專利名稱：一種微衛(wèi)星文庫(kù)篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種文庫(kù)篩選方法，特別是涉及一種微衛(wèi)星文庫(kù)篩選方法。
背景技術(shù)：
微衛(wèi)星也稱簡(jiǎn)單序列重復(fù)或SSR，是植物基因組廣泛分布的一類重復(fù)序列，因其具有豐富的變異，開(kāi)發(fā)的分子標(biāo)記具有多態(tài)性高、穩(wěn)定性好、操作簡(jiǎn)單(基于PCR技術(shù))及呈現(xiàn)共顯性遺傳等優(yōu)點(diǎn)，目前已經(jīng)廣泛用于植物遺傳多樣性研究、品種鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建及標(biāo)記輔助選擇育種。但微衛(wèi)星標(biāo)記的開(kāi)發(fā)過(guò)程比較復(fù)雜，需要消耗大量的人力、物力和財(cái)力，因此提高微衛(wèi)星的開(kāi)發(fā)效率尤為重要。近20多年發(fā)展起來(lái)的微衛(wèi)星開(kāi)發(fā)技術(shù)包括傳統(tǒng)的基因組文庫(kù)篩選法、基于錨定PCR技術(shù)的開(kāi)發(fā)方法、單引物延伸富集法、選擇雜交富集法，另外還有生物信息學(xué)法和轉(zhuǎn)移擴(kuò)增法，這兩種方法必須要求序列信息清楚或在親緣關(guān)系相近物種才能使用。目前上述幾種方法應(yīng)用最廣泛的是選擇雜交富集法，其余方法由于操作難度大 (單引物延伸法)、開(kāi)發(fā)效率低(傳統(tǒng)基因組文庫(kù)篩選法)、特異性差(基于錨定PCR技術(shù)法)等缺點(diǎn)已經(jīng)很少有人使用；選擇雜交技術(shù)的基本步驟是首先用含微衛(wèi)星的探針與片段化的植物基因組DNA雜交，再將與探針雜交的含微衛(wèi)星的DNA片段洗脫下來(lái)，連接到克隆載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌構(gòu)建成微衛(wèi)星富集文庫(kù)。為保證更高的開(kāi)發(fā)效率還要對(duì)富集文庫(kù)進(jìn)行一次篩選，篩選方法包括同位素雜交篩選法和用含有微衛(wèi)星的序列PCR擴(kuò)增篩選法兩種，最后將篩選得到陽(yáng)性克隆測(cè)序，含有微衛(wèi)星序列的側(cè)翼設(shè)計(jì)特異引物，在相應(yīng)植物中進(jìn)行擴(kuò)增驗(yàn)證。整個(gè)微衛(wèi)星開(kāi)發(fā)過(guò)程影響開(kāi)發(fā)效率的因素包括微衛(wèi)星富集文庫(kù)的冗余度、假陽(yáng)性率及缺少側(cè)翼序列無(wú)法設(shè)計(jì)引物的無(wú)效微衛(wèi)星克隆數(shù)；冗余度的高低取決于富集文庫(kù)的構(gòu)建質(zhì)量，而假陽(yáng)性率的高低及無(wú)效微衛(wèi)星克隆的多少取決于富集文庫(kù)的篩選技術(shù)。同位素探針雜交篩選技術(shù)就是用同位素標(biāo)記的微衛(wèi)星探針與微衛(wèi)星富集文庫(kù)的克隆進(jìn)行雜交，具體步驟為首先，將富集文庫(kù)的克隆轉(zhuǎn)移到尼龍膜，并進(jìn)行紫外交聯(lián)或用氫氧化鈉將克隆片段固定在膜上；接著，在分子雜交儀中放入同位素標(biāo)記好的微衛(wèi)星探針溶液，將固定好的尼龍膜移入雜交儀在合適溫度下雜交，雜交完畢后取出尼龍膜進(jìn)行放射自顯影，有雜交斑的陽(yáng)性克隆送測(cè)序公司測(cè)序。這種方法具有以下缺點(diǎn)1、具有危險(xiǎn)性，同位素放射性強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程對(duì)研究人員身體產(chǎn)生危害；2、操作受時(shí)間限制，同位素具有半衰期，因此操作只能在特定時(shí)間進(jìn)行；3、無(wú)法淘汰側(cè)翼序列短的無(wú)效微衛(wèi)星克隆，增加測(cè)序成本；4、技術(shù)要求高，操作復(fù)雜；5、無(wú)法篩除冗余克隆。