專利名稱：：一種篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種使用質(zhì)譜分析(MS)篩選變體肽的方法。本發(fā)明還涉及實(shí)施該方法的系統(tǒng)和試劑盒。
背景技術(shù)：
：質(zhì)譜分析被證明是測(cè)定包括生物分子在內(nèi)的多種分子的分子結(jié)構(gòu)最有價(jià)值的工具，而且在當(dāng)今被廣泛地應(yīng)用。該技術(shù)包括在檢驗(yàn)中用電子或其他的高能量粒子轟擊分子種(molecularspecies),其引起分子的電離和斷裂，從而，導(dǎo)致改變了電荷和質(zhì)量的電離粒子的廣譜化。溫和電離技術(shù)，例如電噴射，能夠引起電離但基本不引起分子的斷裂。該技術(shù)在生產(chǎn)多電荷種類的蛋白質(zhì)和肽中尤其具有價(jià)值。如通常所實(shí)行的，產(chǎn)生的復(fù)雜質(zhì)量/電荷光譜轉(zhuǎn)變成電腦產(chǎn)生的去巻積光譜(deconvolutedspectrum),該光譜具有各多肽的單質(zhì)峰。目前質(zhì)譜分析的進(jìn)展主要集中于去巻積分析所需的最有效的軟件的開發(fā)。盡管這方面的技術(shù)在繼續(xù)改善，但是，這仍然是最需要的并且是每個(gè)特定的測(cè)定過程中費(fèi)時(shí)的部分。去巻積分析的應(yīng)用已經(jīng)成為闡明預(yù)先未知的或不確定的分子結(jié)構(gòu)的質(zhì)譜分析中所不可缺少的，但是業(yè)已證明，其難以簡(jiǎn)化目前的方法以顯著地減少執(zhí)行所需的時(shí)間。質(zhì)譜分析還可以用于檢測(cè)牽涉嚴(yán)重紊亂的變體蛋白質(zhì)和多肽。例如，血紅蛋白的多肽亞單位的多種變體或突變體形式是已知的，并且能夠?qū)е赂鞣N形式的貧血癥，而且許多這種突變是僅僅1個(gè)氨基酸。文獻(xiàn)中己經(jīng)記載了這些蛋白質(zhì)的基本分子結(jié)構(gòu)和氨基酸序列，以及編碼它們的DNA中的相應(yīng)突變。質(zhì)譜分析還可以用于遺傳代謝紊亂(IMD)的群體篩選(Chase"Clin.Chem.,49，1797-1817，2003)。在人類中，血紅蛋白病是最常見的遺傳紊亂。這些紊亂源于球蛋白基因的突變，并且，業(yè)已描述了超過800種血紅蛋白變體(Huisman"a/，HumanHaemoglobinVariants,2ndEdn.，Augusta,GA:SickleCellAnemiaFoundation1998)，其中有很多沒有臨床意義。血紅蛋白變體通常檢測(cè)作為麻醉前篩選或新生兒以及出生前篩選方案。導(dǎo)致臨床癥狀的變體還可以進(jìn)行鑒定以作為診斷研究的部分。近期，己經(jīng)擴(kuò)展至目前新生兒和出生前篩選方案的健康啟動(dòng)項(xiàng)目，已經(jīng)顯著地增加了工作量(TheNHSPlanJuly2000,commandpaper4818)。它們也導(dǎo)致了對(duì)專門用于那些認(rèn)為臨床上顯著的血紅蛋白變體的檢測(cè)系統(tǒng)的需要。兩個(gè)方案具有不同的目標(biāo)。出生前篩選的目標(biāo)是鑒定那些對(duì)胎兒具有遺傳風(fēng)險(xiǎn)的血紅蛋白病攜帶者。因此，目標(biāo)是檢測(cè)鐮刀形血紅蛋白的存在或缺乏和卩地中海貧血癥或與它們互相作用的血紅蛋白變體中的一種，例如，HbC,HbDPunjab，Hb0紐、HbLepore和HbE。另外，還包括3種潛在的臨床顯著的其他的條件，即S|3地中海貧血癥、胎兒血紅蛋白癥(HPFH)的遺傳性持續(xù)和a-0地中海貧血癥(alphazerothalassaemia)。新生兒篩選的目標(biāo)是對(duì)個(gè)體進(jìn)行鐮刀形紅細(xì)胞貧血病和e地中海貧血癥的早期鑒定，以啟動(dòng)治療。經(jīng)典的血紅蛋白病生化診斷使用電泳技術(shù)或陽(yáng)離子交換色譜產(chǎn)生的表型信息(WorkingPartyOfGeneralHaematologyTaskForce,1998)。這些形成了目前篩選技術(shù)的基礎(chǔ)；然而，它們是緩慢的、費(fèi)力的且非特異性的。并且，它們是非靶向的，并因此將檢測(cè)篩選方案所不需要的血紅蛋白變體。對(duì)于群體篩選，電噴射四極場(chǎng)質(zhì)譜分析(MS)具有更快的速度、更強(qiáng)的特異性和更好的經(jīng)濟(jì)效益。大多數(shù)公開的使用MS表征血紅蛋白病的方法，業(yè)已使用全血掃描來確定完整的球蛋白鏈的質(zhì)量，隨后進(jìn)行胰蛋白酶消化和肽的分析(Wild""/，BloodCells,MoleculesandDiseases,27,691-704，2001)。這種方法有能夠明確地表征大多數(shù)球蛋白突變。文獻(xiàn)WildWa/,2001,(上文)詳述了MS方法，尤其是第693頁(yè)和圖2，第697頁(yè)的方法部分，顯示了用于正常的和一個(gè)特定的變體P血紅蛋白鏈的去巻積ESI質(zhì)譜。Wild"a/,2001,(上文)的第698頁(yè)的表1列舉了，核苷酸編碼三聯(lián)體中的單個(gè)堿基改變所產(chǎn)生的多種質(zhì)量和氨基酸改變，該改變可以通過MS方法測(cè)定。國(guó)際專利申請(qǐng)WO2004/090552中，一種簡(jiǎn)化的MS方法用于檢測(cè)|3球蛋白鏈的鐮刀形紅細(xì)胞蛋白突變的存在。通過對(duì)正常(野生型)多肽和它的突變體的認(rèn)識(shí)，MS集中在帶電荷的種類，而且避免記錄和分析所有其他的數(shù)據(jù)。因此能夠檢測(cè)單個(gè)靶向的電離物質(zhì)(ionizedspecies),而且如果測(cè)試的樣品中存在變體，能夠檢測(cè)到基于該變體的峰值。該方法稱為靶向特異性選擇的電離物質(zhì)之一。Shushan"a/.，ClinicalChemistry,44,A150,1998;LiuTaoetah,ShengwuHuaxueYuShengwuWuliXuebao，M，423-432，2002;Koboldetal，ClinicalChemistry,41，1944-1951，1997;Wanetal，J.Chromatog.,￡H，437-446，2001;和VanDorsselaer"a/,Biochemistry,2949-2956,1989中也描述了相關(guān)的方法?，F(xiàn)有技術(shù)的方法還存在許多問題，包括被檢測(cè)的靶向的電離物質(zhì)可能與具有相同質(zhì)量/電荷比的物質(zhì)相混淆，且缺乏靈敏度。此外，當(dāng)?shù)鞍鬃凅w與野生型蛋白僅有很小的不同時(shí)，通過MS很難區(qū)分變體與野生型蛋白。