= [ΔOD/min(Δ0D試驗-Δ0D空白）XVtX壯]/ (22X1. 0XVs)，
[0127] U/mg=扣/ml)X1/C，其中，
[0128] Vt為反應總體積，為3. 0ml，Vs為樣品體積，為0. 1ml;
[0129] 22:在上述測定條件下的DCIP的毫摩爾吸光系數(shù)（cm7微摩爾），1.0 :光徑（cm)， 壯：稀釋系數(shù)，C:溶液中的酶濃度（mg/ml)。
[0130] 在檢測時，應注意在檢測前，應用預冷的試劑E溶解酶粉末，用相同緩沖液稀釋為 0. 1-0. 8U/ml。另外由于該酶的粘附性，優(yōu)選使用塑料試管進行檢測。
[0131] 實施例5 :野生型PQQ-sGDH或PQQ-sGDH突變體酶熱穩(wěn)定性測定
[0132] 制備含有Img野生型PQQ-sG畑或PQQ-sG畑突變體和0. 016mgPQQ的20mM憐酸 鐘溶液（pH7. 0)，W活化野生型PQQ-sGDH或PQQ-sGDH突變體。在室溫保溫30min后，按照 實施例4中的方法，測定對葡萄糖的初始酶活性，然后將酶溶液在50°C的水浴中保溫30分 鐘后，檢測酶溶液的剩余酶活性，并W百分率計算。
[0133] 實施例6 :野生型PQQ-sGDH和PQQ-sGDH突變體交叉反應性和熱穩(wěn)定性測試
[0134] 將實施例1或?qū)嵤├?中收集的菌體用超聲進行細胞破碎，將破碎后的菌液進行 離屯、，取離屯、后的上清液100μ1，并往上清液中加入900μ1含有ImMPQQ和ImMCaClz的 lOmMMOPS緩沖液（pH7.0)，在室溫下反應1個小時，反應后形成的全酶用于下面的交叉反 應和熱穩(wěn)定性測試。
[0135] 按照實施例4中的酶活性測定方法，取一定量的野生型PQQ-sGDH和PQQ-sGDH突 變體酶溶液，用濃度30mM的葡萄糖水溶液進行測試，同時用濃度30mM的麥芽糖水溶液進行 測試。
[0136] 計算酶活性時，將使用30mM葡萄糖作為底物的值設(shè)定為100%活性。將麥芽糖測 得的值與葡萄糖數(shù)值相比較，并按照公式1和公式2分別計算野生型PQQ-sGDH對麥芽糖的 交叉反應性[%]和PQQ-sGDH突變體對麥芽糖的交叉反應性[%]。在W下的表中，WM/G 表示野生型PQQ-sGDH或PQQ-sGDH突變體對麥芽糖的交叉反應性。同時基于此，按照公式 3計算出各種PQQ-sGDH突變體的改善的底物特異性。
[0137] 野生型PQQ-sGDH和PQQ-sGDH突變體的熱穩(wěn)定性按照實施例5中的方法進行檢 測。
[013引 （DT372N單位點突變
[0139] 其交叉反應性和熱穩(wěn)定性檢測結(jié)果如表1所示：
[0140] 表 1
[0141]
[0142] 由表1可知，PQQ-sGDH突變體單位點突變T372N的M/G為70%，改善的底物特異 性為1. 49,運意味著與野生型PQQ-sGDH相比，該突變體具有1. 49倍改善的底物特異性（麥 芽糖/葡萄糖）。由此可知，該突變體對麥芽糖的交叉反應性顯著降低，其對葡萄糖的底物 特異性顯著提高。另外，由表1可知，該突變體也有良好的熱穩(wěn)定性。
[0143] (2)T372C單位點突變和基于T372C的組合突變
[0144] 其交叉反應性和熱穩(wěn)定性檢測結(jié)果如表2所示：
[0145]表 2
[0146]
[0147]
[014引
[0149] 由表2可知，PQQ-sGDH突變體單位點突變T372C的M/G為51%，改善的底物特異 性為2. 04,即與野生型PQQ-sGDH相比，該突變體具有2. 04倍改善的底物特異性（麥芽糖/ 葡萄糖）。而基于T372C的兩位點組合突變的M/G最低為4. 62%，改善的底物特異性最低 為2. 99。而基于T372C的Ξ位點組合突變的M/G最低為2. 87%，改善的底物特異性最低為 3. 27?；赥372C的四位點及W上組合突變的M/G最低為1. 35%，改善的底物特異性最低 為7. 74。由此可知，表2中的各種PQQ-sGDH突變體對麥芽糖的交叉反應性顯著降低，其對 葡萄糖的底物特異性顯著提高。
[0150] (3)基于T372D的組合突變
[0151] 其交叉反應性和熱穩(wěn)定性檢測結(jié)果如表3所示：
[015?表3
[0153]
[0154]
[0155J

[0156] 由表3可知，基于T372D的兩位點組合突變的M/G最低為5. 51 %，改善的底物特 異性最低為2. 93,即與野生型PQQ-sGDH相比，該突變體具有最低2. 93倍改善的底物特異 性（麥芽糖/葡萄糖）?；赥372D的Ξ位點組合突變的M/G最低為4. 07%，改善的底物 特異性最低為3. 14。而基于T372D的四位點及W上組合突變的M/G最低為1. 33%，改善的 底物特異性為最低為8. 15。由此可知，表3中的各種PQQ-sGDH突變體對麥芽糖的交叉反應 性顯著降低，其對葡萄糖的底物特異性顯著提高。
[0157]




【主權(quán)項】
