一種石油降解菌的篩選方法及由其篩選的菌制備石油降解菌菌劑的方法和該菌劑的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種石油降解菌的篩選方法，所述方法中使用的富集培養(yǎng)基、篩選培養(yǎng)基和馴化培養(yǎng)基是以石油作為唯一碳源的培養(yǎng)基，具體的是在培養(yǎng)基中加入石油和聚山梨酯-80的增溶液。本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明以非離子表面活性劑聚山梨脂-80作為增溶劑，能夠提高石油在水中的溶解效果，解決石油在培養(yǎng)基中溶解難的問題；本發(fā)明真正做到以石油為唯一碳源，在石油降解菌的初篩、馴化及純化等過程中培養(yǎng)基均以石油聚山梨酯-80增溶液為碳源；本發(fā)明專利中石油降解菌的篩選包括初篩、馴化及純化等過程，菌株在石油濃度梯度逐漸升高的馴化培養(yǎng)基中，逐漸被馴化，適應(yīng)以石油為單一碳源的生長繁殖，提高其對石油的耐受力及其降解效率。
【專利說明】一種石油降解菌的篩選方法及由其篩選的菌制備石油降解 菌菌劑的方法和該菌劑的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及石油污染土壤微生物修復(fù)【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種石油降解菌的篩選 方法及由其篩選的菌制備石油降解菌菌劑的方法和該菌劑在石油污染土壤修復(fù)中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 石油是一種含有多種烴類（正烷烴、支鏈烷烴、芳香烴、脂環(huán)烴）及少量其他有機(jī) 物（硫化物、氮化物、環(huán)烷酸類等）的復(fù)雜混合物，是人類最主要的能源之一。在石油的開采 與運(yùn)輸過程中常伴隨石油的泄漏，造成環(huán)境污染。特別是多環(huán)芳經(jīng)（Polycyclic Aromatic Hydrocar-bon，PAHs)，由于其生物可利用度差、半衰期較長，并且大多具有致畸、致癌和致 突變效應(yīng)，因此成為人類健康的巨大威脅。我國石油工業(yè)發(fā)展迅速，但也隨之帶來嚴(yán)重的環(huán) 境污染問題，有近千萬畝的耕地受到不同程度的石油烴污染。因此，對石油烴污染土壤進(jìn)行 修復(fù)、恢復(fù)其生態(tài)功能以保障農(nóng)產(chǎn)品安全是一項十分迫切的任務(wù)。
[0003] 石油污染土壤的修復(fù)技術(shù)已經(jīng)成為當(dāng)前環(huán)保領(lǐng)域一個新的研究熱點(diǎn)。近年來，國 內(nèi)外已在物理法、化學(xué)法、生物法治理石油污染方面取得了一定的進(jìn)展，傳統(tǒng)的物理法、化 學(xué)法不僅費(fèi)用昂貴，且易造成二次污染，其應(yīng)用受到一定限制。生物法具有處理效果好、費(fèi) 用低、對環(huán)境影響小、無二次污染及應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)倍受關(guān)注。生物法主要包括微生物修 復(fù)、植物修復(fù)及植物一微生物聯(lián)合修復(fù)三種。微生物修復(fù)技術(shù)是利用土壤中的土著微生物 或向污染環(huán)境補(bǔ)充經(jīng)馴化的高效微生物，在優(yōu)化的環(huán)境條件下，加速分解污染物，修復(fù)被污 染的土壤。生物法是迄今為止修復(fù)石油污染土壤比較好的一種方法，其具有廣闊市場和發(fā) 展前景。
[0004] 近年來，利用微生物修復(fù)石油污染土壤的技術(shù)得到了研究者的重視，該技術(shù) 的關(guān)鍵點(diǎn)是提高微生物的降解活性，其一是增強(qiáng)自然界固有的但速度緩慢的微生物降 解過程，其二是通過生物反應(yīng)器使污染物與微生物接觸，強(qiáng)化降解過程，提高降解速 率。目前，實驗室的研究工作集中在針對某類油份，篩選高效降解菌群，優(yōu)化降解條件和 降解手段的探索上，對于實際石油污染場地也已進(jìn)行了部分應(yīng)用研究。王卓穎等（王 卓穎，王磊，桂曉琳，等.高效降解機(jī)油微生物的篩選及除油效果初探[J].工業(yè)微 生物，2006, 36(1) :26-29,33.)從多處受石油及其制品污染的土壤中篩選到六株對高 濃度機(jī)油等相關(guān)石油制品具有降解能力的微生物菌種，對該六株菌種的單獨(dú)和混合降 解機(jī)油的效果進(jìn)行了研究，并考察了營養(yǎng)成分對機(jī)油降解的影響。