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及一種更加靈敏的用于篩選蛋白變異的方法。當(dāng)變體蛋白存在于獲自與變體蛋白異源的個(gè)體的樣品中時(shí)，增加的靈敏度顯得尤為重要。本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)樣品中己知的蛋白變體的方法，該方法包括(i)消化蛋白以產(chǎn)生確定的系列肽；(ii)電離所述肽，并通過質(zhì)譜分析選擇已知質(zhì)量/電荷比的指示蛋白變體的電離物質(zhì)；和(iii)使選擇的電離物質(zhì)進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離，并測(cè)量一個(gè)或多個(gè)已知質(zhì)量/電荷比的衍生電離物質(zhì)，以確認(rèn)樣品中蛋白變體的存在。本發(fā)明的方法允許準(zhǔn)確和特異性檢測(cè)蛋白變體。特別地，通過消化蛋白以產(chǎn)生確定的系列肽，以及通過使選擇的電離物質(zhì)進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離，大幅度地降低了該方法檢測(cè)到假陽(yáng)性的機(jī)會(huì)。本發(fā)明的方法可用于檢測(cè)任何蛋白變體如蛋白突變或異常濃度的野生型蛋白。使用本發(fā)明可以檢測(cè)任何能夠?qū)е伦凅w蛋白質(zhì)生產(chǎn)的遺傳紊亂。使用本發(fā)明的方法能夠檢測(cè)到包括血紅蛋白變體，和與糖基化作用的先天性紊亂(CDG)相關(guān)的變體蛋白質(zhì)在內(nèi)的特定蛋白變體。標(biāo)準(zhǔn)教科書中描述了引起各種形式的貧血癥的變體血紅蛋白，包括GolderN.Wilson，WileyLiss(2000)的"臨床遺傳學(xué)"第114-119頁(yè)，Wild"a/,2001(上文)在第其698頁(yè)也列舉了許多這種氨基酸的改變。根據(jù)本發(fā)明，所有這些變異都可以進(jìn)行檢測(cè)。尤其優(yōu)選地，本發(fā)明的方法用于檢測(cè)臨床重要的血紅蛋白變體如HbS,HbC，HbDPunjab，Hb0紐HbLepore，HbE，3|3地中海貧血癥，胎兒血紅蛋白癥的遺傳性持續(xù)(HPFH)和a零度地中海貧血癥。進(jìn)一步優(yōu)選為，本發(fā)明的方法用于檢測(cè)下列臨床重要的血紅蛋白變體S、C、E、D，Jab和Oarab。待檢測(cè)的蛋白變體可以是包括糖蛋白在內(nèi)的任何蛋白。特別地，可以使用本發(fā)明的方法檢測(cè)指示代謝紊亂的特異性糖蛋白。例如，糖基化作用的先天性紊亂(CDG)通常通過分析血漿鐵傳遞蛋白進(jìn)行診斷，通常大量糖基化的血漿蛋白，其顯示了基于精確的CDG類型的未結(jié)合糖部分的特征模式。待檢測(cè)的蛋白變體可以是指示紊亂或疾病的任何蛋白。例如；尿中的白蛋白，該蛋白被認(rèn)為是腎中內(nèi)皮損傷的標(biāo)記，因此是腎病和心血管損傷的風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)記；尿中的低分子量蛋白質(zhì)(例如，維生素A1結(jié)合蛋白)，其水平提高表明腎小管損傷；CSF中的朊病毒蛋白(PrP)變體可表明遺傳的海綿狀腦?。谎褐械囊认俚鞍踪|(zhì)可進(jìn)行囊性纖維化篩選。該方法可以用于檢測(cè)已知的蛋白變體。因此，待檢測(cè)的蛋白變體的序列必須是已知的。對(duì)于此方法來說這是重要的，需要選擇衍生自該蛋白的已知質(zhì)量/電荷比的電離物質(zhì)。如果被檢測(cè)的變體是未知的，那么將不可能測(cè)定衍生自該蛋白的電離物質(zhì)的質(zhì)量/電荷比。術(shù)語(yǔ)"電離物質(zhì)"是指己經(jīng)被電離的并因此帶電荷的肽。通過篩選已知質(zhì)量/電荷比的電離物質(zhì)，僅僅需要掃描有限窗孔的質(zhì)量/電荷比。這相當(dāng)大地減少了操作者需要進(jìn)行的工作和分析量。特別地，通過選擇己知質(zhì)量/電荷比的單個(gè)電離物質(zhì)，不需要測(cè)定具有不同質(zhì)量/電荷比率的廣譜電離物質(zhì)，而且不需要執(zhí)行去巻積分析法復(fù)雜和耗費(fèi)時(shí)間的步驟。通過避免這些耗費(fèi)時(shí)間的步驟，該方法可用于快速并精確地測(cè)定蛋白變體的存在。在一些情況中，該方法可用于選擇少量己知質(zhì)量/電荷比的電離物質(zhì)。少量電離物質(zhì)可以是1到20，優(yōu)選為1到10，進(jìn)一步優(yōu)選為1到5。甚至當(dāng)該方法包括選擇少量已知質(zhì)量/電荷比的電離物質(zhì)時(shí)，該方法也將比需要測(cè)定廣譜電離物質(zhì)的現(xiàn)有技術(shù)方法顯著地更快而且并不復(fù)雜。最優(yōu)選情況下，該方法包括選擇具有已知質(zhì)量/電荷比的單個(gè)電離物質(zhì)。具有待檢測(cè)蛋白變體的樣品可以是任何合適的樣品，如血液，尿，腦脊髓液和組織樣品。顯而易見地，樣品種類取決于待檢測(cè)的蛋白變體。如果蛋白變體是血紅蛋白變體，樣品優(yōu)選血液。另夕卜，業(yè)已發(fā)現(xiàn)的血斑也可以用作樣品。樣品可以通過標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行處理以除去任何不想要的雜質(zhì)，濃縮待檢測(cè)的蛋白變體，變性蛋白和/或把樣品以適于蛋白消化的形式放置。用于處理樣品的合適的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。對(duì)蛋白進(jìn)行消化以產(chǎn)生確定的系列肽。術(shù)語(yǔ)"確定的系列肽"指通過消化蛋白產(chǎn)生的系列肽可以被檢測(cè)。例如，當(dāng)使用序列特異性蛋白酶(即，在特異性序列切割的蛋白酶)如胰蛋白酶時(shí)，產(chǎn)生的系列肽可以基于蛋白的序列進(jìn)行預(yù)測(cè)。通過消化蛋白以產(chǎn)生一系列肽，一個(gè)或多個(gè)肽將是對(duì)待檢測(cè)的蛋白變體具有特異性的。例如，如果變體蛋白與野生型蛋白(非變體蛋白)只有l(wèi)個(gè)氨基酸不同，含有變異氨基酸的肽即為變體蛋白的表示。選擇性地，如果變體蛋白與野生型蛋白的不同在于特定蛋白酶改變的切割位點(diǎn)，將產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)新肽，而且一個(gè)或多個(gè)新肽即為變體蛋白的表示。蛋白變體可以是與相關(guān)蛋白質(zhì)不同的野生型蛋白。此外，蛋白質(zhì)之間的任何差異均可用于特異性地檢測(cè)蛋白變體。電離確定的系列肽，并選擇作為指示蛋白變體的已知質(zhì)量/電荷比的電離物質(zhì)。肽可以被電離，而且可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何質(zhì)譜分析的方法選擇電離物質(zhì)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，電噴射電離四極場(chǎng)質(zhì)譜分析用于電離肽，并選擇電離物質(zhì)。本