普通PCR篩選技術(shù)就是用一段微衛(wèi)星重復(fù)序列如(AG)S與克隆載體特異引物組成引物對(duì)，以富集文庫(kù)中的克隆為模板進(jìn)行菌液PCR，如果能夠擴(kuò)增出條帶則為陽(yáng)性克隆，送測(cè)序公司測(cè)序。這種方法具有以下缺點(diǎn)1、假陽(yáng)性率較高；2、無(wú)法淘汰側(cè)翼序列短的無(wú)效微衛(wèi)星克隆，增加測(cè)序成本。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，本發(fā)明提供一種微衛(wèi)星文庫(kù)篩選方法，該方法解決了同位素雜交篩選技術(shù)的危害性、時(shí)限性、無(wú)效微衛(wèi)星克隆無(wú)法淘汰及操作復(fù)雜的缺陷；解決了普通PCR篩選技術(shù)的假陽(yáng)性率高、無(wú)法淘汰無(wú)效微衛(wèi)星克隆的缺陷；更解決了兩種篩選技術(shù)無(wú)法識(shí)別冗余克隆的缺點(diǎn)。
權(quán)利要求
1. 一種微衛(wèi)星文庫(kù)篩選方法，其特征在于，該方法包括如下步驟步驟A，錨定PCR篩選含微衛(wèi)星的陽(yáng)性克?。?al，所述錨定PCR的擴(kuò)增體系(10 μ 1)為DNA模板1 μ 1轉(zhuǎn)化菌液10XPCR Buffer1μ 1dNTPs200 μ MTaq酶0. 75個(gè)單位 pMD-18載體引物(正向或反向)5pmol微衛(wèi)星錨定引物5pmol滅菌超純水_補(bǔ)足到10 μ 1a2，所述錨定PCR的擴(kuò)增循環(huán)程序?yàn)?br> 2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種微衛(wèi)星文庫(kù)篩選方法，其特征在于，步驟C中的所述重復(fù)區(qū)長(zhǎng)度為12 60個(gè)堿基長(zhǎng)度。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種微衛(wèi)星文庫(kù)篩選方法，其特征在于，所述微衛(wèi)星的錨定引物為PCT6-KKVRVRV (CT) 6K = G/T, V = G/C/A, R = G/A PCA6-KKVRVRV (CA) 6K = G/T, V = C/T, R = G/A pMD-18載體引物 正向-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG 反向-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種微衛(wèi)星文庫(kù)篩選方法，該方法為錨定PCR篩選含微衛(wèi)星的陽(yáng)性克隆；陽(yáng)性克隆片段大小PCR檢測(cè)；確定側(cè)翼序列短的無(wú)效微衛(wèi)星克隆與冗余克隆。與普通PCR篩選技術(shù)相比，本發(fā)明選用微衛(wèi)星錨定引物比普通微衛(wèi)星序列引物更能精確判定微衛(wèi)星位置；與同位素雜交篩選技術(shù)相比，本發(fā)明則不受時(shí)間制約，技術(shù)簡(jiǎn)單易于掌握，且無(wú)危害性，同樣由于錨定引物和擴(kuò)增程序的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)使側(cè)翼短的無(wú)效微衛(wèi)星克隆最大程度淘汰掉。
文檔編號(hào)C40B30/00GK102242194SQ201110120739
公開(kāi)日2011年11月16日 申請(qǐng)日期2011年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月10日
發(fā)明者王天宇, 白俊艷, 石云素, 賈小平, 黎裕 申請(qǐng)人:河南科技大學(xué)