胡長慶等（胡長 慶，鮑玉婷，徐偉，等.絲狀石油降解真菌的篩選及其降解特性研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科 學(xué)，2010, 38(4) : 1664-1666, 1742.)從寧波象山港及鎮(zhèn)海煉化廠卸油區(qū)域受原油污染的海 水和土壤中篩選絲狀石油降解真菌，并對其降解原油的速度、耐油性、接種量、氮磷營養(yǎng)需 求等進(jìn)行了探討。邱清華等（邱清華，哈尼帕，鄧紹云，等.石油降解混合菌劑的篩選及 降解條件研究[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2013, 29(3) :184-189.)從油污土壤、含油廢水及原油中 經(jīng)富集馴化分離得到細(xì)菌68株、真菌15株，放線菌6株；將所分離的菌株通過初篩、復(fù)篩及 兩兩混合拮抗實驗，篩選得到兩組石油高效降解混合菌劑，其對石油的降解率均超過60%。 姚偉靜（姚偉靜.高效除油微生物菌株的篩選及表面活性劑增強(qiáng)生物降解石油烴的研究 [D].重慶：重慶大學(xué)，2007.)從長期被石油烴類污染的土壤中經(jīng)過富集培養(yǎng)、馴化分離篩 選出一株降解能力超過60%的菌株，對其進(jìn)行鑒定、紫外誘變實驗、優(yōu)化培養(yǎng)基，使其對石 油烴的降解率明顯提高，并研究了微生物降解石油烴的最適條件和表面活性劑TweenSO、 SDS、APG、JFC對石油烴生物降解的影響及機(jī)理。
[0005] 國外主要針對海洋沉積物石油污染物、原油泄漏造成的環(huán)境污染等方面，進(jìn)行了 大量的研究工作。有關(guān)報道指出，阿拉斯加王子海灣油輪泄漏事件造成了大面積污染， Jon E. Llidstrom等對其投加高效降解菌進(jìn)行生物修復(fù)，使得環(huán)境質(zhì)量明顯提高，此事件 被譽(yù)為生物修復(fù)最成功的例子。同時，美國各環(huán)保局、重要機(jī)構(gòu)都大力倡導(dǎo)推行生物修 復(fù)技術(shù)° R. Margesin(R. Margesin. Potential of cold-adapted microorganisms for bioremediation of oil-polluted alpine soils. Biodeterioration&Biodegradation 2000(46) :3?10.)從高山污染的土壤中篩選出石油降解菌種進(jìn)行馴化。歐洲各國非常 重視生物修復(fù)技術(shù)，認(rèn)為生物修復(fù)技術(shù)是治理大面積污染區(qū)域的一種非常有效的方法。 Salanitro經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)被石油污染的土壤對生物均有毒性，污染初期幾乎沒有動物 可以生存,作物的產(chǎn)量只有正常產(chǎn)量的0?25%，但生物法修復(fù)過的土壤，動植物則均不受 影 口向。S. S. Zinjdard (S. S. Zinjarde, A. A. Pant. Hydrocarbon degraders from torpical marine environment[J]· Marine Pollution Bulletin，2002, 44:118-121.)研究了原 油濃度對菌株降解原油中飽和烴的影響，其濃度由〇. 5%升至3%時，飽和烴的降解率由 92 % 降至 15 %，下降幅度顯著。K. S. M. Rahman 等（K. S. M. Rahman, J. Thahira-Rahman, P. Lakshmanaperumalsamy, et al. Towards efficient crude oil degradation by a mixed bacterial consortium[J]· Bioresource Technology, 2002, 85:257-261.)也發(fā)現(xiàn)當(dāng)原油 濃度由1%升至10%時，混和菌種對原油的降解率由78%降至52%。