1. 一種PQQ-S⑶Η突變體，所述PQQ-S⑶Η突變體源自于醋酸鈣不動桿菌的野生型 PQQ-s⑶Η氨基酸序列SEQIDNO1，或者源自于其他微生物的與SEQIDNO1具有至少 90%同源性的野生型氨基酸序列，所述PQQ-sGDH突變體的氨基酸位點編號對應于來自醋 酸鈣不動桿菌的野生型PQQ-s⑶Η氨基酸序列SEQIDNO1，其特征在于，所述PQQ-s⑶Η突 變體攜帶的突變包括選自以下一組突變中的一種：（1)T372C;(2)Τ372Ν;(3)T372D，且所述 PQQ-s⑶Η還在99、167、170、192、193、270、318、365、366、367、372、402、452和455位點中至 少一個位點發(fā)生替換突變。2.如權(quán)利要求1所述的PQQ-sGDH突變體，所述PQQ-sGDH突變體攜帶的突變包括選自 以下一組突變中的一種：（1)T372C，且所述PQQ-s⑶Η還在99、167、170、192、193、270、318、 365、366、367、372、402、452和455位點中至少一個位點發(fā)生替換突變；（2)T372D，且所述 PQQ-s⑶Η還在99、167、170、192、193、270、318、365、366、367、372、402、452和455位點中至 少兩個位點發(fā)生替換突變。3.如權(quán)利要求2所述的PQQ-sGDH突變體，所述PQQ-sGDH突變體攜帶的突變包括 選自以下一組突變中的一種：（1)T372C，且所述PQQ-s⑶Η還在99、167、170、192、193、 270、318、365、366、367、372、402、452和455位點中至少兩個位點發(fā)生替換突變；（2) T372D+D167X+N452X+M365X； (4)T372D+N452X+M365X+S170X+Q270X； (5)T372D+N452X+Y367X+S170X+Q270X+Q192X； (6)T372D+N452X+T366X+S170X+Q270X+G99X+Q192X〇4. 如權(quán)利要求3所述的PQQ-sGDH突變體，所述PQQ-sGDH突變體攜帶的突變包括選自 以下一組突變中的一種：（1)T372C+D167X+N452X+M365X; (2)T372C+N452X+M365X+S170X+Q270X； (3)T372C+N452X+T366X+S170X+Q270X； (4)T372C+N452X+Y367X+S170X+Q270X+Q192X； (5)T372D+N452X+T366X+S170X+Q270X+G99X+Q192X+A318X； (6)T372D+N452X+T366X+S170X+Q270X+G99X+Q192X+R402X〇5.如權(quán)利要求4所述的PQQ-sGDH突變體，所述PQQ-sGDH突變體攜帶的突變包括選自 以下一組突變中的一種： (1)T372C+D167E+N452P+M365V+Q270H+Q192X； (2)T372C+N452X+T366X+S170X+Q270X+Q192X； (3)T372C+N452X+T366X+S170X+Q270X+L193X〇6.如權(quán)利要求5所述的PQQ-sGDH突變體，所述PQQ-sGDH突變體攜帶的突變包括選自 以下一組突變中的一種： (1) T372C+N452X+T366X+S170X+Q270X+Q192X+G99X； (2)T372C+N452X+M365X+T366X+S170X+Q270X+L193X。7.如權(quán)利要求6所述的PQQ-sGDH突變體，所述PQQ-sGDH突變體攜帶的突變包括選自 以下一組突變中的一種： (1)T372C+N452X+T366X+S170X+Q270X+G99X+A318X+Q192X； (2) T372C+N452X+T366X+S170X+Q270X+G99X+R402X+Q192X； (3)T372C+N452X+M365X+T366X+S170X+Q270X+Q192X+L193X。8.如權(quán)利要求3-7之一所述的PQQ-s⑶H突變體，所述PQQ-s⑶H突變體攜帶的突變，若 包含G99X，則G99X中的X選自W;若包含D167X，則D167X中的X選自Ε;若包含S170X，則 S170X中的X選自G;若包含Q192X，則Q192X中的X選自Α或S;若包含L193X，則L193X中 的X選自P或F;若包含Q270X，則Q270X中的X選自Η;若包含A318X，則A318X中的X選自 D;若包含Μ365Χ，則Μ365Χ中的X選自V;若包含Τ366Χ，則Τ366Χ中的X選自Ν或V;若包含 Υ367Χ，則Υ367Χ中的X選自C或S;若包含R402X，則R402X中的X選自I;若包含Ν452Χ，則 Ν452Χ中的X選自Τ、Ρ、V、C、L、D、I或A;若包含Κ455Χ，則Κ455Χ中的X選自R或I。9. 一種分離的聚核苷酸，所述聚核苷酸編碼權(quán)利要求1-7之一中的PQQ-s⑶Η突變體。10. 權(quán)利要求1-7之一中的PQQ-s⑶Η突變體在檢測樣品葡萄糖中的應用。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種可溶性吡咯喹啉醌依賴性葡萄糖脫氫酶(PQQ-sGDH)突變體，其氨基酸位置對應于醋酸鈣不動桿菌的野生型PQQ-sGDH序列SEQ？ID？NO1，所述PQQ-sGDH突變體攜帶的突變包括以下一組突變中的一種：T372C，T372N，基于T372C的組合突變和基于T372D的組合突變。這些PQQ-sGDH突變體對具有良好的葡萄糖底物特異性，對麥芽糖等糖的交叉反應性顯著下降，特別適合用于檢測血液等樣品中的葡萄糖。
【IPC分類】C12Q1/54, C12Q1/32, C12N15/53, C12N9/04
【公開號】CN105331590
【申請?zhí)枴緾N201510716023
【發(fā)明人】王哲, 畢鑫, 邱日永
【申請人】英科隆生物技術(shù)（杭州）有限公司
【公開日】2016年2月17日
【申請日】2015年10月29日