一株青霉素鈉降解菌pc-2及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物降解處理領(lǐng)域，設(shè)及一株青霉素鋼降解菌及其分離鑒定，W及該 降解菌在青霉素鋼上的降解應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 青霉素菌渣是我國抗生素發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)中的主要廢料，據(jù)初步估算，2009年中國 產(chǎn)生的各類抗生素菌渣約130萬噸。2002年農(nóng)業(yè)部、衛(wèi)生部、國家藥品監(jiān)督管理局等部口把 抗生素菌渣列為禁止在飼料和動物飲用水中使用的藥物品種目錄中；2008年，國家環(huán)保部 又將抗生素菌渣列入《國家危險廢物名錄》中。針對抗生素菌渣產(chǎn)量大、處理難度大等現(xiàn)實 問題，W及《制藥工業(yè)污染防治技術(shù)政策》（征求意見稿）中提出的"鼓勵開發(fā)發(fā)酵菌渣在 生產(chǎn)工藝中的再利用技術(shù)、無害化處理技術(shù)、綜合利用技術(shù)"政策建議，如何實現(xiàn)抗生素菌 渣的合理有效利用與安全處理成為了我國環(huán)境保護和制藥產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的難題。
[0003] 抗生素菌渣堆肥技術(shù)不僅能有效利用菌渣中大量蛋白質(zhì)、有機質(zhì)、有機酸，還能降 解菌渣中殘留的抗生素，因此是抗生素菌渣處理處置技術(shù)的研究熱點。鑒于堆肥處理若不 能將抗生素殘留完全去除，堆肥產(chǎn)品施用后會導(dǎo)致一定的生態(tài)環(huán)境風(fēng)險，有些學(xué)者開始在 堆肥過程中接種微生物菌劑，從而提高堆肥物料的降解速率。
[0004] 抗生素降解菌的篩選、分離是生物法處理抗生素污染物的關(guān)鍵。迄今為止，國內(nèi)外 一些研究學(xué)者已篩選到多株抗生素降解菌，但青霉素降解菌較少，本研究設(shè)及的降解菌是 首次發(fā)現(xiàn)的能夠降解青霉素鋼的馨合球菌屬煙ielatococcussp.)細(xì)菌。
【發(fā)明內(nèi)容】
陽〇化]為了克服目前抗生素菌渣中抗生素難W有效分解，導(dǎo)致青霉素菌渣不能高效利 用，產(chǎn)生大量污染等問題，提供一株能高效分解青霉素鋼的降解菌W及該降解菌在降解青 霉素鋼方面的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明的目的通過W下技術(shù)方案實現(xiàn)
[0007] 1.本發(fā)明提供一株青霉素鋼降解菌PC-2,該青霉素鋼降解菌屬馨合球菌屬，分類 命名馨合球菌Chelatococcussp.，保藏編號為CGMCCNo.1. 15283,于2015年6月11日保 藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、。
[0008] 保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所。
[0009] 所述青霉素鋼降解菌PC-2生物學(xué)特征如下：在LB固體培養(yǎng)基上PC-2呈圓形，中 間凸起，乳白色，表面光滑，不透明，邊緣整齊，菌落直徑約為1~2mm。在透射電子顯微鏡下 觀察，PC-2為短桿狀，1. 96ymX0. 92ym，端生鞭毛。
[0010] 2.本發(fā)明還提供鑒定青霉素鋼降解菌PC-2的方法，該方法W引物F-primer27F 和R-primer1492R對待檢測細(xì)菌基因組進行PCR擴增，得到1475bp的擴增產(chǎn)物，說明該待 檢測細(xì)菌為青霉素鋼降解菌PC-2 ;
[0011] 其中，引物F-primer27F的序列為：5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 '; R-primerl492R的序列為：5' -TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'。