[0006] 發(fā)酵是微生物在人工培養(yǎng)環(huán)境中生長并形成代謝產(chǎn)物的過程，也是微生物菌劑生 產(chǎn)的常用方法。19世紀(jì)已經(jīng)出現(xiàn)生產(chǎn)酵母菌體的工業(yè)發(fā)酵過程，并采用了通氣和補(bǔ)料的技 術(shù)；20世紀(jì)70年代出現(xiàn)了微生物單細(xì)胞蛋白的生產(chǎn)。微生物修復(fù)石油污染土壤技術(shù)的大 面積推廣就需要大量的微生物菌劑，國內(nèi)對石油降解菌劑的研究只開展了實驗室小規(guī)模培 養(yǎng)，沒有實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。目前微生物活菌制劑類產(chǎn)品主要有固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵兩種方 式。固態(tài)發(fā)酵是微生物在沒有或基本沒有游離水的固態(tài)基質(zhì)上的發(fā)酵方式，固態(tài)基質(zhì)中氣、 液、固三相并存，即多孔性的固態(tài)基質(zhì)中含有水和水不溶性物質(zhì)。固態(tài)發(fā)酵相對于液態(tài)發(fā)酵 有以下缺點(diǎn)：限于耐低水活性的微生物，選擇少；發(fā)酵速率慢，周期長；天然原料成分復(fù)雜， 有時變化，影響產(chǎn)量質(zhì)量；工藝參數(shù)難檢測和控制；產(chǎn)品少，操作消耗勞力多，強(qiáng)度大。本發(fā) 明專利通過液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)對石油降解菌劑的生產(chǎn)進(jìn)行研究，確定了石油降解菌劑高密 度液態(tài)深層發(fā)酵生產(chǎn)工藝技術(shù)。專利號為CN 103898000 A主要涉及一種石油降解菌劑的 液態(tài)發(fā)酵方法。
[0007] 雖然已有報道關(guān)于以石油烴為唯一碳源篩選石油降解菌的方法，但大多是以單一 石油烴或幾種石油烴及其中間產(chǎn)物為碳源進(jìn)行篩選，其培養(yǎng)環(huán)境與石油污染土壤中石油烴 種類繁多的實際情況相差甚遠(yuǎn)，因此該條件下篩選的菌種在實際石油污染土壤中的生存能 力、降解效率不夠理想，將其用于石油污染土壤的治理工程中的實際效果得不到保障。專 利號為CN 102517279 A主要涉及一種利用三親配對接合并以石油烴為唯一碳源篩選攜帶 石油烴降解基因的可自轉(zhuǎn)移廣宿主質(zhì)粒的方法，主要以正辛烷、苯、甲苯、水楊酸、鄰苯二酚 等石油烴為底物篩選微生物；專利號為CN 102533928 A主要涉及一種以多環(huán)芳烴為底物 的降解菌的篩選方法，是以單一的四環(huán)多環(huán)芳烴芘或三環(huán)的多環(huán)芳烴菲等為底物篩選降解 菌。
[0008] 由于石油的粘度為124. 12mm2/s，溶解度小，若不經(jīng)處理以石油為碳源制備培養(yǎng) 基，其溶解量較小，石油基本都粘在容器壁上。專利號為CN 102021132 A主要涉及一種石 油污染土壤生物修復(fù)菌劑的篩選及修復(fù)方法，是以原油為底物。在該實驗中，在IOOml培養(yǎng) 基中分別加入l、2、3g石油，在沒有增溶劑的情況下，原油幾乎不溶解，培養(yǎng)基中石油的濃 度很低，石油基本都掛在培養(yǎng)器皿壁上，雖然石油被加入培養(yǎng)基中，但沒有被溶解，因此石 油起到的作用很小。
[0009] 現(xiàn)有石油降解菌的篩選技術(shù)大部分以實驗室研究為主，以某種單組份石油烴為底 物進(jìn)行菌種篩選，再以該石油烴為底物評價所篩選菌種的降解效果，也僅僅是實驗室小試 規(guī)模的菌種培養(yǎng)，而將石油降解菌實現(xiàn)菌劑工業(yè)化生產(chǎn)的技術(shù)報道較少。有專利報道（CN 103898000 A) "一種石油降解菌劑的液態(tài)發(fā)酵方法"介紹了石油降解菌劑的液態(tài)發(fā)酵方法， 相對于固體發(fā)酵來講，發(fā)酵周期縮短了約60- 84小時，但該方法是通過油脂類碳源和快速 碳源相結(jié)合來提高菌體得率和提高菌株降油特性，在其發(fā)酵培養(yǎng)基中以豆油替代了石油。 由于豆油更容易被微生物用作碳源，且其生物可利用度遠(yuǎn)高于石油，因此這種在發(fā)酵過程 中沒有石油參與的菌劑生產(chǎn)方法，不利于保證菌劑在石油污染土壤治理工程應(yīng)用中的生存 能力和降解效率。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種以石油聚山梨酯-80增溶 液為唯一碳源篩選石油降解菌，并在石油濃度依次升高的馴化培養(yǎng)基中進(jìn)行接種馴化，最 后在最高石油濃度的馴化培養(yǎng)基中取菌種再在含油平板上劃線培養(yǎng)，挑取單菌落轉(zhuǎn)接LB 斜面，直至得到形態(tài)單一的純化石油降解菌落并由其制備石油降解菌菌劑。
[0011] 本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0012] 一種石油降解菌的篩選方法，所述方法中使用的富集培養(yǎng)基、篩選培養(yǎng)基和馴化 培養(yǎng)基是以石油作為唯一碳源的培養(yǎng)基，具體的是在培養(yǎng)基中加入石油和聚山梨酯-80的 增溶液。
