的胞內(nèi)酶。本發(fā)明的生物酶法也借鑒了體內(nèi)ADMA的清 除模式，即ADMA在DDAH的水解下，分解為瓜氨酸和二甲胺，作為本試劑盒的第一步反應(yīng)。
[0006]ADMA作為如此重要的一個(gè)心血管疾病的指示因子，盡快開(kāi)發(fā)出關(guān)于ADMA的診斷 試劑應(yīng)用于臨床，將造福整個(gè)社會(huì)。測(cè)定生物樣品中ADMA濃度的方法，主要有以下幾種， 高效液相色譜法，液質(zhì)聯(lián)用法，酶聯(lián)免疫法、化學(xué)發(fā)光法、膠乳增強(qiáng)法以及酶法。
[0007] 相對(duì)來(lái)說(shuō)，高效液相色譜法，液質(zhì)聯(lián)用法由于其操作復(fù)雜，儀器要求高，耗資耗時(shí) 耗力不適合臨床診斷使用。
[0008]德國(guó)DLDDiagnostikaGmbH公司（DLDDiagnostikaGmbH，Germany)米用競(jìng)爭(zhēng) 的酶聯(lián)免疫法測(cè)定生物樣品中的ADMA，已經(jīng)將該試劑盒應(yīng)用到臨床。但是，該方法主要的 技術(shù)瓶頸在于ADMA是一個(gè)單個(gè)氨基酸，目標(biāo)分子量太小，不能構(gòu)成一個(gè)抗原表位，也決定 了通過(guò)常規(guī)的抗原抗體反應(yīng)不能將其檢測(cè)出來(lái)，必須對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，即乙?；那疤?理才能通過(guò)酶聯(lián)免疫法檢測(cè)出來(lái)，操作步驟復(fù)雜，不利于儀器自動(dòng)化和標(biāo)準(zhǔn)化。另有專利 US20090053741A和CN1656123A(W02003102031-A)并非利用常規(guī)免疫結(jié)合反應(yīng)，而是利用 一氧化氮合酶法的多肽片段和突變的DDAH酶達(dá)到特異性結(jié)合的目的，以上均是基于抗原 和抗體的免疫學(xué)反應(yīng)而建立的檢測(cè)方法，目前為止并未有相應(yīng)的產(chǎn)品問(wèn)世。
[0009] 化學(xué)發(fā)光和膠乳增強(qiáng)法依據(jù)的基本原理與酶聯(lián)免疫法相同，也存在同樣的技術(shù)瓶 頸。最近，CN102328868A公布了一種膠乳增強(qiáng)免疫比濁法檢測(cè)不對(duì)稱二甲基精氨酸含量試 劑盒。該方法通過(guò)將抗人ADMA單克隆抗體與交聯(lián)有ADMA-人血清白蛋白復(fù)合體的膠乳顆粒 懸浮液，和樣品中的待檢ADMA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，通過(guò)濁度的下降程度來(lái)檢測(cè)樣品中ADMA的含量。 [0010] 酶法是針對(duì)底物的高效、特異、專一的反應(yīng)，重復(fù)性好，敏感，易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化 檢測(cè)。已有的ADMA酶法（專利W0200046395A、W02006030620A1 (JP2006081481A)和CN102154444A)均采用了DDAH將ADMA分解為L(zhǎng)-瓜氨酸和二甲胺。產(chǎn)物瓜氨酸和ATP、天 冬氨酸在精氨酸琥珀酸合成酶作用下，生產(chǎn)AMP，AMP在AMP脫氨酶作用下生產(chǎn)頂P和氨， 產(chǎn)物氨在脫氨基輔酶再通過(guò)輔酶合成酶的作用生產(chǎn)氧化型輔酶，通過(guò)檢測(cè)輔酶濃度從而得 出ADMA的濃度。以上方法均是基于精氨酸琥珀酸合成酶催化瓜氨酸生成AMP或者二甲胺 在二甲胺單加氧酶作用下的輔酶法測(cè)定。后續(xù)反應(yīng)都在3步或以上，所需酶的種類也在3 種以上，如此多的反應(yīng)過(guò)程增加了不確定性和，不容易實(shí)現(xiàn)儀器的自動(dòng)化和標(biāo)準(zhǔn)化。國(guó)內(nèi)專 利CN102243227A采用DDAH將ADMA分解為L(zhǎng)-瓜氨酸和二甲胺。產(chǎn)物瓜氨酸在瓜氨酸水解 酶的作用下再進(jìn)一步分解來(lái)測(cè)定，關(guān)鍵的是瓜氨酸水解酶來(lái)源途徑不明，并不容易獲得。所 以，目前仍然沒(méi)有關(guān)于ADMA酶法檢測(cè)的成熟試劑盒問(wèn)世。因此開(kāi)發(fā)一種簡(jiǎn)便、快速、靈敏的 酶法診斷試劑盒勢(shì)在必行。
