一種環(huán)脂肽表面活性劑的生物合成方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種環(huán)脂肽表面活性劑的生物合成方法，其具體步驟如下所示：首先以外加氯化銨的海水為培養(yǎng)基，進(jìn)行葡萄球菌WX2701低溫厭氧發(fā)酵；對獲得的發(fā)酵液進(jìn)行無菌過濾，并依次向獲得的濾液中加入無色桿菌WX1501和長鏈脂肪烴(C20?40)單體或混合物進(jìn)行發(fā)酵；從發(fā)酵液中分離得到具有高表面活性的環(huán)脂肽表面活性；本發(fā)明采用兩步微生物全合成脂肽表面活性劑，有效避免了微生物菌株之間的相互競爭和極大地減少了代謝產(chǎn)物抑制作用，使得脂肽表面活性劑產(chǎn)量達(dá)到了38.7g/L,大大高于單菌發(fā)酵生產(chǎn)表面活性劑的產(chǎn)量，有望實(shí)現(xiàn)脂肽表面活性劑的產(chǎn)業(yè)化。
【專利說明】
一種環(huán)脂肽表面活性劑的生物合成方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種生物合成方法，尤其是一種環(huán)脂肽表面活性劑的生物合成方法。 【背景技術(shù)】
[0002]現(xiàn)有微生物來源的環(huán)脂肽類表面活性劑主要來源于單一微生物菌株的發(fā)酵生產(chǎn)。 雖然通過氮源等發(fā)酵條件優(yōu)化可提升脂肽表面活性劑的產(chǎn)量，但由于脂肽類表面活性劑在微生物體內(nèi)合成步驟多，且受到嚴(yán)格調(diào)控，導(dǎo)致單一菌株發(fā)酵培養(yǎng)條件要求高、產(chǎn)量低 l〇g/L)，極大地增加了生產(chǎn)成本，在價格上很難取代化學(xué)表面活性劑，大規(guī)模的推廣應(yīng)用受至IJ限制。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]為解決以上技術(shù)難題，本發(fā)明公開了一種環(huán)脂肽表面活性劑的生物合成方法，其具體步驟如下所示:
[0004](1)以外加氯化銨的海水為培養(yǎng)基，進(jìn)行葡萄球菌WX2701低溫厭氧發(fā)酵，按10 % (v/v)的接種量，將葡萄球菌WX2701的搖瓶種子液(濃度約1010個/ml)接入發(fā)酵培養(yǎng)基;采用SKY-200B型全溫?fù)u床，于10 °C和150rpm的條件下培養(yǎng)48h;
[0005](2)對獲得的發(fā)酵液進(jìn)行無菌過濾，并依次向獲得的濾液中加入無色桿菌WX1501 和長鏈脂肪烴(C2Q-4Q)單體或混合物進(jìn)行發(fā)酵；按10% (v/v)的接種量，依次將無色桿菌 WX1501的搖瓶種子液(濃度約1010個/ml)，長鏈脂肪烴(C2Q-4Q)單體或混合物(總濃度1 〇〇mg/ ml)接入發(fā)酵培養(yǎng)基;采用SKY-2102C型恒溫?fù)u床，于28 °C和150rpm的條件下培養(yǎng)4d;
[0006](3)從發(fā)酵液中分離得到具有高表面活性的環(huán)脂肽表面活性；用6M的NaOH將發(fā)酵液的pH值調(diào)至8.0。于lOOOOrpm下離心分離20min，收集上清液(Xia et al.，2011);采用截留分子量為l〇〇〇〇Da的膜對水相溶液進(jìn)行過濾，進(jìn)一步除去雜質(zhì)，收集透過液；
[0007]用等體積的乙酸乙酯對去除菌體、雜質(zhì)的發(fā)酵液再萃取2次，合并萃取液;將其放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，于50°C下蒸發(fā)去除溶劑，即得粗提物；
[0008]采用濕法裝填層析柱的方式，將200-300目硅膠與氯仿混合，裝填入玻璃層析柱 (〇2.5 X 400mm)，使娃膠裝填率達(dá)80%左右;待娃膠沉降后，按2ml/min的流速加入100ml氯仿對柱子進(jìn)行平衡處理，封閉層析柱，靜置過夜，備用；
[0009]用少量甲醇溶解粗提物，與少量200-300目硅膠混合，拌勻，將其置于50°C下烘干； 將硅膠與少量氯仿混合，加入層析柱，即可完成進(jìn)樣；依次采用氯仿、氯仿/乙酸乙酯(9:1， v/V)的混和液、氯仿/乙酸乙酯(8:2，v/v)的混和液、氯仿/乙酸乙酯(7:3，v/v)的混和液、氯仿/乙酸乙酯(6:4，v/v)的混和液、氯仿/乙酸乙酯(5:5, v/v)的混和液、氯仿/乙酸乙酯(4: 6，v/v)的混和液、氯仿/乙酸乙酯(3:7，v/v)的混和液、氯仿/乙酸乙酯(2:8，v/v)的混和液、 氯仿/乙酸乙酯(l:9，v/v)的混和液、乙酸乙酯作為流動相進(jìn)行洗脫，每種流動相的洗脫體積為300ml，洗脫流速為0.5ml/min;從氯仿/乙酸乙酯(9:1，v/v)的流動相開始收集洗脫液， 每20ml收集1管，用紫外分光光度計在200-280nm的范圍內(nèi)掃描吸收波長，將波形相近的樣品合并;真空蒸發(fā)去除溶劑，可得初步純化的樣品；
