一種測(cè)定α?羥丁酸脫氫酶的試劑盒及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種測(cè)定α?羥丁酸脫氫酶的試劑盒及其制備方法，包括彼此獨(dú)立的試劑R1和試劑R2雙液體組分組成試劑盒，包括的成分及相應(yīng)含量為：試劑R1：緩沖液 1~350mmol/L、α?酮丁酸 0.01~10mmol/L、乙二胺四乙酸二鈉0.1~2g/L、穩(wěn)定劑0.01~0.40g/L，其溶劑為純化水，試劑R2：緩沖液 1~350mmol/L、NADH 0.1~4.0mmol/L、穩(wěn)定劑0.01~0.40g/L，其溶劑為純化水，制備方法為：按照下列組分含量配制好試劑；將待測(cè)樣本與試劑R1和試劑R2混合，使其充分反應(yīng)；用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定反應(yīng)后的吸光度差值；根據(jù)吸光度變化值計(jì)算出樣本中的α?羥丁酸脫氫酶的濃度。本發(fā)明具有準(zhǔn)確度高、精密度好等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說(shuō)明】
一種測(cè)定α-羥丁酸脫氫酶的試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)及生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體來(lái)說(shuō)是一種測(cè)定Ct-羥丁酸脫氫酶的試 劑盒及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] α-羥丁酸脫氫酶(α-HBDH)不是一個(gè)獨(dú)立的特異酶，而是含有H亞基的乳酸脫氫酶 同工酶LDHl和LDH2的總稱。測(cè)定a-羥丁酸脫氫酶，其實(shí)際反應(yīng)的是乳酸脫氫酶同工酶LDHl 和LDH2的活性，對(duì)診斷心肌疾病和肝病有重要意義。a-HBDH的活性與LDH的活性變化一致， 但更能反映 LDHl的活性變化，其特異性比總LDH活性高。與LDH、AST、CK、CK-MB構(gòu)成心肌酶 譜，對(duì)診斷心肌梗死更有意義。
[0003] a-羥丁酸脫氫酶目前的檢測(cè)方法有很多，目前，國(guó)內(nèi)很多醫(yī)療機(jī)構(gòu)所使用的a-羥 丁酸脫氫酶試劑盒多采用速率法測(cè)定，但由于酶本身的限制以及輔助的環(huán)境條件，例如，是 否選擇了合適的緩沖液、穩(wěn)定劑、最適PH等條件，使得a-羥丁酸脫氫酶的測(cè)定質(zhì)量存在很大 的折扣，因此穩(wěn)定性以及測(cè)定的準(zhǔn)確度均不是很好。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是為了克服現(xiàn)有的a-羥丁酸脫氫酶測(cè)定結(jié)果不準(zhǔn)確 的缺陷，而提供一種測(cè)定a-羥丁酸脫氫酶的試劑盒及其制備方法。
[0005] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題提供的技術(shù)方案是:本發(fā)明公開(kāi)了一種測(cè)定a-羥丁酸脫 氫酶的試劑盒，包括彼此獨(dú)立的試劑Rl和試劑R2雙液體組分組成試劑盒，包括的成分及相 應(yīng)含量為： 試劑Rl: 緩沖液 1~350mmol/L a-酬丁酸 0.01~10mmol/L 乙二胺四乙酸二鈉0.1~2g/L 穩(wěn)定劑 0.01~0.40g/L 其溶劑為純化水。
[0006] 試劑R2: 緩沖液 1~350mmol/L NADH 0.1~4.0mmol/L 穩(wěn)定劑 0.01~0.40g/L 其溶劑為純化水。
[0007]作為優(yōu)選，本發(fā)明公開(kāi)了一種測(cè)定a-羥丁酸脫氫酶的試劑盒，包括彼此獨(dú)立的試 劑Rl和試劑R2雙液體組分組成試劑盒，包括的成分及相應(yīng)含量為： 試劑Rl: 緩沖液 180mmol/L α-酬丁酸 5mmol/L 乙二胺四乙酸二鈉 l.Og/L 穩(wěn)定劑 0.20g/L 其溶劑為純化水。