[0011] 本發(fā)明采用的酶法特異性強(qiáng)，靈敏度高，重復(fù)性好。采用三步酶法反應(yīng)，簡(jiǎn)便，易實(shí) 現(xiàn)儀器自動(dòng)化。經(jīng)過(guò)實(shí)踐證明，本發(fā)明中涉及的方法及試劑盒具有很好的研究?jī)r(jià)值和臨床 應(yīng)用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 本發(fā)明的目的在于提供一種簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的酶法測(cè)定ADMA的方法。通過(guò)三個(gè)反應(yīng)過(guò) 程得出ADMA的濃度。
[0013] 根據(jù)這一發(fā)明目的的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中樣品經(jīng)過(guò)三步反應(yīng)，三種反應(yīng)分別 為：反應(yīng)體系一為二甲基精氨酸二甲氨基水解酶最適反應(yīng)體系，作用于ADMA生成二甲胺 和L-瓜氨酸。反應(yīng)體系二為包含鳥氨酸甲氨酰轉(zhuǎn)移酶（ornithinetranscarbamoylase， EC2. 1. 3. 3)和氨甲酰激酶（carbamatekinase，EC2. 7. 2. 2)的最適反應(yīng)體系，作用于瓜氨酸 生成L-鳥氨酸、氨和二氧化碳。反應(yīng)體系三為包含水楊酸、亞硝基鐵氰化鈉和次氯酸鈉的 最適反應(yīng)體系，作用于氨生成藍(lán)綠色的靛酚藍(lán)，通過(guò)著色深淺，比色定量氨?？蛇x的，反應(yīng)體 系三也可為包含底物γ-酮戊二酸、NADPH和谷氨酸脫氫酶的最適反應(yīng)體系。通過(guò)自動(dòng)分 析儀監(jiān)測(cè)NADPH的下降速率，從而確定氨氨含量。
[0014] 根據(jù)這一發(fā)明目的的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中二甲基精氨酸二甲氨基水解酶、鳥 氨酸甲氨酰轉(zhuǎn)移酶和氨甲酰激酶用量?jī)?yōu)選0.I_500ku/L;水楊酸溶液濃度優(yōu)選0. 2-5% ;亞 硝基鐵氰化鈉溶液濃度優(yōu)選〇. 1-10%;次氯酸鈉溶液濃度優(yōu)選〇. 01-lmol/L;γ-酮戊二酸 優(yōu)選 0. 01-200mM;NADPH優(yōu)選 0. 01-200mM;谷氨酸脫氫酶優(yōu)選 0. 01-500mM.。
[0015] 根據(jù)這一發(fā)明目的的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中測(cè)定氨濃度時(shí)采用二乙酰一肟-氨 基硫脲比色法或谷氨酸脫氫酶速率法測(cè)定氨的含量。優(yōu)選地，實(shí)驗(yàn)室研究選用二乙酰一 肟-氨基硫脲比色法測(cè)定氨的含量，該方法穩(wěn)定，對(duì)試驗(yàn)設(shè)備要求不高。最終測(cè)定是通過(guò)波 長(zhǎng)為697. 5nm的光吸收值根據(jù)已經(jīng)做好的標(biāo)準(zhǔn)曲線確定樣品讀數(shù)中的氨含量值。優(yōu)選地， 臨床應(yīng)用選用谷氨酸脫氫酶速率法測(cè)定氨的含量，該方法便于自動(dòng)化，需要專門的生化分 析儀配合。三種生化反應(yīng)氨與ADMA都是等物質(zhì)量的關(guān)系，氨含量即為ADMA含量，無(wú)須經(jīng)過(guò) 復(fù)雜換算，可以直接讀出ADMA含量。