[0013] 一種石油降解菌的篩選方法，具體的步驟為：
[0014] 1)菌源的采集
[0015] 取煉油廠常年被石油污染的土壤作為石油降解土著菌菌源。
[0016] 2)石油降解土著菌的初篩
[0017] (1)取作為石油降解土著菌菌源的土壤樣品，加入盛有無菌水的錐形瓶中，置于振 蕩培養(yǎng)箱中室溫振蕩〇. 5?2h，振蕩頻率為200rpm ;
[0018] (2)從步驟（1)的錐形瓶中取上清液，接入富集培養(yǎng)基，在溫度30°C、轉(zhuǎn)速175rpm 搖床上振蕩培養(yǎng)48h。取培養(yǎng)后的富集液涂布到篩選培養(yǎng)基平板上，30°C恒溫培養(yǎng)48h。
[0019] 3)馴化
[0020] 用接種環(huán)挑取上述初篩得到的多株單一菌株在馴化培養(yǎng)基中進(jìn)行接種馴化。
[0021] 4)菌種的純化
[0022] (1)取馴化后的培養(yǎng)液，在含油平板上劃線，30°C培養(yǎng)7d ;
[0023] (2)從含油平板上挑取單菌落轉(zhuǎn)接LB斜面，30°C培養(yǎng)24h ;
[0024] (3)由LB斜面再次接種含油平板；
[0025] (4)重復(fù)上述步驟，直至得到形態(tài)單一的純化菌落；
[0026] (5)純化后的菌落接種于菌種保藏培養(yǎng)基斜面上，30°C培養(yǎng)24h后，保存于4°C冰 箱中，備用。
[0027] 在上述方案的基礎(chǔ)上，步驟3)馴化具體的為：
[0028] 先用接種環(huán)挑取初篩得到的多株單一菌株分別接種到IOOmL馴化培養(yǎng)基A中，培 養(yǎng)一個周期（在溫度30°C、轉(zhuǎn)速175rpm恒溫振蕩下培養(yǎng)7d為一個周期），然后從馴化培養(yǎng) 基A中取出IOmL培養(yǎng)液加入到90mL的馴化培養(yǎng)基B中，培養(yǎng)一個周期。再從馴化培養(yǎng)基B 中取出IOmL培養(yǎng)液加入到90mL馴化培養(yǎng)基C中，培養(yǎng)一個周期。從馴化培養(yǎng)基C中取出 IOmL培養(yǎng)液加入到90mL馴化培養(yǎng)基D中，培養(yǎng)一個周期。從馴化培養(yǎng)基D中取出IOmL培 養(yǎng)液加入到90mL的馴化培養(yǎng)基E中，培養(yǎng)一個周期，從馴化培養(yǎng)基A到馴化培養(yǎng)基E，石油 濃度梯度逐級升高。
[0029] 在上述方案的基礎(chǔ)上，所述富集培養(yǎng)基為：
[0030] 含石油〇.〇25g當(dāng)量的石油聚山梨酯-80增溶液，NaCl 0.5g，（NH4)2SO4 O.lg， MgSO4 · 7H20 0· 025g，KNO3 0· 24g，KH2PO4 0· 57g，pH 值 7· 2,蒸餾水 1000mL，0. IMPa，121 °C， 高壓蒸汽滅菌20min。
[0031] 所述篩選培養(yǎng)基為：
[0032] 含石油0· 025g當(dāng)量的石油聚山梨酯-80增溶液，瓊脂20g，NaCl 0· 5g，（MM)2SO4 0· lg，MgSO4 · 7H20 0· 025g，KNO3 0· 24g，KH2PO4 0· 57g，pH 值 7· 2,蒸餾水 1000mL，0. IMPa， 121°C，高壓蒸汽滅菌20min。
[0033] 所述馴化培養(yǎng)基A為：
[0034] 含石油0· 025g當(dāng)量的石油聚山梨酯-80增溶液，NaCl 10g，NH4NO3 lg，KH2PO4 0· 5g，K2HPO4 · 3H20 I. 31g，MgSO4 · 7H20 I. 03g，CaCl2 0· 2g，微量元素溶液 lmL，蒸餾水 lOOOmL，pH 值 7· 2,0· IMPa，121°C，高壓蒸汽滅菌 20min。
[0035] 所述馴化培養(yǎng)基B為：
[0036] 含石油0· 050g當(dāng)量的石油聚山梨酯-80增溶液，NaCl 10g，NH4NO3 lg，KH2PO4 0· 5g，K2HPO4 · 3H20 I. 31g，MgSO4 · 7H20 I. 03g，CaCl2 0· 2g，微量元素溶液 lmL，蒸餾水 lOOOmL，pH 值 7· 2,0· IMPa，121°C，高壓蒸汽滅菌 20min。
[0037] 所述馴化培養(yǎng)基C為：
[0038] 含石油0.075g當(dāng)量的石油聚山梨酯-80增溶液，NaCl 10g，NH4NO3 lg，KH2PO4O. 5g， K2HPO4 · 3H20 I. 31g，MgSO4 · 7H20 I. 03g，CaCl2 0· 2g，微量元素溶液 lmL，蒸餾水 lOOOmL，pH 值 7·2,0· lMPa，121°C，高壓蒸汽滅菌 20min。
