表面展示谷氨酸脫氫酶的重組芽孢及其構(gòu)建方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一株表面展示谷氨酸脫氨酶的重組芽抱 及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 氨基下酸是一種抑制人體神經(jīng)信息傳遞的非天然氨基酸，具有加強葡萄糖憐 酸醋酶的活性，促進腦細胞代謝的作用。同時，L-2-氨基下酸也是一種重要的化工原料和很 多藥物合成的手性中間體，已被廣泛用于藥物合成，例如，它是抗癒痛藥物左乙拉西坦和布 瓦西坦的關(guān)鍵生產(chǎn)原料，也是抑菌抗結(jié)核藥乙胺下醇鹽酸鹽的關(guān)鍵手性前體。因此，大量生 產(chǎn)心2-氨基下酸可W降低運些疾病治療的成本，同時提高其高效性和安全性。根據(jù)文獻報 道，經(jīng)過定點突變K92V和T195S的新型谷氨酸脫氨酶能在輔因子NADPH的存在下作用于產(chǎn)k 2-氨基下酸的代謝過程。
[0003 ]芽抱表面展示技術(shù)是新近發(fā)展起來的一口基因操作技術(shù)。芽抱是枯草芽抱桿菌在 營養(yǎng)缺乏等逆境條件下，營養(yǎng)細胞分化形成的休眠體。由于芽抱的特殊結(jié)構(gòu)，使其能忍耐一 些極端環(huán)境如高溫、高壓、化學(xué)藥物等。實現(xiàn)芽抱表面展示技術(shù)的關(guān)鍵是需要一種高豐富 度、表面結(jié)合能力強的芽抱衣殼蛋白。外層的芽胞衣殼主要由疏水的衣殼蛋白構(gòu)成，具有抗 酶解、抗藥物功能。目前已報道被成功應(yīng)用的芽抱衣殼蛋白如CotB、CotC、CotG和CotX，都是 來源于外層。從現(xiàn)有的文獻報道來看，CotB和CotC常用于錯定抗原制備疫苗，而CotG則錯定 酶蛋白發(fā)揮全細胞催化劑功能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，提供一株表面展示谷氨酸脫氨酶的重組芽抱。
[0005] 本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是，提供上述表面展示谷氨酸脫氨酶的重組芽抱的構(gòu) 建方法。
[0006] 本發(fā)明最后要解決的技術(shù)問題是，提供上述表面展示谷氨酸脫氨酶的重組芽抱在 產(chǎn)心2-氨基下酸中的應(yīng)用。
[0007] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[000引表面展示谷氨酸脫氨酶的重組芽抱，其特征在于，該重組芽抱導(dǎo)入了表達枯草芽 抱桿菌的錯定蛋白CotG基因與谷氨酸脫氨酶G畑2基因，
[0009] 所述的錯定蛋白CotG基因的核巧酸序列如SEQ ID NO: 1所示;所述的谷氨酸脫氨 酶GD肥基因的核巧酸序列如SEQ ID N0:2所示。
[0010] 其中，錯定蛋白CotG基因的N端為CotG基因的啟動子，所述的CotG基因的啟動子， 其核巧酸序列如SEQ ID NO:3所示。
[0011] 其中，錯定蛋白CotG基因與谷氨酸脫氨酶G畑2基因之間的連接區(qū)域的氨基酸序列 如沈Q ID NO:4所示。
[0012] 上述表面展示谷氨酸脫氨酶的重組芽抱的構(gòu)建方法，包括如下步驟：
[0013] (1)將沈Q ID N0:3、沈Q ID N0:1、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:2所示的核巧酸序列 依次連接，得到整合片段Co tG-g化A;
[0014] (2)將整合片段CotG-g化A克隆到pEB03質(zhì)粒的多克隆位點處，得到重組質(zhì)粒 祀B03-CotG-g化2;
[0015] (3)將重組質(zhì)粒pEB03-CotG-g化A轉(zhuǎn)化至枯草芽抱桿菌WB600,得到重組枯草芽抱 桿菌祀B03-CotG-GD肥；
[0016] (4)將步驟(3)得到的重組枯草芽抱桿菌在GYS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使其產(chǎn)生芽抱，然后 收集菌體，用溶菌酶裂解，得到表面展示谷氨酸脫氨酶的重組芽抱。