[0012] 1475bp的擴增產(chǎn)物為16SrDNA序列PCR分析結(jié)果。
[0013] 3.本發(fā)明還提供分離青霉素鋼降解菌PC-2的方法，包括：（1)取青霉素菌渣與豬 糞的混合堆肥樣品，添加到含蒸饋水S角瓶中，36°C-38°C，130r/min-160r/min在搖床上 震蕩使樣品與水充分混合；其中，青霉素菌渣與豬糞的混合堆肥樣品中菌渣和堆肥的質(zhì)量 比例為1:2;混合堆肥與蒸饋水的比例為1:8-1:10g/mL
[0014] (2)采用梯度稀釋法將混合液稀釋至濃度約為0. 1~1.化pm時，用移液槍分別移 取200yL的樣品涂布到青霉素鋼添加濃度為1000 ppm的LB固體培養(yǎng)基上于36-37°C恒溫 培養(yǎng)2d-3d，待培養(yǎng)基長出菌落后，挑取單菌落劃線分離培養(yǎng)多次后獲得單菌株。
[0015] 4.本發(fā)明還提供上述1所述的青霉素鋼降解菌在青霉素殘留降解中的應(yīng)用，該應(yīng) 用通過將青霉素降解菌？(：-2按接種量2%-18%接種于青霉素鋼初始濃度為100-120099111 的青霉素殘留物中，向其中加入碳源、氮源，調(diào)整抑值為6-10;其中，碳源包括葡萄糖、麥芽 糖和薦糖的一種或多種混合物，濃度為0. 3% -0. 5% ;氮源包括蛋白腺、酵母膏和尿素的一 種或多種混合物，濃度為0. 3% -0. 5%。
[0016] 5.上述4提供的青霉素鋼降解菌在青霉素殘留降解中的應(yīng)用，其中，所述接種量 為14%，青霉素鋼初始濃度為10化pm，向青霉素殘留物中加入的碳源為濃度為0. 4%的葡 萄糖，氮源為濃度為0. 4%的蛋白腺，調(diào)整抑范圍在6. 0~7. 0。
[0017] 6.上述4或5所述的應(yīng)用，其中，青霉素降解菌PC-2取自對數(shù)生長期，在接種 前先經(jīng)過離屯、，然后W憐酸鹽緩沖溶液淋洗，所述憐酸鹽緩沖溶液為0. 2mol/LNa肥P04 39. 0血，0. 2mol/L化2HP0461. 0血，pH7. 0,121°C滅菌20min。
[0018] 7.本發(fā)明還提供一種青霉素鋼降解劑，該降解劑包括青霉素鋼降解菌PC-2。
[0019] 8.上述7提供的青霉素鋼降解劑在青霉素鋼降解上的應(yīng)用，使用時，按照青霉素 降解菌？(：-2接種量2%-18%接種于青霉素鋼初始濃度為100-120化9111的青霉素殘留物 中，向其中加入碳源、氮源，調(diào)整抑值為6-10;其中，碳源包括葡萄糖、麥芽糖和薦糖的一 種或多種混合物，濃度為0. 3% -0. 5% ;氮源包括蛋白腺、酵母膏和尿素的一種或多種混合 物，濃度為0. 3% -0. 5%。
[0020] 9.上述8所述的應(yīng)用，其中，所述接種量為14%，青霉素鋼初始濃度為l(K)ppm，向 青霉素殘留物中加入的碳源為濃度為0. 4%的葡萄糖，氮源為濃度為0. 4%的蛋白腺，調(diào)整 抑范圍在6.0~7.0。
[0021] 有益效果： W22] 1.本研究設(shè)及的降解菌是首次發(fā)現(xiàn)的能夠降解青霉素鋼的馨合球菌屬 (Chelatococcussp.)細(xì)菌，填補了目前研究的空白。
[0023] 2.通過優(yōu)化降解菌降解青霉素鋼過程中反應(yīng)參數(shù)，青霉素鋼降解菌PC-2降解青 霉素鋼的降解率最高可達到99. 32%，相較于一般10%的降解率有了明顯提高，說明本發(fā) 明提供的青霉素降解菌PC-2是一種高效率降解菌。利用此菌制成的青霉素鋼降解劑可W 大范圍應(yīng)用于抗生素發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)中，可W大大降低環(huán)境污染，提高經(jīng)濟效率。
【附圖說明】
[0024] 圖1為PC-2在LB平板上的菌落形態(tài) 陽O巧]圖2為PC-2透射電鏡圖片
[0026] 圖3為PC-2掃描電鏡圖片
[0027] 圖4為PC-2系統(tǒng)發(fā)育樹圖片
[0028] 圖5為青霉素鋼溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線圖
[0029] 圖6為PC-2生長曲線圖片
[0030] 圖7為PC-2降解曲線圖片 陽0川圖8為PC-2降解動力學(xué)線性回歸方程