[0039] 所述馴化培養(yǎng)基D為：
[0040] 含石油0· IOOg當(dāng)量的石油聚山梨酯-80增溶液，NaCl 10g，NH4NO3 lg，KH2PO4 0· 5g，K2HPO4 · 3H20 I. 31g，MgSO4 · 7H20 I. 03g，CaCl2 0· 2g，微量元素溶液 lmL，蒸餾水 lOOOmL，pH 值 7· 2,0· IMPa，121°C，高壓蒸汽滅菌 20min。
[0041] 所述馴化培養(yǎng)基E為：
[0042] 含石油0· 125g當(dāng)量的石油聚山梨酯-80增溶液，NaCl 10g，NH4NO3 lg，KH2PO4 0· 5g，K2HPO4 · 3H20 I. 31g，MgSO4 · 7H20 I. 03g，CaCl2 0· 2g，微量元素溶液 lmL，蒸餾水 lOOOmL，pH 值 7· 2,0· IMPa，121°C，高壓蒸汽滅菌 20min。
[0043] 所述含油平板用培養(yǎng)基為：
[0044] 含石油0· 125g當(dāng)量的石油聚山梨酯-80增溶液，NaCl 10g，NH4NO3 lg，KH2PO4 0.5g，K2HP04.3H20 1.31g，MgS04.7H20 1.03g，CaCl2 0.2g，微量元素溶液 lmL，瓊脂 20g，蒸 餾水100〇1^4!1值7.2,0.1]\0^，1211：，高壓蒸汽滅菌2〇1^11。
[0045] LB斜面用培養(yǎng)基為：
[0046] 蛋白胨 10g，酵母粉 5g，NaCl 5g，瓊脂 20g，蒸餾水 lOOOmL，pH 值 7·0,0· IMPa， 121°C，高壓蒸汽滅菌20min。
[0047] 微量元素溶液：MnS04 39 . 9mg，ZnSO4 · 7H20 42. 8mg，F(xiàn)eCl2 · 4Η2015· 73mg，CuSO4 40mg，蒸饋水 lOOOmL。
[0048] 菌種保藏培養(yǎng)基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaC15g，瓊脂20g，蒸餾水lOOOmL，pH值 7· 2 ?L 4,0· IMPa，121°C，高壓蒸汽滅菌 20min。
[0049] 一種石油降解菌菌劑，由上述制備的石油降解菌制備而成，具體的制備方法為：
[0050] (1)將純化得到的石油降解菌株分別單獨(dú)接種在種子培養(yǎng)基中，經(jīng)一級種子、二級 種子、種子罐逐步擴(kuò)大培養(yǎng)后，作為液體種子；液體種子的菌體密度達(dá)到l*l〇 7cfu ;
[0051] (2)將各個單一菌株的液體種子混合接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，通氣量為1:1，攪拌轉(zhuǎn)速 為80rpm，總接種量為10% (V/V);
[0052] (3)發(fā)酵罐培養(yǎng)4小時起，每2小時取樣一次，樣品染色用顯微鏡觀察，并用細(xì)菌計 數(shù)器檢測菌體密度。直至菌體密度大于l*l〇 9cfu，即得到石油降解菌菌劑。
[0053] 在上述方案的基礎(chǔ)上，一級種子米用固態(tài)培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為30°C，培 養(yǎng)24小時；二級種子為液態(tài)培養(yǎng)基搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為30°C，轉(zhuǎn)速175rpm，培養(yǎng)10-12 小時；種子罐培養(yǎng)條件為液體培養(yǎng)基攪拌培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為30°C恒溫，轉(zhuǎn)速80rpm，通氣量 1:1 ;
[0054] 其中：液體培養(yǎng)基為每1000ml無菌水中含有：含石油0. 125g當(dāng)量的石油聚山梨 酯-80增溶液，牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，pH值為7，121°C滅菌20min ;固體培養(yǎng)基是 在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入20g瓊脂。
[0055] 發(fā)酵培養(yǎng)基為：每1000ml無菌水中含有：含石油0. 125g當(dāng)量的石油聚山梨酯-80 增溶液，葡萄糖 3g;玉米漿 25g;牛肉膏 3.5g;KH2P04 3g;MgS04*7H20 0.6g;CaCl2 0.03g， pH 值為 7，121°C 滅菌 30min。