[0017] 步驟(2)中，所述的祀B03質(zhì)粒，其核巧酸序列如沈Q ID N0:5所示
[0018] 步驟(4)中，將重組枯草芽抱桿菌在GYS培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)2地，然后離屯、收集菌 體，菌體用lOOmM的P冊.0憐酸鹽緩沖懸浮，用50mg/L的溶菌酶在37°C裂解比，然后1200化pm 離屯、30min，沉淀用含有Imol/L NaCl、lmol/L KC1和的0.1mol/L、p冊.0憐酸鹽緩充液沖洗， 即可得純化的表面展示谷氨酸脫氨酶的重組芽抱。
[0019] 具體的重組枯草芽抱桿菌的構(gòu)建方法如下：
[0020] ( 1 ) W大腸桿菌谷氨酸棒桿菌的基因組為模板，F(xiàn)-GDH(BamHI ): CGCGGATCCATGGATCAGACATATTCTCTGGAGT;R-GDH()(hoI):CCGCTCGAGTAAATCACACCCTGCGCCAGC 為引物，擴增得到谷氨酸脫氨酶，該基因片段全長1344bp，編碼蛋白包含447個氨基酸，通過 基因突變，將第92位氨基K酸突變?yōu)閂，第195為氨基酸T突變?yōu)镾，得到gdM片段； 陶](2)WBacillus subtilis 168基因組為模板，cotG-F: GTCGACGGTATCGATAAGCTTAGTGTCCCTAGCTCCGAG，cotG-R: TGAACCCCCACCTCCTTTGTATTTCTTTTTGACTACCCAG為引物，擴增得到錯定蛋白CotG基因及啟動 子片段；
[0022] (3)將谷氨酸脫氨酶G畑2的基因片段連接到錯定蛋白CotG基因的C端，得到整合片 段CotG-g化A，將CotG-g化A片段克隆到祀B03質(zhì)粒上，得到重組質(zhì)粒祀B03-CotG-g化A;
[0023] (4)將重組質(zhì)粒pEB03-CotG-g化A轉(zhuǎn)化枯草芽抱桿菌WB600,得到重組芽抱桿菌 pEB03-CotG-GDH2 〇
[0024] (5)芽抱的純化:將含有重組質(zhì)粒的B. subtilis WB600在37°C條件下，用GYS培養(yǎng) 基（（NH4)2S04 2g/L、酵母膏2g/L、K2HP04 0.5g/L、葡萄糖lg/L、MgS04 0.41g/L、CaC12地20 0.08g/L、MnS04*甜20 0.07g/L)培養(yǎng)24h，然后離屯、收集菌體。菌體用lOOmM的P冊.0憐酸鹽 緩沖懸浮，用〇.5%的溶菌酶在37°(3裂解化，然后1200化9111離屯、3〇111111，隨后用謹(jǐn)化(：1，11 KC1和憐酸酸鹽緩沖沖洗，即可得純化的芽抱細胞，
[0025] 上述表面展示谷氨酸脫氨酶的重組芽抱的構(gòu)建方法構(gòu)建得到的表面展示谷氨酸 脫氨酶的重組芽抱在制備氨基下酸中的應(yīng)用。
[0026] 催化體系如下：取Ig純化后重組芽抱加入100ml催化反應(yīng)液（O.lmol/L pH 8.0PBS，0.2mol/L 酬下酸，0.2mol/L NH4Cl，0.2Xl〇-2mol/L NADPH)
[0027] 催化條件如下:溫度37°C，260rpm，時間12h。離屯、留取上清。
[002引有益效果：
[0029]本發(fā)明在枯草芽抱桿菌WB600中表面展示谷氨酸脫氨酶，構(gòu)建并篩選得到一株重 組芽抱桿菌，此重組芽抱上錯定的谷氨酸脫氨酶蛋白發(fā)揮全細胞催化劑功能，Wa-酬下酸 為底物，催化生產(chǎn)レ2-氨基下酸，發(fā)酵液中氨基下酸的濃度可達38.72g/L，轉(zhuǎn)化率為 95.6%。枯草芽抱桿菌是GRAS菌種之一，因此它產(chǎn)生的芽抱是無毒的，同時操作簡單，穩(wěn)定 性好，安全性高;并且氨基下酸的產(chǎn)量較高，底物轉(zhuǎn)化率高，發(fā)酵工藝簡單高效，沒有副 產(chǎn)物，易于分離，且易于工業(yè)化大生產(chǎn)，具有良好的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0030]圖1谷氨酸脫氨酶基因的PCR圖。
[0031 ]圖2谷氨酸脫氨酶基因與T載體連接后提取質(zhì)粒與酶切驗證圖。
[0032] 圖3谷氨酸脫氨酶基因與祀T-28a載體連接后提取質(zhì)粒與酶切驗證圖。
【具體實施方式】