[0032] 圖9為碳源對PC-2降解青霉素鋼的降解效果影響圖 陽03引圖10為氮源對PC-2降解青霉素鋼的降解效果影響圖
[0034] 圖11為接種量對PC-2降解青霉素鋼的降解效果影響圖
[0035] 圖12為底物濃度對PC-2降解青霉素鋼的降解效果影響圖
[0036] 圖13為抑值對PC-2降解青霉素鋼的降解效果影響圖
【具體實施方式】
[0037] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步說明，下列實施例中未注明具體條件的實驗方 法，通常按照本領(lǐng)域的公知手段。 陽03引 LB培養(yǎng)基：膜蛋白腺lOg，酵母提取物5g，化CllOg，蒸饋水1000血，m°c滅菌 20min。LB固體培養(yǎng)基加15g瓊脂粉。
[0039]基礎(chǔ)培養(yǎng)基：（畑4) 2S〇42g，NaH2P〇4〇. 5g，K2HPO4O. 5g，M拆〇4〇. 2g，蒸饋水定容至1000血，121°C滅菌20min。 W40] 上述兩種培養(yǎng)基分別用于降解菌PC-2生長曲線和降解曲線的繪制。
[0041]憐酸鹽緩沖溶液：0.2mol/LN址2P0439.0血，0.2mol/L化2HP0461. 0血，pH7. 0， 121°C滅菌 20min。
[0042] 主要實驗儀器及試劑：生物培養(yǎng)箱（Thermo);離屯、機（eppen化of,Centri^ge 5415R);恒溫?fù)u床燈hermo,MAXQ4000);高效液相色譜儀Waters2695(美國Waters公 司）。
[0043] 乙臘（色譜純，德國Merck公司）；青霉素鋼標(biāo)準(zhǔn)品（>98%，美國Sigma公司）；甲 酸（分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）；實驗用水為MilliQ水（電導(dǎo)率18. 2MQ^cm)。 PCR試劑均購自TaKaRa公司。
[0044] 實施例1
[0045] 青霉素鋼降解菌PC-2的篩選與鑒定
[0046] (一）青霉素鋼降解菌PC-2的分離篩選
[0047] 取IOg青霉素菌渣（河北石家莊河北制藥）與豬糞（江蘇省南京市橫溪鎮(zhèn)）的 混合堆肥樣品（堆肥地點為江蘇省南京市南京農(nóng)業(yè)大學(xué)牌樓），菌渣與豬糞的質(zhì)量比例為 1:2)，添加到含蒸饋水90血的250血的S角瓶中，37°C，150r/min在搖床上震蕩使樣品與水 充分混合。采用梯度稀釋法將混合液稀釋至濃度約為0.1~1.化pm時，用移液槍分別移取 200yL的樣品涂布到1000 ppm青霉素鋼添加量的LB固體培養(yǎng)基上，于37°C恒溫培養(yǎng)2d，待 培養(yǎng)基長出菌落后，挑取單菌落劃線分離培養(yǎng)約4次后獲得單菌株。將得到的純種轉(zhuǎn)入LB 試管斜面上，37 °C恒溫培養(yǎng)4她，放入4°C冰箱內(nèi)保存。
[0048](二）青霉素鋼降解菌PC-2的形態(tài)學(xué)和分子學(xué)鑒定 W例用透射電子顯微鏡（TEM)觀察細(xì)胞形態(tài)特征，菌株鑒定采用形態(tài)觀察和16SrDNA序列PCR分析方法。
[0050] 菌株P(guān)C-2在LB固體培養(yǎng)基上呈圓形，中間凸起，乳白色，表面光滑，不透明，邊緣 整齊，菌落直徑約為1~2mm(如圖1所示）。在透射及掃描電子顯微鏡下觀察，PC-2為短 桿狀，1. 96ymX0. 92ym,端生鞭毛（如圖2、3所不）。
[0051] 16SrDNA擴增的引物為F-primer27F:5 ' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 '; R-primer1492R:5' -TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'。擴增產(chǎn)物由生工生物工程（上海） 有限公司測序，利用BLAST程序與NCBI中的已知序列進行比對分析。
[0052]PC-2 與Qielatococcusdaeguensis(T)K106及Qielatococcussambhunathii(T) 聚類在一個系統(tǒng)