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，其他的電離方法，尤其是溫和電離技術(shù)，例如，快速原子轟擊(FAB)和基質(zhì)輔助激光解吸電離(MALDI)，及其他的質(zhì)量分析系統(tǒng)，例如，飛行時(shí)間(TOF)和扇形磁場(chǎng)(magneticsector)也是可能的。由于被選擇的特異性電離肽是己知的，因此，通過質(zhì)譜分析預(yù)測(cè)選擇的電離物質(zhì)的質(zhì)量/電荷比是可能的。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，根據(jù)電離程度，特定的肽將形成許多具有不同的質(zhì)量/電荷比的電離物質(zhì)?？梢赃x擇一種或多種電離物質(zhì)。待檢測(cè)的電離物質(zhì)取決于變異的數(shù)量，包括解除斷裂(easeoffragmentation)和從那些來源于非變體蛋白中區(qū)分衍生的電離物質(zhì)的能力，但是應(yīng)當(dāng)進(jìn)行選擇以獲得最佳水平的檢測(cè)。如上所指出，選擇的電離物質(zhì)將是蛋白變體的表示，因?yàn)槠淇梢杂删哂凶凅w氨基酸序列的肽(即，肽的氨基酸序列與來自野生型(非變體)蛋白的相應(yīng)肽不同)產(chǎn)生，也可以由只有當(dāng)變體蛋白被消化時(shí)才形成的肽(即，與野生型(非變體)蛋白相比，變體蛋白在消化時(shí)具有不同的切割位點(diǎn))所產(chǎn)生。選擇的電離物質(zhì)僅僅是變體蛋白的表示，因?yàn)榇嬖诰哂邢嗤馁|(zhì)量/電荷比的不相關(guān)的電離物質(zhì)。不相關(guān)的電離物質(zhì)可能是由樣品中存在的不同的蛋白質(zhì)形成，或者由變體或非變體蛋白的不同部分形成?？紤]到這點(diǎn)，為了提高該方法的準(zhǔn)確度，使選擇的電離物質(zhì)進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離，并測(cè)量一種或多種衍生的已知質(zhì)量/電荷比的電離物質(zhì)?？梢詫?duì)選擇的電離物質(zhì)進(jìn)行電離，并可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的任何質(zhì)譜方法進(jìn)行測(cè)量。優(yōu)選的方法如上所述。使選擇的電離物質(zhì)進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離時(shí)，可能產(chǎn)生兩種情況。第一，選擇的電離物質(zhì)被解離以產(chǎn)生許多電離的肽片段。可以通過檢測(cè)一系列電離的肽片段，鑒定已知質(zhì)量/電荷比的電離物質(zhì)。如果選擇的電離物質(zhì)源于蛋白質(zhì)變體，那么預(yù)測(cè)選擇的電離物質(zhì)解離時(shí)將產(chǎn)生何種電離物質(zhì)將是可能的。質(zhì)量/電荷比也可以進(jìn)行預(yù)測(cè)。因此，通過解離之后尋找電離物質(zhì)，可以證實(shí)樣品中蛋白質(zhì)變體的存在。第二，選擇的電離物質(zhì)沒有解離而產(chǎn)生許多電離肽。但是，任何含有雜質(zhì)的等比重肽均可以被解離。因此可以測(cè)定選擇的電離物質(zhì)，可以證實(shí)樣品中蛋白質(zhì)變體的存在。因此，一種或多種衍生的電離物質(zhì)可以與原先選擇的電離物質(zhì)相同，或者可以是其電離片段。例如，原先選擇的電離物質(zhì)可以被解離成2個(gè)或更小的電離肽。碰撞誘導(dǎo)解離的水平可以改變，從而可以控制選擇的電離物質(zhì)的離解程度。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，選擇的電離物質(zhì)將進(jìn)行:l、低能斷裂,該斷裂可以不引起選擇的電離物質(zhì)的實(shí)質(zhì)性解離，也可以導(dǎo)致許多電離的肽片段(低水平斷裂)的產(chǎn)生；和2、高能斷裂，該斷裂導(dǎo)致從電離物質(zhì)的兩個(gè)末端除去氨基酸(高能斷裂)。因此通過檢測(cè)氨基酸能夠使本領(lǐng)域技術(shù)人員確定選擇的電離物質(zhì)的序列。通過額外高能斷裂，可獲得關(guān)于選擇的電離物質(zhì)的身份的詳細(xì)資料。這種附加信息更進(jìn)一步地證實(shí)了樣品中蛋白質(zhì)變體的存在。因此，優(yōu)選情況下，本發(fā)明的方法還包括使選擇的電離物質(zhì)進(jìn)行高能斷裂，從而在電離物質(zhì)的兩個(gè)末端除去氨基酸，并確定電離物質(zhì)的序列。低能和高能斷裂水平的碰撞誘導(dǎo)解離可以同時(shí)進(jìn)行或連續(xù)進(jìn)行。優(yōu)選同時(shí)進(jìn)行低能和高能水平的碰撞誘導(dǎo)解離。多種質(zhì)譜儀可用于同時(shí)進(jìn)行的低能和高能斷裂。特別地，可以使用任何具有線性離子捕獲能力的質(zhì)譜儀，如API2000Q-trap或Q畫trap4000(SCIEX)。本發(fā)明還提供了一種實(shí)施本發(fā)明方法的系統(tǒng)，其中，該體系包括用于實(shí)施本發(fā)明的方法的串聯(lián)質(zhì)譜的裝置。本發(fā)明還提供了一種用于實(shí)施本發(fā)明方法的試劑盒，其中，該試劑盒包括(i)用于制備蛋白質(zhì)樣品的緩沖液和試劑；(ii)用于將蛋白質(zhì)樣品消化成一系列確定肽的蛋白酶；(iii)用于將所述樣品傳遞到執(zhí)行串聯(lián)質(zhì)譜分析的裝置的載體基質(zhì)；和(iv)用于實(shí)施串聯(lián)質(zhì)譜分析的裝置，該裝置被設(shè)計(jì)用于實(shí)施本發(fā)明所述的方法。所述試劑盒另外還可以包括適用于啟動(dòng)所述裝置以實(shí)施本發(fā)明所述方法的軟件?