一株嗜熱產(chǎn)表面活性劑石油降解菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于功能微生物篩選、應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株嗜熱產(chǎn)表面活性劑石 油降解菌及其應(yīng)用，即一株可產(chǎn)具有乳化作用的生物表面活性劑，并且具有石油烴降解能 力的菌株，以及其產(chǎn)生的生物表面活性劑的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 微生物表面活性劑是在一些特定的微生物在其代謝過(guò)程中分泌出的具有一定表 面活性的代謝產(chǎn)物，如糖脂、多糖脂、脂肽或中性類脂衍生物等。生物表面活性劑中含有既 親水又親油的基團(tuán)的物質(zhì)，相較于化學(xué)表面活性劑，龐大而復(fù)雜的化學(xué)結(jié)構(gòu)使得表面活性 和乳化能力更強(qiáng)，可發(fā)酵生產(chǎn)是典型的"綠色"工藝，低毒性、環(huán)境友好等特性，同時(shí)還有助 于石油降解微生物的生長(zhǎng)。常見(jiàn)的微生物表面活性劑有鼠李糖脂、槐糖脂、海藻糖脂等。
[0003] 石油降解菌是指可以以石油烴為單一碳源生長(zhǎng)的微生物，既可以分解長(zhǎng)碳鏈結(jié)構(gòu) 復(fù)雜的烷烴，也可降解一些較難被分解利用的芳香烴。一直以來(lái)，尋找更高效的石油烴降解 菌一直是石油污染治理以及微生物領(lǐng)域研究者的重要工作，而能夠在一些極端條件下比如 低溫和高溫保持高活性的石油烴降解菌更是研究者們研究的重中之重。
[0004] 申請(qǐng)人在大港油田重度石油污染土壤中分離出了一株地衣芽孢桿菌Y-1，經(jīng) 16sRNA鑒定為Bacillus licheniformis.。該菌株能利用石油經(jīng)作為單一碳源生長(zhǎng)，且有較 高的石油降解能力，且可生產(chǎn)性能優(yōu)秀的表面活性劑，有很高的研究及應(yīng)用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明涉及一株用于生產(chǎn)表面活性劑和石油污染修復(fù)的地衣芽孢桿菌(Bacillus 11(^611丨€〇現(xiàn)丨8)，命名為￥-1，該菌株的保藏號(hào)為:0610：如.11019，于2015年6月26日保藏 于北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所的中國(guó)微生物菌種保藏管理 委員會(huì)普通微生物中心。
[0006] 該菌株具有較強(qiáng)石油烴降解能力并可產(chǎn)乳化性能優(yōu)異的表面活性劑。
[0007] 經(jīng)優(yōu)化培養(yǎng)條件，菌株Y-1最佳原油降解條件為Nacl 30g，NH4N03lg，KH2P〇4〇.5g， 1(2冊(cè)〇418，1 83〇4〇.58,0&(：12〇.28，蒸餾水比，？!17.0，溫度55°(3，原油18，接種量10%。
[0008] 經(jīng)優(yōu)化培養(yǎng)條件后，菌株Y-1對(duì)原油的降解率在培養(yǎng)的第五天達(dá)到60.2%。
[0009] 最佳表面活性劑生產(chǎn)條件為葡萄糖2%，，NH4N031%，KH2P〇4〇.5%，K2HP〇4l%， MgS〇4〇 · 5 %，CaCl2〇 · 2%，pH7 · 5，溫度55°C。
[0010] 純化之后的表面活性劑可在室溫下將純水的表面張力由70.87mN/m降至34.62mN/ m，臨界膠束濃度為0.37/L，其乳化性能超過(guò)普通化學(xué)表面活性劑，最大產(chǎn)量為1.324g/L，培 養(yǎng)30h便可達(dá)到最大值
【附圖說(shuō)明】
[0011] 圖1菌株Y-1在優(yōu)化條件下的石油烴降解試驗(yàn)中，添加 Y-1的實(shí)驗(yàn)組和未添加 Y-1的 對(duì)照組培養(yǎng)5天后石油烴提取物氣質(zhì)分析結(jié)果
[0012] 圖2菌株Y-1所產(chǎn)表面活性劑提純物對(duì)柴油的乳化效果圖
[0013] 圖3溫度對(duì)菌株Y-1產(chǎn)表面活性劑的影響
【具體實(shí)施方式】
[0014] 以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明菌株進(jìn)行詳細(xì)描述
[0015] 實(shí)施例1:菌株篩選及鑒定