[0008] 試劑 R2: 緩沖液 180mmol/L NADH 2.Ommol/L 穩(wěn)定劑 0.20g/L 其溶劑為純化水。
[0009] 作為優(yōu)選，所述的試劑Rl中，所述的緩沖液為磷酸鹽緩沖液、三羥甲基氨基甲烷緩 沖液、1，4_哌嗪二乙磺酸緩沖液、4-羥乙基哌嗪丙磺酸、4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液、三羥 甲基甲胺基丙磺酸緩沖液、甘氨酸緩沖液、硼酸緩沖液、3-嗎啉丙磺酸緩沖液、3-(N-嗎啉 基)-2-羥丙基磺酸緩沖液、2-嗎啉乙磺酸緩沖液、磷酸二氫鈉緩沖液中的一種或兩種以上 任意比例的混合。
[0010] 作為優(yōu)選，所述的試劑R2中，所述的緩沖液為磷酸鹽緩沖液、三羥甲基氨基甲烷緩 沖液、1，4_哌嗪二乙磺酸緩沖液、4-羥乙基哌嗪丙磺酸、4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液、三羥 甲基甲胺基丙磺酸緩沖液、甘氨酸緩沖液、硼酸緩沖液、3-嗎啉丙磺酸緩沖液、3-(N-嗎啉 基)-2-羥丙基磺酸緩沖液、2-嗎啉乙磺酸緩沖液、磷酸二氫鈉緩沖液中的一種或兩種以上 任意比例的混合。
[0011] 作為優(yōu)選，所述的試劑Rl中，所述的穩(wěn)定劑采用疊氮鈉。
[0012] 作為優(yōu)選，所述的試劑R2中，所述的穩(wěn)定劑采用疊氮鈉。
[0013]作為優(yōu)選，所述的試劑Rl中，所述的緩沖液的pH值為6~8。
[0014] 作為優(yōu)選，所述的試劑R2中，所述的緩沖液的pH值為6~8。
[0015] 作為優(yōu)選，本發(fā)明還公開(kāi)了上述測(cè)定α-羥丁酸脫氫酶的試劑盒的制備方法和使用 方法，包括以下步驟： (a)按照下列組分含量配制好試劑： 試劑Rl: 緩沖液 1~350mmol/L α-酬丁酸 0.01~10mmol/L 乙二胺四乙酸二鈉 0.1~2g/L 穩(wěn)定劑 0.01~0.40g/L 其溶劑為純化水。
[0016] 試劑R2: 緩沖液 1~350mmol/L NADH 0.1~4.0mmol/L 穩(wěn)定劑 0.01~0.40g/L 其溶劑為純化水。
[0017] (b)將待測(cè)樣本與試劑Rl和試劑R2混合，使其充分反應(yīng)； (c) 用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定反應(yīng)后的吸光度差值； (d) 根據(jù)吸光度變化值計(jì)算出樣本中的α-羥丁酸脫氫酶的濃度。
[0018] 本發(fā)明的檢測(cè)原理是:α-羥丁酸脫氫酶催化α-酮丁酸轉(zhuǎn)化成α-羥基丁酸，同時(shí)使 煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)氧化城NAD+，在340nm處NADH吸光度的下降速率與HBDH活性 成正比。
[0019] 樣本中α-HBDH活性·_絡(luò) ClM;) 式中：△ Au/min待測(cè)樣品平均每分鐘的吸光度變化值 Δ AB/min校準(zhǔn)液平均每分鐘的吸光度變化值 Cs 校準(zhǔn)液中a-HBDH的濃度 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益優(yōu)點(diǎn)： 本發(fā)明所述的測(cè)定α-羥丁酸脫氫酶的試劑盒通過(guò)添加穩(wěn)定劑，使得酶的穩(wěn)定性得以提 升，從而提高了整個(gè)試劑盒的穩(wěn)定性，整個(gè)試劑盒的穩(wěn)定性的提高也就有效的提高了試劑 的準(zhǔn)確度、線性以及精密度。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明并不僅限于這些實(shí)施例。