，F(xiàn)在，通過舉例的方式通過以下附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述；圖1為具有正常P血紅蛋白(A)的對(duì)照個(gè)體與患有鐮刀形紅細(xì)胞貧血病(B)的患者的血液的胰蛋白酶消化的質(zhì)量掃描m/z1001500圖；插圖強(qiáng)調(diào)了原始光譜的復(fù)雜性；箭頭分別揭示了對(duì)照(A)與鐮刀形紅細(xì)胞貧血病(B)患者的[M+2H]2+和[M+H]+離子的激增光譜；注意[M+H]+離子的-30Da，與[M+H]+離子的-Da的質(zhì)量改變；圖2為對(duì)照p血紅蛋白Tl肽[M+2H]2+，m/z476.8(A)，與血紅蛋白STl肽[M+2H]2+，m/z461.8(B)的產(chǎn)物離子掃描圖；注意y與b系列片段提供了明確的序列數(shù)據(jù)，y4MRM靶離子分別為m/z502.3與472.3;圖3為對(duì)照，鐮刀形細(xì)胞癥與鐮刀形紅細(xì)胞貧血病的|3球蛋白的Tl肽提取的MRM轉(zhuǎn)換為m/z476.9/502.3(野生型|3血紅蛋白)與m/z461.9/472.4(血紅蛋白S)的圖；圖4為對(duì)照，C癥與C疾病的P球蛋白的Tl肽提取的MRM轉(zhuǎn)換為m/z476.9/502.3(野生型P血紅蛋白)與m/z694.7/694.7(血紅蛋白C)的圖；圖5為對(duì)照，DPu一癥與D^jab疾病的卩球蛋白的T13肽提取的MRM轉(zhuǎn)換為m/z1378.8/1378.8(野生型(3血紅蛋白)與m/z1377.8/1377.8(血紅蛋白E)Pu咖b)的圖；圖6為對(duì)照，0^^癥和0&ab疾病的P球蛋白的T13肽提取的MRM轉(zhuǎn)換為m/zl378.8/1378.8(野生型卩血紅蛋白)與)的圖；圖7為對(duì)照，E癥與E疾病的|3球蛋白的T3肽提取的MRM轉(zhuǎn)換為m/z1314.7/1314.7(野生型(3血紅蛋白)與m/z916.8/916.8(血紅蛋白E)的圖。具體實(shí)施方式實(shí)施例發(fā)明人開發(fā)了一種靶向方法，以特定地鑒定重要的蛋白質(zhì)變體，特別是球蛋白變體。這利用了業(yè)已描述的每個(gè)變體的突變的事實(shí)，從而可以根據(jù)遺傳密碼確定氨基酸序列。利用胰蛋白酶消化處理球蛋白，根據(jù)鏈中存在的精氨酸與賴氨酸的位點(diǎn)切割成一系列肽。串聯(lián)質(zhì)譜儀(API4000，MDS-SCIEX)可以選擇肽和進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)斷裂，以致可以檢測(cè)到突變特異性的電離物質(zhì)。如果存在單個(gè)突變，通過添加或置換精氨酸與賴氮酸，改變切割位點(diǎn)的突變，可以產(chǎn)生特異性的肽。發(fā)明人進(jìn)行了一系列MSMS與虛擬MSMS實(shí)驗(yàn)，以研究在P球蛋白的胰蛋白酶消化期間形成的3種重要的肽，Tl、T3和T13，其包括與血紅蛋白S、C、E、DPunJab和C^ab相關(guān)的突變。該方案尋找血紅蛋白S與血紅蛋白C、DPunjab、0^ab和E特異性的電離產(chǎn)物。還測(cè)定了對(duì)大部分正常卩T1鏈質(zhì)譜特異性的電離物質(zhì)，和相應(yīng)于正常T3與T13肽的電離物質(zhì)。這用作該分析方法的質(zhì)量管理檢驗(yàn)，以確定突變的攜帶者或疾病狀態(tài)。血紅蛋白S血紅蛋白S的形成是由于卩鏈第6位的野生型谷氨酸被纈氨酸置換的結(jié)果。這導(dǎo)致了質(zhì)量比野生型小30道爾頓(Da)的產(chǎn)物。當(dāng)用胰蛋白酶進(jìn)行消化時(shí)，鐮刀突變位于T1片段，其含有P鏈的第一個(gè)8個(gè)氨基酸。氨基酸序列和分子量如表1所示。表l(3T1片段氨基酸序列與分子量<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>使用電噴射MSMS策略，電離肽以產(chǎn)生一系列多電荷的電離物質(zhì)。單電荷的野生型卩鏈Tl肽的理論質(zhì)量/電荷比是[M+H]+952.5，雙電荷的肽的理論質(zhì)量/電荷比是[]^+11]2+476.8。在適當(dāng)消化的m/z100-1500掃描中觀察到了兩種物質(zhì)(圖1A)。在來自患有鐮刀形紅細(xì)胞貧血病的患者的樣品中，用纈氨酸置換第6位的谷氨酸產(chǎn)生了當(dāng)量電荷的肽[M+H]+922.5與[^4+司2+461.8(圖1B)，而且野生型離子缺失。因此，分離從野生型卩鏈減少的30Da質(zhì)量得到Tl肽。這是高特異性的，但是通過使用Tl肽的碰撞誘導(dǎo)解離(CID)或斷裂，可以引入更高水平的特異性和背景還原。因此，在四極場(chǎng)l(MS1)中分離到感興趣的肽，在四極場(chǎng)2(MS2)中進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離，并在四極場(chǎng)3(MS3)中進(jìn)行分析。雙電荷肽的斷裂通常導(dǎo)致產(chǎn)生兩種互補(bǔ)的肽離子，稱為y離子與b離子。y離子保留其C末端的正電荷，同時(shí)b離子在N末端保留正電荷。因此，根據(jù)已知肽的氨基酸序列，計(jì)算得到的離子的斷裂質(zhì)量是可能的。表2和表3中表示了正常的與鐮刀Tl肽的氨基酸序列與質(zhì)量。表2野生型PT1斷裂<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>理論質(zhì)量(M)-總的肽質(zhì)量+&0=951.492Da[M+H]=952.5Da[M+2H]=476.8Da表3:鐮刀I3T1斷裂<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>理論質(zhì)量(M)=總的肽質(zhì)量+1120=921.518Da[M+H]=922.5Da[M+2H}=461.8Da我們開發(fā)并優(yōu)化了一種用于質(zhì)譜分析的方案，在使用時(shí)選擇[M+2H]肽質(zhì)量并在第一個(gè)四極場(chǎng)中鑒定感興趣的肽。在碰撞細(xì)胞中進(jìn)行斷裂，并隨后在第二個(gè)四極場(chǎng)中鑒定電離的肽片段。通過這種方法，對(duì)于y離子，正常卩Tl片段的選擇的質(zhì)量為476.8Da，502.3Da的y4離子作為靶產(chǎn)物。鐮刀Tl片段的選擇的質(zhì)量為461.9Da，472.4Da的y4離子作為靶產(chǎn)物。野生型(圖2A)與鐮刀(圖2B)[M+2H]2+離子的產(chǎn)物離子掃描證明了該方法的實(shí)用性。應(yīng)注意，使用[M+2H]2+離子是因?yàn)樗鼈冊(cè)谳^低的碰撞能量10時(shí)就斷裂。鐮刀蛋白質(zhì)的掃描是獨(dú)特的，并且可以作為基本的診斷。