[0016] 菌種來(lái)源為采油區(qū)污染土壤，土壤樣品取自天津市大港油田采油機(jī)附近重度石油 污染土壤，由于采油平臺(tái)緊鄰渤海，土壤鹽堿度較高。取10g土樣浸泡于100ml無(wú)菌水中，充 分震蕩后靜置，取上清液l〇ml置于200ml基礎(chǔ)無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，在30°C、120rpm的恒溫?fù)u床 上培養(yǎng)5天，由于土樣屬于重度石油污染土壤，土壤浸泡液中含有一定量的石油烴，故在富 集培養(yǎng)中無(wú)需再添加石油作為碳源。取5天后的培養(yǎng)液涂于T培養(yǎng)基平板上，30°C培養(yǎng)24h， 出現(xiàn)菌落后反復(fù)劃線分離培養(yǎng)，得到純菌株后移至T試管培養(yǎng)基4°C保存。菌種鑒定采用通 用引物27F和1541R進(jìn)行16sRNA基因的PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為1 OOyL: Taq (5U/yL) 0.8yL; 10 X PCR Buffer(Mg2+Plus)10yL;dNTP Mixture(2.5mmol/L/each)8yL;模板DNA 2.5ng;引物 1 (10ymol/L)2yL，引物2(10ymol/L)2yL;超純水補(bǔ)足至lOOyl^PCR條件:95°C5min;95°Clmin， 58 〇Clmin,-0.5〇C/cycle,72〇Clmin,20cycles；72 〇C5min；94〇Clmin,48〇Clmin,72°Clmin, 15 Cycles;72°C5min;4°C保存。PCR產(chǎn)物測(cè)序由華大基因科技公司完成。以通用引物27F和 1541R進(jìn)行16sRNA基因的PCR擴(kuò)增，菌株Y-1的16sRNA全序列長(zhǎng)度為1467bp，依照BLAST進(jìn)行 同源性對(duì)比，至少與50種地衣芽孢桿菌具有99%的同源性。因此初步鑒定Y-1為地衣芽孢桿 菌。
[0017] 實(shí)施例2:菌株Y-1石油烴降解最佳條件及降解率
[0018] 將菌株接種至液體T培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)48h，取10ml菌液3000r/min離心15min，小 心倒掉上清液，用無(wú)菌水清洗菌體后離心，如此反復(fù)清洗3次，去除菌體中的培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)物 質(zhì)，將菌體接種至盛有200ml含原油lg的原油培養(yǎng)基的三角瓶中，按不同條件培養(yǎng)5天。培養(yǎng) 結(jié)束后用50ml正己烷對(duì)三角瓶中的石油進(jìn)行反復(fù)萃取至完全回收，萃取液依次過(guò)無(wú)水硫酸 鈉(600°C煅燒6h后放正己烷中液封保存）除水和0.45μπι濾膜過(guò)濾除菌體，然后置于40°C水 浴鍋中將正己烷蒸干，通風(fēng)櫥中繼續(xù)自然風(fēng)干8小時(shí)，稱重。石油烴降解率按下式計(jì)算:添加 菌液的實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)5日后石油烴重Ml，降解前石油烴重M2，石油烴降解率τι，
[0019]
[0020] 最適溫度實(shí)驗(yàn)：培養(yǎng)溫度分別為 25°C、30°C、35°C、40°C、45°C、50°C、55°C、60°C， NaCl 濃度 10g/L，pH7.5。
[0021] 最適 NaCl 濃度實(shí)驗(yàn)：NaCl 濃度分別為 0g/L、10g/L、20g/L、30g/L、40g/L、50g/L、 60g/L、70g/L，溫度 30°C，pH7 · 5。
[0022] 最適 pH 實(shí)驗(yàn):pH 分別為5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10，恥(：1濃度1(^/1，溫 度 30°C。
[0023] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該菌株最適生長(zhǎng)溫度為40°C，在35°C_55°C范圍內(nèi)都具有良好的生 長(zhǎng)情況，最適石油烴降解溫度為551。？!!為7時(shí)培養(yǎng)體系中菌體量濃度最大、石油降解率最 高，在pHIO條件下仍具有一定生長(zhǎng)能力，說(shuō)明Y-l對(duì)于pH較高的堿性環(huán)境具有一定得耐受 力。NaCl濃度為30g/L時(shí)Y-1的菌體量和石油降解率都達(dá)到最高，所以最適NaCl濃度為30g/ L，但該菌在10g/L-50g//L的范圍內(nèi)都能保持較高的生長(zhǎng)能力和石油降解能力，且NaCl濃度 為70g/L時(shí)仍具有一定的生長(zhǎng)能力，說(shuō)明該菌對(duì)于尚鹽度的環(huán)境具有$父尚耐受能力。
[0024]氣質(zhì)分析結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)Y-1降解后的石油烴中C8-C40各組分都有明顯減少，其中 C10-C16的降解效果最明顯，降解效率均超過(guò)90%，而C17-到C40的降解效率也都在60%以 上，說(shuō)明Y-1對(duì)較長(zhǎng)且較復(fù)雜碳鏈的石油烴也具備較強(qiáng)降解能力 [0025]實(shí)驗(yàn)結(jié)果為
