雙酶梭菌及其用途及納米金屬硫化物的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及雙酶梭菌，本發(fā)明涉及該雙酶梭菌在制備納米金屬硫化物中的應(yīng)用， 本發(fā)明還涉及該雙酶梭菌在處理重金屬污染物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，新興的生物制備納米粒子的方法即眾多的生物大分子在合適的生理條件 (pH、溫度、鹽度）下都是天然的納米反應(yīng)器。利用微生物體來合成納米材料的主力軍是細 菌，當然利用真菌和病毒等其它微生物體也已制備出許多性能優(yōu)良、形貌精美的納米材料。 相對于傳統(tǒng)的物理、化學(xué)制備的方法，生物法具有其獨特的優(yōu)點，如制備程序簡單、細菌易 于控制、條件溫和、設(shè)備簡單、操作方便和成本較低、收率高等。
[0003] 但是，現(xiàn)有技術(shù)中，細菌對重金屬的耐受濃度普遍不高，這限制了微生物體在制備 納米材料方面的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供一種雙酶梭菌，本發(fā)明還提供了該雙酶梭菌在制備納米金屬硫化物中 的應(yīng)用，本發(fā)明還提供了該雙酶梭菌在處理重金屬污染物中的應(yīng)用。
[0005] -種雙酶梭菌（Clostridiumbifermentans)，保藏于中國微生物菌種保藏管理委 員會普通微生物中心，保藏號CGMCCNo. 9294,保藏日期2014年6月12日。保藏地址為北 京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。
[0006] 該雙酶梭囷在制備納米金屬硫化物中的應(yīng)用。
[0007] 制備納米金屬硫化物的方法，包括以下步驟： S10.在培養(yǎng)基中加入含0. 01_5g/L金屬鹽溶液，調(diào)節(jié)pH值至4-9,滅菌后冷卻至室溫， 加入含有雙酶梭菌的菌液，獲得接種溶液； S20.將接種溶液放置于15-45°C下厭氧培養(yǎng)6~76小時； S30.獲得納米金屬硫化物。
[0008] 所述的金屬鹽溶液中的金屬元素為鎳、鈷、鋅、鎘、鐵、錳、汞、鉛、金、銀、銅中的一 種或幾種。
[0009] 所述的金屬鹽溶液為硝酸鹽溶液、鹽酸鹽溶液和硫酸鹽溶液中的一種或幾種。
[0010] 所述的金屬鹽溶液和/或培養(yǎng)基中還包括鎳、鈷、鋅、鎘、鐵、錳、汞、鉛、金、銀、銅 等元素離子的絡(luò)合物。
[0011] 所述的培養(yǎng)基中包括含硫有機質(zhì)。
[0012] 該雙酶梭菌在處理重金屬污染物中的應(yīng)用。
[0013] 本發(fā)明的雙酶梭菌具有高的金屬離子耐受濃度、在高重金屬濃度的環(huán)境下，能夠 保持良好的活性。能夠以原位的方法，應(yīng)用于制備納米粒子和處理重金屬污染物。
[0014] 說明書附圖 圖1為實施例1獲得的黑色沉淀TEM圖。
[0015] 圖2為實施例2獲得的黑色沉淀TEM圖。
[0016] 圖3為實施例3獲得的黑色沉淀TEM圖。
[0017] 圖4為實施例4獲得的黑色沉淀TEM圖。
[0018] 圖5為實施例5獲得的黑色沉淀TEM圖。
[0019] 圖6為不同Cd2+濃度對去除情況的影響圖（t= 37°C，ρΗ=6· 5)。
[0020] 圖7為不同Cu2+濃度對去除情況的影響圖（t= 37°C，ρΗ=6. 5)。
[0021] 圖8為pH對Cd2+去除率的影響圖（t= 37°C，Cd2+為40mg/L)。
[0022] 圖9為pH對Cu2+去除率的影響圖（t= 37°C，Cu2+為40mg/L)。
[0023] 圖10為溫度對Cd2+去除率的影響圖（ρΗ=6· 5,Cd2+為40mg/L)。
[0024] 圖11為溫度對Cu2+去除率的影響圖（ρΗ=6· 5,Cu2+為40mg/L)。
【具體實施方式】
[0025] 下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而 更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù) 人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細節(jié)和形式 進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