然而，對(duì)于多個(gè)突變的群體篩選，靶向感興趣的肽提供了在高靈敏度多重反應(yīng)監(jiān)控(MRM)模式中使用該儀器的機(jī)會(huì)。在鐮刀蛋白質(zhì)的情況中，理論上最佳特異性靶向是y3離子。實(shí)際上，由于第5位上的脯氨酸作用(Williams"a/,Biochem.J.，20i,105-117，1982)y4離子(m/z472.3)提供了更加靈敏的信號(hào)。理論的野生型MRM是m/z476.8/502.2，鐮刀蛋白質(zhì)為m/z461.8/472.3。鑒定鐮刀蛋白質(zhì)的方法包括全血的胰蛋白酶消化，自動(dòng)直接注射消化，2MRM的采集，和注射的時(shí)間間隔為大約1分鐘。使用胰蛋白酶消化的第二次注射可以進(jìn)行明確的確認(rèn)，并且感興趣肽的產(chǎn)物的離子掃描能夠提供序列信息。上述方法已經(jīng)用于以下的血紅蛋白病。血紅蛋白C血紅蛋白C的形成是卩鏈第6位的野生型谷氨酸被置換為賴氨酸的結(jié)果。當(dāng)用胰蛋白酶進(jìn)行消化時(shí)，在第6位產(chǎn)生了一個(gè)新的切割點(diǎn)，并因此產(chǎn)生了一種具有特定質(zhì)量的新肽。該肽的氨基酸序列為VHLTPK，[M+H]694.4Da。在這種情況下，新肽的特異性篩選了不必要的斷裂。相對(duì)于雙電荷肽，單電荷肽具有較高的穩(wěn)定性，這意味著，在鐮刀與野生型MRM所需的碰撞能量的條件下，C肽特異性的[M+H]+離子進(jìn)行了最小的斷裂。因此，"MRM"m/z694.4/694.4能夠應(yīng)用。同樣"虛擬MEM"方法已經(jīng)用于血紅蛋白j^Punjab。Arabfc^"p血紅蛋白D^Jab血紅蛋白DPunjab的形成是卩鏈的第121位的野生型谷氨酸被置換為谷氨酰胺的結(jié)果。這導(dǎo)致了質(zhì)量比野生型小1的產(chǎn)物。當(dāng)用胰蛋白酶進(jìn)行消化時(shí)，在包含第121到132位氨基酸的T13肽中發(fā)現(xiàn)了該現(xiàn)象。因此野生型T13的序列EFTPPVQAAYQK改變成QFTPPVQAAYQK。在該肽中沒有其他的單個(gè)氨基酸置換將引起-1的質(zhì)量改變，因此T13野生型片段從[M+H]1378.8Da到[M+H]1377.8的質(zhì)量改變是血紅蛋白0^一高度特異性的。血紅蛋白O^ab血紅蛋白0^b的形成是P鏈的第121位的野生型谷氨酸被置換為賴氨酸的結(jié)果。當(dāng)用胰蛋白酶進(jìn)行消化時(shí)，在第121位產(chǎn)生了一個(gè)新的切割點(diǎn)，同時(shí)產(chǎn)生了一種新肽。具有EFTPPVQAAYQK[M+H]1378.8Da的野生型T13肽變成了FTPPVQAAYQK[M+H]1249.7Da。血紅蛋白E血紅蛋白E的形成是卩鏈的第26位的野生型谷氨酸被置換為賴氨酸的結(jié)果。當(dāng)用胰蛋白酶進(jìn)行消化時(shí)，在包含第18到30位氨基酸的T3肽中發(fā)現(xiàn)了該現(xiàn)象。T3肽的野生型序列是VNVDEVGGEALGR[M+H]1314.7Da。當(dāng)血紅蛋白E突變存在時(shí)，序列是VNVDEVGGKALGR,這形成了兩種新的肽VNVDEVGGK[M+H]916.8與ALGR[M+H]416.3。較小的肽作為耙肽，因?yàn)槭芷渌亩嘀赝蛔冇绊懙目赡苄暂^少。設(shè)計(jì)用于這5種血紅蛋白的方案，該方案使用了下列質(zhì)量來鑒定它們的存在或缺失，以及相應(yīng)的野生型肽的存在或缺失。表4:擬定的靶肽與離子質(zhì)量<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>材料和方法患者組選擇200個(gè)匿名的同意用于血紅蛋白病診斷的溶于EDTA的anonymised全血樣品，提供有效數(shù)量的每個(gè)變體，以平行己知方法進(jìn)行檢測(cè)和分析。這些包括52個(gè)血紅蛋白AA，44個(gè)血紅蛋白AC(C性狀)，57個(gè)AS(鐮刀細(xì)胞癥)，16個(gè)血紅蛋白SC(SC疾病)，14個(gè)血紅蛋白SS(鐮刀形細(xì)胞病)，10個(gè)血紅蛋白AE(E癥)，2個(gè)血紅蛋白ADPunjab(DPunJab癥)，以及每個(gè)1個(gè)樣品的血紅蛋白CC(C疾病)、DPunJabDPUnJab(DPunJab疾病)、EE(E疾病)AO"ab(C^ab癥)和0A()A(0&ab疾病)。材料獲自SigmaAldrich，UK的碳酸氫銨(A6141)，TCPK處理的胰蛋白酶(T1426)與甲酸。獲自Rathbum化學(xué)試劑有限公司的乙腈。已知方法血紅蛋白病的實(shí)驗(yàn)室診斷指南(WorkingPartyOfGeneralHaematologyTaskForce，1998)作為最低標(biāo)準(zhǔn)。使用變體(TM)II，用HbA2/HbA,e雙程序試劑盒(Bio-Rad，UK;HemelHempstead,UK)進(jìn)行操作，通過高效液相色譜法(HPLC)進(jìn)行初始的血紅蛋白病篩選。使用制定的方法進(jìn)行臨時(shí)血紅蛋白鑒定的確證試驗(yàn)，包括鐮刀溶解度測(cè)定、酸性和堿性凝膠(Wild,B丄,Bain，BJ.,ChurchillLivingstone,9thEd.231-268，2001)，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Fodor,RH.,Eng，CM,Prenat.Diagn.,19，58-60,1999)和p基因測(cè)序。胰蛋白酶消化Wild2001等(上文)所述的方法處理之后，全血樣品(l(Hd)在蒸餾水中稀釋以得到工作溶液。添加乙腈(l(Hil)與1%甲酸(10pl)至10(^l工作溶液中，使血紅蛋白變性。在室溫靜置5分鐘后，添加1M碳酸氫銨(6^)與TPCK處理的胰蛋白酶(5^U)。一旦溶液已經(jīng)澄清，對(duì)其進(jìn)行離心，并在37"C孵育30分鐘。消化處理后，40i!l溶液在36(Hil的乙腈水為l:1以及0.2%甲酸中稀釋，得到工作溶液。將工作溶液轉(zhuǎn)移到96深孔的聚丙烯板(SematInternationalLtd,StAlbans，UK)中，并裝載到CTC分析學(xué)HTSPAL冷凍自動(dòng)樣品儀(PresearchLtd,Hitchin，UK)中進(jìn)行MSMS分析。質(zhì)譜分析血紅蛋白變體通過每個(gè)都靶向不同的電離肽的3個(gè)獨(dú)立的方案同時(shí)進(jìn)行分析。樣品(2pl)自動(dòng)引入到包含0.025%甲酸的乙腈水(l:l)的連續(xù)溶劑流中，以75j^l/min(Agilent1100series)的流速流進(jìn)帶有以5500V與2500C的陽(yáng)離子模式的電噴射源的SCIEXAPI4000(AppliedBiosystems，Warrington,UK)三重四極場(chǎng)MSMS。