[0056] 本發(fā)明的有益效果是：
[0057] (1)本發(fā)明以非離子表面活性劑聚山梨酯-80脂-80( 土溫80)作為增溶劑，先制 備石油聚山梨酯-80增溶液，再將一定量的石油聚山梨酯-80增溶液加入到培養(yǎng)基中，能夠 提高石油的溶解效果，解決石油在培養(yǎng)基中溶解難的問題。
[0058] (2)真正做到以石油為唯一碳源，在石油降解菌的初篩、馴化及純化等過程中培養(yǎng) 基均以石油聚山梨酯-80增溶液為碳源。在菌株馴化過程中馴化培養(yǎng)基中的石油濃度梯度 逐漸升高，菌株逐漸馴化而適應(yīng)含油培養(yǎng)基，因此該條件下篩選的菌種在實際土壤中的生 存能力、降解效率得到提高，將其用于石油污染土壤治理工程中的實際效果得到保障。
[0059] (3)本發(fā)明專利中石油降解菌的篩選包括初篩、馴化及純化等過程，菌株在石油濃 度梯度逐漸升高的馴化培養(yǎng)基中，逐漸被馴化，適應(yīng)以石油為單一碳源的生長繁殖，提高其 對石油的耐受力及其降解效率。
[0060] (4)本發(fā)明在獲得高效降解菌株后，采用液體發(fā)酵技術(shù)，并以石油碳源和高效碳源 相結(jié)合的形式，實現(xiàn)菌劑的工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明真正實現(xiàn)了石油降解菌劑的工業(yè)化生產(chǎn)，從 而滿足石油降解菌劑在石油污染土壤治理工程中的應(yīng)用。另外，這種在發(fā)酵過程中全程有 石油參與的菌劑生產(chǎn)方法，既能節(jié)約生產(chǎn)時間，又能保證菌劑在石油污染土壤治理工程應(yīng) 用中的生存能力和降解效率。

【專利附圖】

【附圖說明】：
[0061] 圖1為馴化后各菌株的菌體生長量和石油降解率。

【具體實施方式】
[0062] 以下結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0063] 實施例1
[0064] 高效石油降解菌菌株的篩選
[0065] 1、石油降解土著菌菌源的采集
[0066] 取山東省勝利油田煉油廠儲油罐附近常年被石油污染的土壤作為石油降解土著 菌菌源。采樣方法：用小鐵鍬取厚度為IOcm的土壤樣品，多點(diǎn)采樣后混合均勻，取土樣3kg 帶回實驗室備用。
[0067] 2、石油聚山梨酯-80增溶液制備
[0068] 表面活性劑在水溶液中達(dá)到臨界膠束濃度（critical micelle concentration，CMC)后，一些水不溶性或微溶性物質(zhì)在膠束溶液中的溶解度可顯著增加， 形成透明膠體溶液，這種作用稱為增溶（solubilization)。聚山梨酯-80(聚氧乙烯脫水山 梨醇脂肪酸脂）為水溶性非離子表面活性劑，由于非離子表面活性劑不受電解質(zhì)和PH值影 響，不具有殺菌性能，且其HLB值（親水親油平衡值，hydrophile-lipophiIe balance, HLB) 為15.0適合做增溶劑，適合做水包油（0/W)型乳化液。聚山梨酯-80可提高石油在水體中 的溶解度，使其在石油聚山梨酯-80增溶液中分散更均勻，本發(fā)明以石油梨酯-80增溶液為 唯一碳源制備各種微生物培養(yǎng)基。原油濃度和聚山梨酯-80濃度對增溶液乳化效果的影響 如表1、表2所不。
[0069] 表1原油濃度對增溶劑乳化效果的影響
[0070]

【權(quán)利要求】
1. 一種石油降解菌的篩選方法，其特征在于所述方法中使用的富集培養(yǎng)基、篩選培養(yǎng) 基和馴化培養(yǎng)基是以石油作為唯一碳源的培養(yǎng)基，具體的是在培養(yǎng)基中加入石油和聚山梨 酯-80的增溶液。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種石油降解菌的篩選方法，其特征在于所述石油和聚山梨 酯-80的增溶液中石油質(zhì)量濃度為2%，聚山梨酯-80質(zhì)量濃度為4%，剩余為水。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種石油降解菌的篩選方法，其特征在于具體的步驟 為： 1) 菌源的采集 取煉油廠常年被石油污染的土壤作為石油降解土著菌菌源。 2) 石油降解土著菌的初篩 (1) 取作為石油降解土著菌菌源的土壤樣品，加入盛有無菌水的錐形瓶中，置于振蕩培 養(yǎng)箱中室溫振蕩0. 5?2h，振蕩頻率為200rpm ; (2) 從步驟（1)的錐形瓶中取上清液，接入富集培養(yǎng)基，在溫度30°C、轉(zhuǎn)速175rpm搖床 上振蕩培養(yǎng)48h。