[0026] -株雙酶梭菌（Clostridiumbifermentans)，保藏于中國微生物菌種保藏管理委 員會普通微生物中心，保藏號CGMCCNo. 9294,保藏日期2014年6月12日。
[0027] 細菌的獲?。?1、采集與富集天然菌株 從浙江某地一家電鍍公司廢水排放口處采取液樣和固樣，放入裝有30mL己滅菌的生 理鹽水的錐形瓶中，放搖床振蕩30min，連續(xù)稀釋至10 - 6倍，然后用移液槍吸取lmL所需 濃度的菌懸液，注入富集培養(yǎng)基內(nèi)并置于35°C電子恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)2-4天。用肉眼觀察 培養(yǎng)基內(nèi)是否有菌生長。
[0028] 2、菌的馴化 取富集樣品lmL，接種于馴化培養(yǎng)基中，在35°C、200r/min的搖床上培養(yǎng)72h，再取培 養(yǎng)液lmL進行傳代馴化。每72h接種傳代1次。經(jīng)過若干代重金屬離子馴化后，選擇生長 代謝旺盛、菌絲球豐富、分布均勻者供平板分離初篩。
[0029] 3、初篩方法 蘸取馴化菌液于分離平板上劃線，35°C培養(yǎng)48h-72h，觀察菌體生長情況，挑選生長優(yōu) 良的單菌落接種于斜面試管中。
[0030] 4、復(fù)篩方法 將初篩得到的菌株分別接種于復(fù)篩培養(yǎng)基中進行搖瓶培養(yǎng)，在35 °C、200r/min的搖床 上培養(yǎng)72h，每12h測1次培養(yǎng)基中剩余的重金屬離子濃度，淘汰去除重金屬離子能力較低 的菌株，將能力較高的菌株接種于擴大培養(yǎng)基中，35°C下進行增殖培養(yǎng)。
[0031] 5、菌種的純化 菌種的純化實驗采用改良的Brewer皿厭氧瓊脂平板進行操作。復(fù)篩培養(yǎng)液中取10ml 菌液，放入事先充滿氮氣并帶有數(shù)粒玻璃珠的無氧滅菌的培養(yǎng)瓶中，在振蕩器中振蕩1小 時后將污泥中菌膠團徹底打碎，然后用充滿氮氣的脫氧無菌水或脫氧無菌生理鹽水進行 10倍為基準的梯度稀釋，將梯度稀釋后的菌液分別接種于固體培養(yǎng)基之中制成滾管，培養(yǎng) 3天。挑取單菌落轉(zhuǎn)接入液體培養(yǎng)基中。重復(fù)以上操作若干次，直至管內(nèi)菌落和顯微鏡下 的細胞形態(tài)一致認為是純菌株，再進一步用電鏡確認。將分離純化的發(fā)酵細菌轉(zhuǎn)接于液體 培養(yǎng)基中，35°C、200r/min振蕩培養(yǎng)3天，再次檢測培養(yǎng)液中重金屬離子剩余濃度，確定獲 取對重金屬離子去除能力較高的功能菌。
[0032] 6、菌的鑒定 首先在商品哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基厭氧平板（上?？片敿挝⑸锛夹g(shù)有限公司）， 用無菌接種環(huán)挑取獲得的功能菌種接種于平板，放置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察平板 上菌種的生長狀況和細胞形態(tài)，直至平板上菌落和顯微鏡下的細胞形態(tài)一致認為是純菌 株；其次通過對菌株菌落、液體培養(yǎng)特征、細胞形態(tài)觀察、生理生化特征實驗基礎(chǔ)上，對其 16SrDNA序列分析研究，最后確定為一株雙酶梭菌（Clostridiumbifermentans)，保藏于中 國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCCNo. 9294,保藏日期2014年6 月12日。
[0033] 在1L培養(yǎng)基中加入0. 5g硫酸亞鐵，滅菌冷卻后再接種5%已經(jīng)培養(yǎng)好的菌液進行 培養(yǎng)，然后通過不斷增加硫酸亞鐵的濃度對菌株進行馴化，最終獲得對亞鐵離子具有耐受 性的優(yōu)勢菌株，最大耐受濃度為5g/L硫酸亞鐵。
[0034]雙酶梭菌細菌形態(tài)：細小菌落、干燥；革蘭陽性、芽孢桿菌?；旧磻?yīng)：觸酶-、氧化酶-、吲哚+、克氏雙糖-/_ (生長不良)。
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