界面加熱器接通，去簇電壓81.0V,入口電壓10v。對(duì)于3個(gè)MSMS實(shí)驗(yàn)，碰撞氣體設(shè)定(6.0)，碰撞能量(30V)，出口電壓(15.0V)是恒定的。靶向野生型P球蛋白T1與T1變體，S和C的第一個(gè)實(shí)驗(yàn)，靶向野生型T13與T13變體，DPunjat^n的第二個(gè)實(shí)驗(yàn)，以及耙向野生型T3與T3變體，E的第三個(gè)實(shí)驗(yàn)。實(shí)際的MRM與""如表4所示；每個(gè)轉(zhuǎn)換停留時(shí)間150ms?？偛蓸訒r(shí)間為60秒。結(jié)果如所描述的分析200個(gè)血樣。每個(gè)血紅蛋白表型的樣品的數(shù)量與預(yù)測(cè)結(jié)果模式如表5所示。表5測(cè)試的血紅蛋白表型的數(shù)量與預(yù)測(cè)的結(jié)果模式<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>從表5可以看出，正常血紅蛋白A表型將顯示3種野生型肽T1，T13，T3以它們的特征質(zhì)量存在，而鐮狀細(xì)胞癥表型(AS)除了具有這些質(zhì)量的肽以外，還具有472.4Da的離子。類似地，血紅蛋白C癥表型(AC)顯示除了3種野生型質(zhì)量外，還存在694.4Da的肽。我們已經(jīng)表明這種模式對(duì)于保持測(cè)試癥表型是正確的。在疾病或化合物雜合體情況中，對(duì)應(yīng)的野生型肽是缺失的，而檢測(cè)的電離肽以變體的特征質(zhì)量存在。對(duì)操作者每個(gè)樣品都呈現(xiàn)出4組數(shù)據(jù)總的離子色譜，然后是T1、T13和T3肽。為了簡(jiǎn)單地證明數(shù)據(jù)的有效性，來自具有血紅蛋白AA、AS和SS的個(gè)體的樣品的T1MRM數(shù)據(jù)如圖3所示。應(yīng)注意的是，AA中實(shí)際上缺乏S信號(hào)導(dǎo)致了很高的信號(hào)噪聲比和S靈敏度。C、DPunjab、C^ab和E的相應(yīng)數(shù)據(jù)分別如圖4，5，6和7所示。甚至在使用"虛擬的MRM"時(shí)，背景信號(hào)也相對(duì)較小，而且對(duì)于靶向的所有突變，簡(jiǎn)單的目測(cè)檢查就可以鑒定雜合體和純合體情況。由于lDa的改變，甚至在DP一b純合的患者中，T13肽也存在較高的野生型信號(hào)。然而，由于m/z1377.8/1378.8信號(hào)的相對(duì)比，雜合與純合的D&njab的檢測(cè)未受影響。發(fā)明人選擇樣本以提供在檢測(cè)方案中靶向的一組血紅蛋白變體，并證實(shí)通過傳統(tǒng)技術(shù)鑒定的全部血紅蛋白變體具有通過質(zhì)譜分析檢測(cè)到的對(duì)應(yīng)的變體肽。而且正如所預(yù)測(cè)的，在疾病與復(fù)合雜合體情況中，缺失野生型肽。例外的情況是，已經(jīng)進(jìn)行輸液的患者，期待的野生型肽與變體一起存在。因此描述的用于分析200個(gè)樣品的方法，對(duì)于變體的質(zhì)譜分析鑒定，在己知方法的結(jié)果與預(yù)測(cè)的結(jié)果模式之間具有100%的相關(guān)。特別地，在分析的200個(gè)樣品中，雜合或純合的血紅蛋白S、C、DPunjab、0&ab和E的檢測(cè)的特異性為100%，靈敏度為100%。討論血紅蛋白病國(guó)家篩選方案的實(shí)行，已經(jīng)突出了對(duì)臨床上顯著的血紅蛋白進(jìn)行及時(shí)并精確鑒定的需要。正確的篩選方案目標(biāo)在于"鑒定群體內(nèi)具有特定紊亂的那些個(gè)體，該混亂是由介入引起的，如醫(yī)療，教育或咨詢可以促進(jìn)疾病的固有的病程"(Henthorn&a/,Br.J.Haematol.124,259-263，2004)。目前的方法可能不能真正地被認(rèn)為是篩選技術(shù)，因?yàn)樗鼈儥z測(cè)到了大量的血紅蛋白變體，而其中許多不是臨床上顯著的。許多實(shí)驗(yàn)室目前從事的對(duì)這些變體的特異性鑒定，是對(duì)有限資源的無效使用。而且已知方法具有相對(duì)低的通量，例如使用一些HPLC系統(tǒng)每個(gè)樣品大約需要6分鐘。血紅蛋白通過這種系統(tǒng)臨時(shí)被鑒定，然后在結(jié)果最終確認(rèn)之前，還需要通過其他的技術(shù)來進(jìn)行證實(shí)(Wild,B丄，Bain，BJ.2004(上文))。鑒定血紅蛋白變體的己知技術(shù)MSMS，設(shè)計(jì)用于決定性地鑒定未知的血紅蛋白變體(WildWa/，2001(上文))，并且是有效的，但耗費(fèi)時(shí)間。程序中認(rèn)為臨床上顯著的對(duì)那些血紅蛋白的靶向篩選，將集中在時(shí)間與資源的使用。能處理大量樣品并迅速分離所需的血紅蛋白變體的系統(tǒng)，將減少周轉(zhuǎn)周期，并因此減少樣本收集與患者咨詢之間的時(shí)間滯后，這在出生前篩選方案中是一個(gè)重要因素。發(fā)明人已經(jīng)開發(fā)了一個(gè)新的策略，該策略使用胰蛋白酶消化結(jié)合MSMS作為篩選方法，作用于臨床上顯著的血紅蛋白變體，在設(shè)計(jì)該策略時(shí)，發(fā)明人決定集中在血紅蛋白S、C、E、DPunJab與QArab上，因?yàn)檫@些血紅蛋白代表了大部分臨床上顯著的血紅蛋白病，而且樣品在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)是容易使用的。發(fā)明人的目的是開發(fā)一種準(zhǔn)確的篩選方案。分析完整的卩鏈對(duì)于野生型僅僅具有l(wèi)Da的質(zhì)量改變的血紅蛋白C，E，DPu"Jab與0^ab是不能提供信息的。血紅蛋白S具有30Da的質(zhì)量改變，當(dāng)分析完整的(3鏈時(shí)，盡管能檢測(cè)到，但是它不能認(rèn)為是特異性的。為了提高這種特異性，并且能夠檢測(cè)到其它的血紅蛋白，把P鏈斷裂成較小的肽是必要的。將此添加到實(shí)驗(yàn)過程中，但也可自動(dòng)進(jìn)行。使用胰蛋白酶，卩鏈被斷裂成15個(gè)肽；Tl、T3與T13由于含有所感興趣的突變而被選出。如在方法部分中所述，使用電噴射MSMS對(duì)消化的樣品進(jìn)行分析，以確定多電荷的電離肽中最適合作為電離肽靶的電離肽。選擇靶電離肽，需要考慮可能影響到特異性的任何其他可能的氨基酸取代。特別地，Tl肽中可能存在一個(gè)問題，其中第6位的野生型谷氨酸被纈氨酸取代，導(dǎo)致了具有-30Da的質(zhì)量改變的血紅蛋白S。