[0016] 根據(jù)這一發(fā)明目的的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中樣品來(lái)源于任何包含水的液態(tài)物 質(zhì)，優(yōu)選地，樣品為尿液或血液。
[0017] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一個(gè)檢測(cè)ADMA的酶法診斷試劑盒。該試劑盒簡(jiǎn)便、 靈敏度高、重復(fù)性好、具有很好的臨床應(yīng)用前景。
[0018] 根據(jù)這一發(fā)明目的的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中試劑盒包含包含試劑R1，試劑R2， 試劑R3,緩沖液，穩(wěn)定劑，ADMA標(biāo)準(zhǔn)品的液體試劑盒或包含試劑R1，試劑R2,試劑R3,ADMA 標(biāo)準(zhǔn)品的干粉試劑盒。
[0019] 根據(jù)這一發(fā)明目的的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中試劑Rl，R2,R3緩沖液是 0. 02-0. 05MTRIS緩沖液、0. 02-0. 05M甘氨酸緩沖液或0. 02-0. 05M磷酸緩沖液，緩沖液的 PH值為 6. 5-8. 5。
[0020] 根據(jù)這一發(fā)明目的的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中試劑R1為包含二甲基精氨酸二 甲氨基水解酶最適反應(yīng)體系的混合物；試劑R2為包含鳥氨酸甲氨酰轉(zhuǎn)移酶（ornithine transcarbamoylase，EC2. 1. 3. 3)和氨甲酰激酶（carbamatekinase，EC2. 7. 2. 2)的最適反 應(yīng)體系的混合物；試劑R3為包含水楊酸、亞硝基鐵氰化鈉和次氯酸鈉的最適反應(yīng)體系或底 物γ-酮戊二酸、NADPH和谷氨酸脫氫酶的最適反應(yīng)體系的混合物。
[0021] 根據(jù)這一發(fā)明目的的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中二甲基精氨酸二甲氨基水解酶、鳥 氨酸甲氨酰轉(zhuǎn)移酶和氨甲酰激酶用量?jī)?yōu)選2-20kU/L;水楊酸溶液濃度優(yōu)選2-5% ;亞硝基 鐵氰化鈉溶液濃度優(yōu)選〇. 2-1 %;次氯酸鈉溶液濃度優(yōu)選0. 04-0. 10mol/L;γ-酮戊二酸優(yōu) 選 0.l-20mM;NADPH優(yōu)選 0.l-20mM;谷氨酸脫氫酶優(yōu)選 0.l-200mM.。
[0022] 根據(jù)這一發(fā)明目的的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中穩(wěn)定劑是0. 1-0. 5%牛血清白蛋白， 10-15%甘油，甘露醇，0·001-0·01%疊氮鈉，0·5-2mMEDTA。
[0023] 根據(jù)這一發(fā)明目的的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所述的ADMA標(biāo)準(zhǔn)品為添加了ADMA 純品或NH4+純品的人血清或其它類似血清基質(zhì)的液體。優(yōu)選地，選擇添加了ADMA純品的人 血清或其它類似血清基質(zhì)的液體。
[0024] 根據(jù)這一發(fā)明目的的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中本試劑盒一方面能用于ADMA的檢 測(cè)，另一方面還能用于L-瓜氨酸的檢測(cè)，還能用于氨的檢測(cè)。
【附圖說(shuō)明】
[0025] 圖 1 :NG，NG'dimethyl-L-arginine，a