取培養(yǎng)后的富集液涂布到篩選培養(yǎng)基平板上，30°C恒溫培養(yǎng)48h。 3) 馴化 用接種環(huán)挑取上述初篩得到的多株單一菌株在馴化培養(yǎng)基中進(jìn)行接種馴化。 4) 菌種的純化 (1) 取馴化后的培養(yǎng)液，在含油平板上劃線，30°C培養(yǎng)7d ; (2) 從含油平板上挑取單菌落轉(zhuǎn)接LB斜面，30°C培養(yǎng)24h ; (3) 由LB斜面再次接種含油平板； (4) 重復(fù)上述步驟，直至得到形態(tài)單一的純化菌落； (5) 純化后的菌落接種于菌種保藏培養(yǎng)基斜面上，30°C培養(yǎng)24h后，保存于4°C冰箱中， 備用。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種石油降解菌的篩選方法，其特征在于步驟3)馴化具體的 為： 先用接種環(huán)挑取初篩得到的多株單一菌株分別接種到l〇〇mL馴化培養(yǎng)基A中，培養(yǎng)一 個周期（在溫度30°C、轉(zhuǎn)速175rpm恒溫振蕩下培養(yǎng)7d為一個周期），然后從馴化培養(yǎng)基A 中取出10mL培養(yǎng)液加入到90mL的馴化培養(yǎng)基B中，培養(yǎng)一個周期。再從馴化培養(yǎng)基B中取 出10mL培養(yǎng)液加入到90mL馴化培養(yǎng)基C中，培養(yǎng)一個周期。從馴化培養(yǎng)基C中取出10mL 培養(yǎng)液加入到90mL馴化培養(yǎng)基D中，培養(yǎng)一個周期。從馴化培養(yǎng)基D中取出10mL培養(yǎng)液 加入到90mL的馴化培養(yǎng)基E中，培養(yǎng)一個周期，從馴化培養(yǎng)基A到馴化培養(yǎng)基E，石油濃度 梯度逐級升高。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種石油降解菌的篩選方法，其特征在于： 所述富集培養(yǎng)基為： 含石油0? 025g當(dāng)量的石油聚山梨酯-80增溶液，NaCl 0? 5g，（NH4)2S040. lg，MgS04 *7H20 0? 025g，KN030 . 24g，KH2P040. 57g，pH 值 7. 2,蒸餾水 lOOOmL，0? IMPa，121°C，高壓蒸汽滅菌 20min〇 所述篩選培養(yǎng)基為： 含石油0? 025g當(dāng)量的石油聚山梨酯-80增溶液，瓊脂20g，NaClO. 5g，（NH4)2S040. lg， MgS04 ? 7H20 0? 025g，KN030 . 24g，KH2P040. 57g，pH 值 7. 2,蒸餾水 1000mL，0. IMPa，121°C，高 壓蒸汽滅菌20min。 所述馴化培養(yǎng)基A為： 含石油0. 025g當(dāng)量的石油聚山梨酯-80增溶液，NaCl 10g，NH4N03lg，KH2P040. 5g， K2HP04 ? 3H20 1. 31g，MgS04 ? 7H20 1. 03g，CaCl20. 2g，微量元素溶液 lmL，蒸餾水 1000mL，pH 值 7.2,0. lMPa，121°C，高壓蒸汽滅菌 20min。 所述馴化培養(yǎng)基B為： 含石油0. 050g當(dāng)量的石油聚山梨酯-80增溶液，NaCl 10g，NH4N03lg，KH2P040. 5g， K2HP04 ? 3H20 1. 31g，MgS04 ? 7H20 1. 03g，CaCl20. 2g，微量元素溶液 lmL，蒸餾水 1000mL，pH 值 7.2,0. lMPa，121°C，高壓蒸汽滅菌 20min。 所述馴化培養(yǎng)基C為： 含石油0. 075g當(dāng)量的石油聚山梨酯-80增溶液，NaCl 10g，NH4N03lg，KH2P040. 5g， K2HP04 ? 3H20 1. 31g，MgS04 ? 7H20 1. 03g，CaCl20. 2g，微量元素溶液 lmL，蒸餾水 1000mL，pH 值 7.2,0. lMPa，121°C，高壓蒸汽滅菌 20min。 所述馴化培養(yǎng)基D為： 含石油0. 100g當(dāng)量的石油聚山梨酯-80增溶液，NaCl 10g，NH4N03lg，KH2P040. 5g， K2HP04 ? 3H20 1. 31g，MgS04 ? 7H20 1. 03g，CaCl20. 2g，微量元素溶液 lmL，蒸餾水 1000mL，pH 值 7.2,0. lMPa，121°C，高壓蒸汽滅菌 20min。 所述馴化培養(yǎng)基E為： 含石油0. 125g當(dāng)量的石油聚山梨酯-80增溶液，NaCl 10g，NH4N03lg，KH2P040. 5g， K2HP04 ? 3H20 1. 31g，MgS04 ? 