Tl肽中兩個(gè)其他的可能的氨基酸取代產(chǎn)生了同樣的質(zhì)量改變；第一是第4位的野生型蘇氨酸變?yōu)楸彼?，第二是?位的野生型谷氨酸變?yōu)槔i氨酸。這些取代目前都沒有報(bào)道，盡管第7位谷氨酸中的其它2個(gè)已經(jīng)被報(bào)道。此時(shí)甘氨酸取代導(dǎo)致了-72Da的質(zhì)量改變(血紅蛋白G-SanJose)，而賴氨酸取代導(dǎo)致了-1Da的質(zhì)量改變(血紅蛋白G-Sirimj)。這些血紅蛋白都不是臨床上顯著的，通過所描述的方案不會(huì)被檢測(cè)到。在設(shè)計(jì)血紅蛋白S方案時(shí)，有必要選擇轉(zhuǎn)換以提供最佳的信號(hào)/特異性中間物。[M+2H]電離肽提供了最好的信號(hào)，并因此從MS1中多電荷的肽離子中被選擇出來。為了選擇最合適的衍生電離物質(zhì)以用于MS2中進(jìn)行分析，必須在b離子或y離子之間進(jìn)行選擇。不幸地，卩鏈b末端第4位的蘇氨酸到丙氨酸的突變是可能的，而且|3鏈y(cè)末端的第7位谷氨酸可能突變?yōu)槔i氨酸。如果這些突變中的任何一個(gè)存在，此方案可能產(chǎn)生假陽(yáng)性。這意味著，既不使用b離子也不使用y離子，進(jìn)行選擇以排除可能影響特異性的突變。因此選擇衍生的電離物質(zhì)可以是b6片段或y3片段，因?yàn)槠渑c突變位點(diǎn)相關(guān)。在實(shí)踐中，因?yàn)楫a(chǎn)生的信號(hào)較少，沒有檢測(cè)到y(tǒng)3片段，也沒有選擇到b6片段。最終選擇了y4片段，因?yàn)槠洚a(chǎn)生有效豐度的單個(gè)純離子，并且由于是小肽，多重突變的能力有限。通過產(chǎn)生-30Da的組合質(zhì)量改變，該改變可能導(dǎo)致特異性的降低，盡管肽序列的分析表明沒有雙重突變可以引起這種質(zhì)量改變。英國(guó)國(guó)家公共醫(yī)療衛(wèi)生服務(wù)血紅蛋白病新生兒篩選方案的國(guó)家要求意味著，至少在初始篩選階段，檢測(cè)血紅蛋白s和/或證明缺乏野生型p-球蛋白是足夠的。雜合或純合情況可以測(cè)定，而且其它的鐮狀形成突變?cè)隍?yàn)證試驗(yàn)階段可以表征。新生兒篩選中令人彷徨的問題是，P球蛋白在嬰兒尤其是那些早產(chǎn)兒中的表達(dá)非常低。因此，對(duì)檢測(cè)血紅蛋白S很敏感的篩選方法是必需的。使用血紅蛋白S的特異性MRM轉(zhuǎn)換，在血紅蛋白AA個(gè)體中發(fā)現(xiàn)非特異性的背景信號(hào)(圖3),該信號(hào)表明明顯小于總的血紅蛋白1%的偶數(shù)級(jí)血紅蛋白S是可以檢測(cè)到的。盡管不是嚴(yán)格必需的，目前的方法也能在原來的胰蛋白酶消化中檢測(cè)和證實(shí)其它鐮狀形成的突變。保留的血紅蛋白變體產(chǎn)生肽，其在該肽中存在單個(gè)突變時(shí)是特異性的。使用發(fā)明人稱為虛擬MSMS的方案可以對(duì)這些肽進(jìn)行分析。在這些肽中，在MSl中選擇電離肽，然后在通過帶有氣流的碰撞槽以后在MS2中進(jìn)行再選擇。這可能引起已經(jīng)通過MS1的任何等比重肽的斷裂，以確保MS2不會(huì)選擇它們。不用氣體分析產(chǎn)生了顯著增加的背景信號(hào)，以及對(duì)一些靶片段產(chǎn)生了降低的信號(hào)。已經(jīng)論述了該方法用于新生兒血紅蛋白病篩選的可能性，但是該方法證明在出生前篩選方案中更有價(jià)值。新生兒與出生前篩選之間主要的差異是，在后者中檢測(cè)用于復(fù)合鐮狀形成突變的雜合體是必不可少的。目前，我們沒有描述用于出生前篩選的綜合系統(tǒng)，但是我們已經(jīng)證明該方法在檢測(cè)用于大多數(shù)復(fù)合鐮狀形成突變的雜合體是如何成功的。該方法不局限于|3鏈，而且可以延伸至包括臨床感興趣的任何其它的突變，并提供了一種綜合方案用于臨床血紅蛋白病的表征與診斷。而且，當(dāng)臨床現(xiàn)象暗示出血紅蛋白病，但耙向的突變都正常時(shí)，MSMS仍然是可以用來進(jìn)行經(jīng)典的序列分析。結(jié)論發(fā)明人已經(jīng)開發(fā)了一種適于高通量分析的方案，其能夠迅速并特異性地篩選靶向的血紅蛋白變體。最初與已知方法的平行研究顯示選擇的200個(gè)樣品的一致性為100%。5卩地中海貧血的檢測(cè)本發(fā)明方法也用于檢測(cè)Sp地中海貧血(也稱為|3地中海貧血)。自從血紅蛋白(Hb)A2通過淀粉凝膠電泳，首次被描述為在正常成人的血液中鑒定到的第二個(gè)正常的血紅蛋白以來，已經(jīng)50年了。發(fā)現(xiàn)血紅蛋白HbA2通常以大約百分之三存在，然而，不同的年齡與疾病狀況的濃度研究顯示，HbA2在嬰兒中是缺失的或大大降低的，并且在地中海貧血性狀中特異地升高。后來假設(shè)，HbA2的升高將很可能是(3地中海貧血的一個(gè)特征，因?yàn)榻档偷膢3鏈合成，將導(dǎo)致Hb比例的相對(duì)增加。增加水平的HbA2現(xiàn)在已經(jīng)被認(rèn)為是卩地中海貧血性狀的特有的診斷要素，并用于區(qū)分a地中海貧血癥。卩地中海貧血癥的診斷在遺傳咨詢中很重要，因?yàn)楫?dāng)遺傳為純合疾病或結(jié)合其他的血紅蛋白病時(shí)，將導(dǎo)致臨床上嚴(yán)重的疾病。用于定量HbA2的方法需要從存在的任何其他的血紅蛋白中分離HbA2，并測(cè)定其存在的比例。有3種技術(shù)可以使用血紅蛋白電泳和隨后的血紅蛋白條帶的洗脫；微型柱色譜法；或自動(dòng)化高效液相色譜法(HPLC)。洗脫與柱色譜方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，其產(chǎn)生基于異常紅血球指數(shù)的選擇性篩選策略。然而，1990年引入自動(dòng)化HPLC系統(tǒng)已經(jīng)促進(jìn)了HbA2水平的質(zhì)量篩選。該方法可用于在群體篩選方案中篩選卩地中海貧血癥。通過HPLC篩選的好處包括能夠同時(shí)鑒定與定量HbA2以及其它的正常和異常血紅蛋白，以及鑒定到可能被前面的篩選策略遺漏的患者。這包括那些具有P地中海貧血性狀但是正常的紅血球指數(shù)的患者，以及那些具有S鏈變體的患者。但是存在一些血紅蛋白變體時(shí)，HPLC系統(tǒng)可能產(chǎn)生錯(cuò)誤的HbA2結(jié)果(Wild"a/，Ann.Clin.Biochem"41，355-369，2004)。