[0010]用甲醇溶解初步純化的樣品;采用反相液相色譜制備生物表面活性劑的純品(Das et al.，2009);液相色譜制備的條件為:Waters 600HPLC，色譜柱為Xterra Pr印RP180BD， 以甲醇/水(1:1，v/v)的混合物為流動相，流速為0.5yL/min，檢測器波長為256nm。[〇〇11]優(yōu)選的，所述海水取自浙江舟山普陀?xùn)|極海域。
[0012]優(yōu)選的，所述SKY-200B型全溫?fù)u床采購于上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司。
[0013]有益效果:本發(fā)明采用兩步微生物全合成脂肽表面活性劑，有效避免了微生物菌株之間的相互競爭和極大地減少了代謝產(chǎn)物抑制作用，使得脂肽表面活性劑產(chǎn)量達(dá)到了 38.7g/L,大大高于單菌發(fā)酵生產(chǎn)表面活性劑的產(chǎn)量，有望實(shí)現(xiàn)脂肽表面活性劑的產(chǎn)業(yè)化?！揪唧w實(shí)施方式】
[0014]結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0015] —種環(huán)脂肽表面活性劑的生物合成方法，其具體步驟如下所示:
[0016](1)以外加氯化銨的海水為培養(yǎng)基，所述海水取自浙江舟山普陀?xùn)|極海域，進(jìn)行葡萄球菌WX2701低溫厭氧發(fā)酵，按10%(v/v)的接種量，將葡萄球菌WX2701的搖瓶種子液(濃度約1010個/ml)接入發(fā)酵培養(yǎng)基;采用SKY-200B型全溫?fù)u床，所述SKY-200B型全溫?fù)u床采購于上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司，于l〇°C和150rpm的條件下培養(yǎng)48h;[〇〇17](2)對獲得的發(fā)酵液進(jìn)行無菌過濾，并依次向獲得的濾液中加入無色桿菌WX1501和長鏈脂肪烴(C2Q-4Q)單體或混合物進(jìn)行發(fā)酵；按10% (v/v)的接種量，依次將無色桿菌 WX1501的搖瓶種子液(濃度約1010個/ml)，長鏈脂肪烴(C2Q—4〇)單體或混合物(總濃度1 OOmg/ ml)接入發(fā)酵培養(yǎng)基;采用SKY-2102C型恒溫?fù)u床，所述SKY-200B型全溫?fù)u床采購于上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司，于28°C和150rpm的條件下培養(yǎng)4d;[〇〇18](3)從發(fā)酵液中分離得到具有高表面活性的環(huán)脂肽表面活性；用6M的NaOH將發(fā)酵液的pH值調(diào)至8.0。于lOOOOrpm下離心分離20min，收集上清液(Xia et al.，2011);采用截留分子量為l〇〇〇〇Da的膜對水相溶液進(jìn)行過濾，進(jìn)一步除去雜質(zhì)，收集透過液；
[0019]用等體積的乙酸乙酯對去除菌體、雜質(zhì)的發(fā)酵液再萃取2次，合并萃取液;將其放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，于50°C下蒸發(fā)去除溶劑，即得粗提物；
[0020]采用濕法裝填層析柱的方式，將200-300目硅膠與氯仿混合，裝填入玻璃層析柱 (〇2.5 X 400mm)，使娃膠裝填率達(dá)80%左右;待娃膠沉降后，按2ml/min的流速加入100ml氯仿對柱子進(jìn)行平衡處理，封閉層析柱，靜置過夜，備用；[〇〇21]用少量甲醇溶解粗提物，與少量200-300目硅膠混合，拌勻，將其置于50°C下烘干； 將硅膠與少量氯仿混合，加入層析柱，即可完成進(jìn)樣；依次采用氯仿、氯仿/乙酸乙酯(9:1， v/V)的混和液、氯仿/乙酸乙酯(8:2，v/v)的混和液、氯仿/乙酸乙酯(7:3，v/v)的混和液、氯仿/乙酸乙酯(6:4，v/v)的混和液、氯仿/乙酸乙酯(5:5，v/v)的混和液、氯仿/乙酸乙酯(4: 6，v/v)的混和液、氯仿/乙酸乙酯(3:7，v/v)的混和液、氯仿/乙酸乙酯(2:8，v/v)的混和液、 氯仿/乙酸乙酯(l:9，v/v)的混和液、乙酸乙酯作為流動相進(jìn)行洗脫，每種流動相的洗脫體積為300ml，洗脫流速為0.5ml/min;從氯仿/乙酸乙酯(9:1，v/v)的流動相開始收集洗脫液， 每20ml收集1管，用紫外分光光度計在200-280nm的范圍內(nèi)掃描吸收波長，將波形相近的樣品合并;真空蒸發(fā)去除溶劑，可得初步純化的樣品；
[0022]用甲醇溶解初步純化的樣品;采用反相液相色譜制備生物表面活性劑的純品(Das et al.，2009);液相色譜制備的條件為:Waters 600HPLC，色譜柱為Xterra Pr印RP180BD， 以甲醇/水(1:1，v/v)的混合物為流動相，流速為0.5yL/min，檢測器波長為256nm。