[0021] 實(shí)施例1 本發(fā)明的試劑盒包括彼此獨(dú)立的試劑Rl和試劑R2雙液體組分，其中 試劑Rl: 三羥甲基氨基甲烷緩沖液 180mmol/L α-酬丁酸 5mmol/L 乙二胺四乙酸二鈉 l.〇g/L 疊氮鈉 0.20g/L 其溶劑為純化水。
[0022] 試劑 R2: 三羥甲基氨基甲烷緩沖液 180mmol/L NADH 2.Ommol/L 疊氮鈉 0.20g/L 其溶劑為純化水。
[0023] 實(shí)施例2 本發(fā)明的試劑盒包括彼此獨(dú)立的試劑Rl和試劑R2雙液體組分，其中 試劑Rl: 3_嗎啉丙磺酸緩沖液 350mmol/L α-酬丁酸 10mmol/L 乙二胺四乙酸二鈉 2g/L 疊氮鈉 0.01g/L 其溶劑為純化水。
[0024] 試劑R2: 3-嗎啉丙磺酸緩沖液 350mmol/L NADH 4.Ommol/L 疊氮鈉 0.01g/L 其溶劑為純化水。
[0025] 實(shí)施例3 試劑盒的制備和使用方法 1、按照下列組分含量配制好試劑： 試劑Rl: 三羥甲基氨基甲烷緩沖液 180mmol/L α-酬丁酸 5mmol/L 乙二胺四乙酸二鈉 l.〇g/L 疊氮鈉 0.20g/L 其溶劑為純化水。
[0026]試劑 R2: 三羥甲基氨基甲烷緩沖液 180mmol/L NADH 2.Ommol/L 疊氮鈉 0.20g/L 其溶劑為純化水。
[0027] 2、全自動(dòng)生化分析儀參數(shù)設(shè)置 (a) 檢測(cè)溫度:37°C; (b) 檢測(cè)波長(zhǎng)：主波長(zhǎng)340nm、副波長(zhǎng)405nm; (c) 反應(yīng)時(shí)間：8min，其中，孵育時(shí)間5min，加入試劑R2后立即測(cè)定讀取吸光度A1， 3min后讀取吸光度A2,計(jì)算吸光度變化ΔΑ = A2-A1 ; (d) 反應(yīng)方向：負(fù)反應(yīng)。
[0028] 3、檢測(cè)步驟 (a) 取200μ1試劑Rl與7μ1待測(cè)樣本混勻； (b) 將混勻后的溶液在37°C的條件下孵育5min; (c) 加入50μ1試劑R2,立即測(cè)定讀取吸光度Al，3min后讀取吸光度A2,計(jì)算吸光度變化 ΔΑ = A2-A1 ； ⑷ 根據(jù)α-HBDH活性彳難> _ - 計(jì)算出樣本中的羥丁酸脫氫酶的濃度。
[0029] 實(shí)施例4 試劑盒的制備和使用方法 1、按照下列組分含量配制好試劑： 試劑Rl: 3-嗎啉丙磺酸緩沖液 350mmol/L α-酬丁酸 10mmol/L 乙二胺四乙酸二鈉 2g/L 疊氮鈉 0.01g/L 其溶劑為純化水。
[0030] 試劑R2: 3_嗎啉丙磺酸緩沖液 350mmol/L NADH 4.Ommol/L 疊氮鈉 0.01g/L 其溶劑為純化水。
[0031] 2、全自動(dòng)生化分析儀參數(shù)設(shè)置 (a) 檢測(cè)溫度:37°C; (b) 檢測(cè)波長(zhǎng)：主波長(zhǎng)340nm、副波長(zhǎng)405nm; (c) 反應(yīng)時(shí)間：8min，其中，孵育時(shí)間5min，加入試劑R2后立即測(cè)定讀取吸光度A1， 3min后讀取吸光度A2,計(jì)算吸光度變化ΔΑ = A2-A1 ; (d) 反應(yīng)方向：負(fù)反應(yīng)。
[0032] 3、檢測(cè)步驟 (a) 取200μ1試劑Rl與7μ1待測(cè)樣本混勻； (b) 將混勻后的溶液在37°C的條件下孵育5min; (c) 加入50μ1試劑R2,立即測(cè)定讀取吸光度Al，3min后讀取吸光度A2,計(jì)算吸光度變化 ΔΑ = A2-A1 ；
⑷ 根據(jù)α_ΗΚ)Η活性 計(jì)算出樣本中的羥丁酸脫氫酶的濃度。
[0033] 表1為實(shí)施例1所制得的測(cè)定α-羥丁酸脫氫酶的試劑盒以及實(shí)施例2所制得的測(cè)定 α_羥丁酸脫氫酶的試劑盒分別對(duì)質(zhì)控品1進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果，其中質(zhì)控品1中的α-羥丁酸脫氫 酶的濃度為272U/L，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1:
由表1可知，本發(fā)明所制得的測(cè)定α-羥丁酸脫氫酶的試劑盒對(duì)質(zhì)控品1的測(cè)定結(jié)果偏差 較小，因此測(cè)定準(zhǔn)確度高，而且實(shí)施例1為最優(yōu)的選擇。
[0034] 表2為實(shí)施例1所制得的測(cè)定α-羥丁酸脫氫酶的試劑盒以及實(shí)施例2所制得的測(cè)定α-羥 丁酸脫氫酶的試劑盒分別對(duì)質(zhì)控品2進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果，其中質(zhì)控品2中的α-羥丁酸脫氫酶的 濃度為466U/L，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2:
由表2可知，本發(fā)明所制得的測(cè)定α-羥丁酸脫氫酶的試劑盒對(duì)質(zhì)控品2的測(cè)定結(jié)果偏差 較小，因此測(cè)定準(zhǔn)確度高，而且實(shí)施例1為最優(yōu)的選擇。
[0035]表3為實(shí)施例3所制得的測(cè)定α-羥丁酸脫氫酶的試劑盒對(duì)同一待測(cè)樣本進(jìn)行的多 次反復(fù)測(cè)定以及實(shí)施例4所制得的測(cè)定α-羥丁酸脫氫酶的試劑盒對(duì)同一待測(cè)樣本進(jìn)行的多 次反復(fù)測(cè)定，對(duì)所得的結(jié)果進(jìn)行SD和CV的計(jì)算，結(jié)果如下：
由表3可知本發(fā)明所制得的測(cè)定α-羥丁酸脫氫酶的試劑盒的精密度比較好，而且由表3 可知，實(shí)施例3為最優(yōu)的選擇。
[0036]上述實(shí)施例僅例示性說(shuō)明本發(fā)明的原理及其功效，而非用于限制本發(fā)明。任何熟 悉此技術(shù)的人士皆可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對(duì)上述實(shí)施例進(jìn)行修飾或改變。因 此，舉凡所屬技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識(shí)者在未脫離本發(fā)明所揭示的精神與技術(shù)思想下所完 成的一切等效修飾或改變，仍應(yīng)由本發(fā)明的權(quán)利要求所涵蓋。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種測(cè)定α-羥丁酸脫氫酶的試劑盒，其特征在于:包括彼此獨(dú)立的試劑R1和試劑R2 雙液體組分組成試劑盒，包括的成分及相應(yīng)含量為： 試劑R1: 緩沖液 1~350mmol/L α-酬丁酸 0.01~10mmol/L 乙二胺四乙酸二鈉0.1~2g/L 穩(wěn)定劑 0.01~0.40g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: 緩沖液 1~350mmol/L NADH 0.1~4.0mmol/L 穩(wěn)定劑 0.01~0.40g/L 其溶劑為純化水。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種測(cè)定α-羥丁酸脫氫酶的試劑盒，其特征在于:包括彼此獨(dú) 立的試劑R1和試劑R2雙液體組分組成試劑盒，包括的成分及相應(yīng)含量為： 試劑R1: 緩沖液 180mmol/L α-酬丁酸 5mmol/L 乙二胺四乙酸二鈉 l.〇g/L 穩(wěn)定劑 0.20g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: 緩沖液 180mmol/L NADH 2.0mmol/L 穩(wěn)定劑 0.20g/L 其溶劑為純化水。