7H20 1. 03g，CaCl20. 2g，微量元素溶液 lmL，蒸餾水 1000mL，pH 值 7.2,0. lMPa，121°C，高壓蒸汽滅菌 20min。 所述含油平板用培養(yǎng)基為： 含石油0. 125g當(dāng)量的石油聚山梨酯-80增溶液，NaCl 10g，NH4N03lg，KH2P040. 5g， K2HP04 ? 3H20 1. 31g，MgS04 ? 7H20 1. 03g，CaCl20. 2g，微量元素溶液 lmL，瓊脂 20g，蒸餾水 1000mL，pH 值 7. 2,0. IMPa，121°C，高壓蒸汽滅菌 20min。 LB斜面用培養(yǎng)基為： 蛋白胨 l〇g，酵母粉 5g，NaCl 5g，瓊脂 20g，蒸餾水 1000mL，pH 值 7. 0,0? IMPa，121 °C，高 壓蒸汽滅菌20min。 微量元素溶液：MnS0439. 9mg，ZnS04 ? 7H20 42. 8mg，F(xiàn)eCl2 ? 4H2015. 73mg，CuS0440mg，蒸 餾水 1000mL。 菌種保藏培養(yǎng)基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaC15g，瓊脂20g，蒸餾水1000mL，pH值7. 2? 7.4,0. lMPa，121°C，高壓蒸汽滅菌 20min。
6. -種石油降解菌，其特征在于由權(quán)利要求1-5任一項所述的方法制備而得。
7. -種石油降解菌菌劑，其特征在于：由權(quán)利要求6所述的石油降解菌制備而成。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的石油降解菌菌劑，其特征在于具體的制備方法為： (1) 將純化得到的石油降解菌株接種在種子培養(yǎng)基中，經(jīng)一級種子、二級種子、種子罐 逐步擴(kuò)大培養(yǎng)后，作為液體種子；液體種子的菌體密度達(dá)到l*l〇7cfu ; (2) 將各個單一菌株的液體種子混合接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，通氣量為1:1，攪拌轉(zhuǎn)速為 80rpm，總接種量為10% (V/V); (3)發(fā)酵罐培養(yǎng)4小時起，每2小時取樣一次，樣品染色用顯微鏡觀察，并用細(xì)菌計數(shù)器 檢測菌體密度。直至菌體密度大于l*109cfu，即得到石油降解菌菌劑。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的石油降解菌菌劑，其特征在于： 一級種子采用固態(tài)培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為30°C，培養(yǎng)24小時；二級種子為液態(tài) 培養(yǎng)基搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為30°C，轉(zhuǎn)速175rpm，培養(yǎng)10-12小時；種子罐培養(yǎng)條件為液體 培養(yǎng)基攪拌培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為30°C恒溫，轉(zhuǎn)速80rpm，通氣量1:1 ; 其中：液體培養(yǎng)基為每l〇〇〇ml無菌水中含有：含石油0. 125g當(dāng)量的石油聚山梨酯-80 增溶液，牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，pH值為7,121°C滅菌20min ;固體培養(yǎng)基是在液體 培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入20g瓊脂。 發(fā)酵培養(yǎng)基為：每l〇〇〇ml無菌水中含有：含石油0. 125g當(dāng)量的石油聚山梨酯-80增溶 液，葡萄糖 3g ;玉米漿 25g ;牛肉膏 3. 5g ;KH2P043g ;MgS04 ? 7H20 0? 6g ;CaCl20. 03g，pH 值為 7,121°C 滅菌 30min。
10. 權(quán)利要求6-9任一項制備的石油降解菌菌劑用于修復(fù)石油污染的土壤。
【文檔編號】B09C1/10GK104388312SQ201410757447
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年12月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月10日
【發(fā)明者】鄭慶柱, 田俠, 崔德杰, 崔春月 申請人:青島農(nóng)業(yè)大學(xué)