[0033] 根據(jù)下述實施例，可W更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實 施例所描述的內(nèi)容僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會限制權(quán)利要求書中所詳細描述的本 發(fā)明。
[0034] 實施例1:谷氨酸脫氨酶基因的克隆與表達。
[0035] (1)谷氨酸脫氨酶基因片段擴增：
[0036] 擴增谷氨酸脫氨酶引物如下：
[0037] F-GDH(BamH I)：CGCGGATCCATGGATCAGACATATTCTCTGGAGT
[0038] R-G畑（Xho I):CCGCTCGAGTAAATCACACCCTGCGCCAGC
[0039] W谷氨酸棒桿菌基因組大腸桿菌DH5a基因組為模板，擴增的目的片段全長 1344bp，該基因編碼蛋白包含447個氨基酸。圖為PCR之后所得到的產(chǎn)物，再進行切膠回收目 的片段，如圖1所示。
[0040] (2)目的片段與T-載體連接轉(zhuǎn)化并進行雙酶切(BamH I和EcoR I)驗證：
[0041] PCR獲得的谷氨酸脫氨酶基因片段與T-載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，W質(zhì)粒小提試劑 盒提取質(zhì)粒，雙酶切鑒定并進行瓊脂糖凝膠電泳，雙酶切電泳圖顯示有兩條帶，通過酶切位 點分析，證實片段成功插入到載體(圖2)。
[0042] (3)測序正確后，酶切下片段與載體祀T-28a連接轉(zhuǎn)化提質(zhì)粒并進行酶切驗證：
[0043] 含目的基因的T載與載體PET-2&1分別經(jīng)BamH I和趾0 I雙酶切，膠回收的目的基 因片段與線性化的載體連接，轉(zhuǎn)化成功后提質(zhì)粒進行酶切驗證連接成功(圖3)。
[0044] (4)選出連接成功的一管樣品祀T-28a-GDH送金唯智公司定點突變?yōu)閷⒌?2位氨 基K酸突變?yōu)閂，第195為氨基酸T突變?yōu)镾，得到祀T-28a-GD肥質(zhì)粒。
[0045] (5)酶活檢測：
[0046] 蛋白表達：
[0047] 酶切鑒定正確后，將祀T28a-GDH2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至表達宿主E.coli Rosetta(DE3) 感受態(tài)細胞，涂布于LBAKan+cl)抗性平板培養(yǎng)過夜。從平板中挑取單菌落于5ml LB中37°C 200巧m培養(yǎng)過夜（由于Rosetta具有Cl抗性，pET-28a具有kan抗性，為保證質(zhì)粒不丟失，液體 培養(yǎng)基中均加入千分之一的α和Kan抗性）。按照1 %的量轉(zhuǎn)接入200ml LB液體中，同時加入 抗生素，37°C200巧m培養(yǎng)至0D = 0.8左右加入0.4mM IPTG，30°C200巧m誘導(dǎo)lOh，集菌。
[004引粗酶液的獲得：
[0049] 用lOOmmol/L P冊.0的化is-HCl緩沖將菌泥洗兩遍，具體操作為：用緩沖將菌泥重 懸，700化pm 5min，重復(fù)一遍。用10ml緩沖重懸，超聲（超3秒，停5秒，60次），4°C離屯、15min， 取上清，即獲得的粗酶液。
[0050] 酶純化：
[0051] A、將樹脂中的20%的乙醇從純化管下方滴出；
[0化2] B、用10ml超純水過柱子；
[0053] C、用10ml 500mM咪挫過柱子（目的是洗去上一個人未洗下來的蛋白）；
[0054] D、10ml Tris-HCl緩沖過柱子；
[0化日]6、重復(fù)0;
[0056] F、加粗酶液、搖晃、重懸，將柱子在冰上放置30min左右后棄酶液；
[0057] G、10ml 20mM咪挫洗涂，洗3-4次，在最后快洗完的時候接一管測蛋白濃度；
[0化引 H、2ml 500mM咪挫洗脫蛋白，用5ml離屯、管接??；
[0059] I、用10ml 500mM咪挫繼續(xù)洗去剩余蛋白，洗2次；
[0060] J、用10ml 20%的乙醇保存。
[0061] 蛋白鑒定：
[0062] 取上清液20化按比例加入2 X SDS-PAGE上樣緩沖液，重懸菌液，煮沸5~lOmin，進 行SDS-