[0023]上述【具體實(shí)施方式】僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非對實(shí)施方式的限定。對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動，這里無需也無法對所有的實(shí)施方式予以窮舉，而由此所引申出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍中。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種環(huán)脂肽表面活性劑的生物合成方法，其特征在于，其具體步驟如下所示:(1)以外加氯化銨的海水為培養(yǎng)基，進(jìn)行葡萄球菌WX2701低溫厭氧發(fā)酵，按10%(v/v) 的接種量，將葡萄球菌WX2701的搖瓶種子液(濃度約1010個/ml)接入發(fā)酵培養(yǎng)基;采用SKY-200B型全溫?fù)u床，于10°C和150rpm的條件下培養(yǎng)48h;(2)對獲得的發(fā)酵液進(jìn)行無菌過濾，并依次向獲得的濾液中加入無色桿菌WX1501和長 鏈脂肪烴(C2Q—4〇)單體或混合物進(jìn)行發(fā)酵;按10%(v/v)的接種量，依次將無色桿菌WX1501的 搖瓶種子液(濃度約1 〇 1 〇個/ml)，長鏈脂肪烴(C2Q-4Q)單體或混合物(總濃度100mg/ml)接入 發(fā)酵培養(yǎng)基;采用SKY-2102C型恒溫?fù)u床，于28°C和150rpm的條件下培養(yǎng)4d;(3)從發(fā)酵液中分離得到具有高表面活性的環(huán)脂肽表面活性；用6M的NaOH將發(fā)酵液的 pH值調(diào)至8.0。于lOOOOrpm下離心分離20min，收集上清液(Xia et al.，2011);采用截留分 子量為lOOOODa的膜對水相溶液進(jìn)行過濾，進(jìn)一步除去雜質(zhì)，收集透過液；用等體積的乙酸乙酯對去除菌體、雜質(zhì)的發(fā)酵液再萃取2次，合并萃取液;將其放入旋 轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，于50°C下蒸發(fā)去除溶劑，即得粗提物；采用濕法裝填層析柱的方式，將200-300目硅膠與氯仿混合，裝填入玻璃層析柱2.5 X 400mm)，使娃膠裝填率達(dá)80%左右;待娃膠沉降后，按2ml/min的流速加入100ml氯仿對柱 子進(jìn)行平衡處理，封閉層析柱，靜置過夜，備用；用少量甲醇溶解粗提物，與少量200-300目硅膠混合，拌勻，將其置于50°C下烘干;將硅 膠與少量氯仿混合，加入層析柱，即可完成進(jìn)樣;依次采用氯仿、氯仿/乙酸乙酯(9:1，v/v) 的混和液、氯仿/乙酸乙酯(8:2, v/v)的混和液、氯仿/乙酸乙酯(7:3, v/v)的混和液、氯仿/ 乙酸乙酯(6:4，v/v)的混和液、氯仿/乙酸乙酯(5:5，v/v)的混和液、氯仿/乙酸乙酯(4:6，v/ v)的混和液、氯仿/乙酸乙酯(3: 7, v/v)的混和液、氯仿/乙酸乙酯(2:8，v/v)的混和液、氯 仿/乙酸乙酯(1:9，v/v)的混和液、乙酸乙酯作為流動相進(jìn)行洗脫，每種流動相的洗脫體積 為300ml，洗脫流速為0.5ml/min;從氯仿/乙酸乙酯(9:1，v/v)的流動相開始收集洗脫液，每 20ml收集1管，用紫外分光光度計在200-280nm的范圍內(nèi)掃描吸收波長，將波形相近的樣品 合并;真空蒸發(fā)去除溶劑，可得初步純化的樣品；用甲醇溶解初步純化的樣品；采用反相液相色譜制備生物表面活性劑的純品(Das et al.,2009);液相色譜制備的條件為:Waters 600 HPLC，色譜柱為Xterra Prep RP18 OBD， 以甲醇/水(1:1，v/v)的混合物為流動相，流速為0.5yL/min，檢測器波長為256nm。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種環(huán)脂肽表面活性劑的生物合成方法，其特征在于，所述海 水取自浙江舟山普陀?xùn)|極海域。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種環(huán)脂肽表面活性劑的生物合成方法，其特征在于，所述 SKY-200B型全溫?fù)u床采購于上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司。
【文檔編號】C07K1/36GK106086152SQ201610649056
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年8月10日 公開號201610649056.9, CN 106086152 A, CN 106086152A, CN 201610649056, CN-A-106086152, CN106086152 A, CN106086152A, CN201610649056, CN201610649056.9
【發(fā)明人】肖英平, 吳酬飛, 楊華, 錢鳴蓉
【申請人】浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院