[0026] 實(shí)施例3:菌株Y-1產(chǎn)表面活性劑最佳條件及乳化效果
[0027] 在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，影響菌株Y-1分泌表面活性劑的最主要誘因是溫度的改變，故選取 30°C、35°C、40°C、45°C、50°C、55°C、60°C進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，具體培養(yǎng)條件如下：葡萄糖2 %，， NH4NO3I %，KH2P〇4〇 · 5%，K2HP〇4l %，MgS〇4〇 · 5%，CaChO · 2%，pH7 · 5。取發(fā)酵液的上清液IL， 連續(xù)兩次用等體積的乙酸乙酷萃取，合并有機(jī)相，將萃取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除有機(jī)溶劑后，得 到表面活性劑的濃縮液，在40°C烘箱中烘干后得到黃色粉末，即為表面活性劑產(chǎn)品。實(shí)驗(yàn)結(jié) 果表明55°C時(shí)達(dá)到最大產(chǎn)量，為1.324g/L。
[0028] 向裝有4ml無(wú)菌水的A試管中加入1.5ml 0#柴油和0.5ml表面活性劑濃縮液，渦旋 振蕩2min后靜置24h，另做不添加表面活性劑濃縮液的對(duì)照組B，結(jié)果顯示，添加 lml表面活 性劑濃縮液的A試管相較未添加表面活性劑濃縮液的B試管液體總體積沒(méi)有增加，水層體積 減少，油層體積增加且渾濁，表面活性劑使水和柴油混合形成乳化層，而未添加表面活性劑 濃縮液的對(duì)照組B試管在振蕩后的2min中內(nèi)就回到油水完全分離的狀態(tài)。Y-1產(chǎn)生的表面活 性劑具有良好的乳化效果，可幫助石油烴很好的溶解到水中形成乳濁液。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一株嗜熱產(chǎn)表面活性劑石油降解菌及其應(yīng)用，其特征在于，所述嗜熱產(chǎn)表面活性劑 石油降解菌，命名為Y-1，經(jīng)鑒定為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)，該菌株的保 藏號(hào)為:CGMCC No. 11019。2. 如權(quán)利1所述的嗜熱產(chǎn)表面活性劑石油降解菌在石油污染修復(fù)以及生物表面活性劑 的生產(chǎn)中應(yīng)用。3. 如權(quán)利2所述的一株嗜熱產(chǎn)表面活性劑石油降解菌及其應(yīng)用，其特征在于，該菌株的 最佳石油降解培養(yǎng)條件為Nac1 30g，NH4N031g，KH2P〇4〇 · 5g，K2HP〇41g，MgS〇4〇 · 5g，CaCl20 · 2g， 蒸餾水1L，pH7.0，溫度55°C，原油1g，接種量10%。4. 如權(quán)利2所述的一株嗜熱產(chǎn)表面活性劑石油降解菌及其應(yīng)用，其特征在于，該菌株生 產(chǎn)表面活性劑條件為葡萄糖2%，，NH4N031%，KH2P〇4〇.5%，K2HP〇4l%，MgS〇4〇.5%， CaChO· 2 %，pH7 · 5，溫度55°C。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一株地衣芽孢桿菌(Bacillus？licheniformis)Y-1及其嗜熱產(chǎn)表面活性劑、石油降解等特性的應(yīng)用。該菌株的保藏號(hào)為：CGMCC？No.11019。本發(fā)明的Y-1菌株用于石油烴污染物降解及生產(chǎn)胞外乳化劑。本發(fā)明中嗜熱菌Y-1對(duì)高溫、pH、高鹽度都有很高耐受力，具有對(duì)各種條件嚴(yán)格的石油污染環(huán)境廣泛的適應(yīng)能力，在高溫、高鹽度、高pH環(huán)境下具有較強(qiáng)石油烴降解能力。菌株Y-1生產(chǎn)的生物乳化劑具有產(chǎn)量高、活性穩(wěn)定、乳化性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，低成本工業(yè)提取即可生產(chǎn)出應(yīng)用性極強(qiáng)的表面活性劑產(chǎn)品，可應(yīng)用于石油污染修復(fù)、提高石油采收率等，具有較強(qiáng)開(kāi)發(fā)潛力。CGMCC No.1101920150626
【IPC分類】B09C1/10, C12P1/04, C12N1/20, C12R1/10
【公開(kāi)號(hào)】CN105441351
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510429214
【發(fā)明人】劉博群, 鞠美庭, 劉金鵬, 吳文韜
【申請(qǐng)人】南開(kāi)大學(xué)
【公開(kāi)日】2016年3月30日
【申請(qǐng)日】2015年7月21日