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種測(cè)定α-羥丁酸脫氫酶的試劑盒，其特征在于:所述的 試劑R1中，所述的緩沖液為磷酸鹽緩沖液、三羥甲基氨基甲烷緩沖液、1，4_哌嗪二乙磺酸緩 沖液、4-羥乙基哌嗪丙磺酸、4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液、三羥甲基甲胺基丙磺酸緩沖液、 甘氨酸緩沖液、硼酸緩沖液、3-嗎啉丙磺酸緩沖液、3-(Ν-嗎啉基)-2-羥丙基磺酸緩沖液、2-嗎啉乙磺酸緩沖液、磷酸二氫鈉緩沖液中的一種或兩種以上任意比例的混合。4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種測(cè)定α-羥丁酸脫氫酶的試劑盒，其特征在于:所述的 試劑R2中，所述的緩沖液為磷酸鹽緩沖液、三羥甲基氨基甲烷緩沖液、1，4_哌嗪二乙磺酸緩 沖液、4-羥乙基哌嗪丙磺酸、4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液、三羥甲基甲胺基丙磺酸緩沖液、 甘氨酸緩沖液、硼酸緩沖液、3-嗎啉丙磺酸緩沖液、3-(Ν-嗎啉基)-2-羥丙基磺酸緩沖液、2-嗎啉乙磺酸緩沖液、磷酸二氫鈉緩沖液中的一種或兩種以上任意比例的混合。5. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種測(cè)定α-羥丁酸脫氫酶的試劑盒，其特征在于:所述的 試劑R1中，所述的穩(wěn)定劑采用疊氮鈉。6. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種測(cè)定α-羥丁酸脫氫酶的試劑盒，其特征在于:所述的 試劑R2中，所述的穩(wěn)定劑采用疊氮鈉。7. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種測(cè)定α-羥丁酸脫氫酶的試劑盒，其特征在于:所述的 試劑R1中，所述的緩沖液的pH值為6~8。8. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種測(cè)定α-羥丁酸脫氫酶的試劑盒，其特征在于:所述的 試劑R2中，所述的緩沖液的pH值為6~8。9. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種測(cè)定α-羥丁酸脫氫酶的試劑盒的制備方法和使用方 法，其特征在于:包括以下步驟： (a) 按照下列組分含量配制好試劑： 試劑R1: 緩沖液 1~350mmol/L α-酬丁酸 0.01~10mmol/L 乙二胺四乙酸二鈉0.1~2g/L 穩(wěn)定劑 0.01~0.40g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: 緩沖液 1~350mmol/L NADH 0.1~4.0mmol/L 穩(wěn)定劑 0.01~0.40g/L 其溶劑為純化水 (b) 將待測(cè)樣本與試劑R1和試劑R2混合，使其充分反應(yīng)； (c) 用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定反應(yīng)后的吸光度差值； (d) 根據(jù)吸光度變化值計(jì)算出樣本中的α_羥丁酸脫氫酶的濃度。
【文檔編號(hào)】C12Q1/32GK106086158SQ201610273293
【公開(kāi)日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年4月28日 公開(kāi)號(hào)201610273293.X, CN 106086158 A, CN 106086158A, CN 201610273293, CN-A-106086158, CN106086158 A, CN106086158A, CN201610273293, CN201610273293.X
【發(fā)明人】蔡曉輝, 莊慶華, 吳錚, 徐運(yùn)
【申請(qǐng)人】安徽伊普諾康生物技術(shù)股份有限公司