當(dāng)血蛋白過少且小紅細(xì)胞癥紅血球指數(shù)存在時(shí)，由于(3地中海貧血癥同時(shí)提高的HbA2水平(范圍4-7%)幾乎是不變的，在其他的情況包括正常的患者、不穩(wěn)定的血紅蛋白、甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)、巨成紅細(xì)胞性貧血與抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療中人類免疫缺陷性病毒感染的患者中也報(bào)道了升高的HbA2水平。HbA2相關(guān)的其它問題包括臨界正常和模糊值為3.5-3.9%。此外，這種值能夠在正常的患者中發(fā)現(xiàn)，但是也可能是由于輕度(3地中海貧血突變?nèi)?101C—和+lCAP位點(diǎn)A—C，或可能減少HbA2水平的環(huán)境因素如鐵缺乏與共同遺傳的a地中海貧血癥所引起的。由于直到至少6個(gè)月大，HbA2水平仍沒有達(dá)到成人的值，HbA2不是嬰兒用于p地中海貧血癥的有效標(biāo)記。然而，盡管存在這些問題，但結(jié)合紅血球指數(shù)，HbA2仍然是成人p地中海貧血篩選的標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)記。血紅蛋白Lepore首次報(bào)道于1957年，由于其與卩地中海貧血癥相互作用而產(chǎn)生了類似于主要地中海貧血的臨床現(xiàn)象。血紅蛋白Lepore癥的特征在于在地中海貧血癥中發(fā)現(xiàn)的降低了的紅血球指數(shù)，而且血紅蛋白Lepore以總血紅蛋白的百分之10-15存在。血紅蛋白Lepore的產(chǎn)生是S與p基因融合的結(jié)果。已經(jīng)描述了具有相同的電泳遷移率的3種Lepore變體，但是每種變體中S與(3基因融合的點(diǎn)都是不同的。由于與P地中海貧血癥的相互作用產(chǎn)生了臨床上顯著的疾病，在群體篩選方案中檢測(cè)血紅蛋白Lepore是必需的。在出生前篩選中，檢測(cè)P地中海貧血癥是同樣重要的。如同所描述的，使用具有兩條(3與兩條S球蛋白鏈的HbA2，已經(jīng)可以實(shí)現(xiàn)。在該方法中，發(fā)明人已經(jīng)研究了通過MSMS檢測(cè)S鏈，以確定作為替代標(biāo)記的實(shí)用性。該方法還允許檢測(cè)S(3融合(血紅蛋白Lepore變體)與yP融合。使用與上述相同的方法，發(fā)明人報(bào)道了在l分鐘循環(huán)時(shí)間內(nèi)的另外的轉(zhuǎn)換，使用5鏈替代HbA2，目標(biāo)是檢測(cè)p地中海貧血癥與血紅蛋白Lepore。材料和方法MSMS策略血紅蛋白的P與5鏈之間存在很高的序列同源性。卩鏈的胰蛋白酶消化產(chǎn)生了一系列15個(gè)確定的肽；類似地，S鏈產(chǎn)生了一系列16個(gè)(T1-16)肽，其與卩鏈的不同在于T2、T3、T5、T10、T12、T13和T14。第一個(gè)序列差異發(fā)生在T2肽中，P鏈與S鏈兩者都包括第9-17位氨基酸，各自的序列分別為SAVTALWGK，其平均質(zhì)量為932.1道爾頓(da);和TAVNALWGK，其平均質(zhì)量為959.1da。如上所述，在多重反應(yīng)監(jiān)控方式(MRM)中，各自的T2[M+2H]2+離子，質(zhì)量與電荷比(m/z)p466.8，和S480.3被選出，靶向斷裂的和最能提供信息的肽片段VTALWGK，675.4da與VNALWGK，688.4da。計(jì)算5/(P+S)的百分比面積比，并與通過HPLC獲得的經(jīng)典百分比HbA2值進(jìn)行比較。通過MSMS分析了在我們正常范圍內(nèi)(平均值2.65%，范圍1.8-3.4)的具有HbA2值的66個(gè)樣品和具有指示p地中海貧血癥的HbA2值(5.24%，4.2-7.9)的58個(gè)樣品，而且，相應(yīng)的5/(|3+3)比率為1.7%，0.9-2.3和3.4%，2.5-6.0。在2個(gè)另外的HbS卩地中海貧血零級(jí)復(fù)合雜合體樣品中，其通過P基因測(cè)序確認(rèn)，比率是4.1%和3.7%。這種相對(duì)較小的系列，提供了P地中海貧血癥可以通過MSMS診斷的證據(jù)。該方法進(jìn)一步的優(yōu)點(diǎn)是任何Lepore變體均具有較高的T2信號(hào)。令人遺憾地，最常見的S鏈變體HbA'2(HbB2)存在于5球蛋白鏈的第16位，并因此屬于該肽。為了不遺漏具有伴隨的S鏈變體的地中海貧血癥，相鄰的提供信息的肽(即，T3(3序列VNVDEVGGEALGR平均質(zhì)量1314.4da，S序列VNVDAVGGEALGR,平均質(zhì)量1256.4da)包括在內(nèi)并可以用于評(píng)估。在MRM中，各自的T3[M+2H]2+離子m/z卩657.9da,與S628.9da被選中，T3肽內(nèi)兩個(gè)系列的斷裂與單個(gè)電荷的離子被檢測(cè)。該系列為如下轉(zhuǎn)換，轉(zhuǎn)換1，卩，EVGGEALGR,m/z887.5da,S，AVGGEALGR,m/z829.5da;轉(zhuǎn)換2，|3VGGEALGR，m/z758.4da，5，VGGEALGR，m/z758.4da。盡管S鏈序列中任何一點(diǎn)存在S鏈變體的潛在問題較少，其意味著，可以證明第三個(gè)肽在數(shù)據(jù)解釋中是有價(jià)值的。最初T135肽被靶向。該肽包含S鏈的第117-120位氨基酸，序列為NFGK，平均質(zhì)量為464.5da。氨基酸數(shù)量少認(rèn)為是有利的，因?yàn)樗拗屏送蛔兊目赡苄?，但是從該肽檢測(cè)到的信號(hào)對(duì)于分析來說還是太低了?；パa(bǔ)的T13卩序列，含有第121-132位氨基酸，序列為EFTPPVQAAYQK，平均質(zhì)量為1378.5da。因此，T145肽與該序列也是互補(bǔ)的，并可選擇用于分析，其序列為EFTPQMQAAYQK，平均質(zhì)量為1441.6da。該肽具有位于N末端的優(yōu)點(diǎn)，而且是S與|3序列之間差異最近的肽。因此，選擇該肽結(jié)合T2肽覆蓋了S鏈的兩個(gè)末端。在MRM中，[M+2H]2+離子，對(duì)于T13卩，m/z689.9da，對(duì)于T14S，501.3da被選中，檢測(cè)并測(cè)定了各自提供信息的肽片段PPVQAAYQK,501.3da與PQMQAAYQK，532.9da的斷裂和雙電荷離子。血斑分析了總共26個(gè)血斑樣品。包含13個(gè)正常的HbA2，11個(gè)提高的HbA2(卩地中海貧血癥)，和2個(gè)S鏈變體。用于胰蛋白酶消化和MSMS分析的材料碳酸氫銨(A6141)、TCPK處理的胰蛋白酶(T1426)和88%的甲酸(39,938-8)(SigmaAldrichCoLtd,Dorset,UK)。HPLC等級(jí)的乙腈(TRHl015)(RathburnChemicalsLtd,Scotland)。血紅蛋白A2定量與血紅蛋白Lepore鑒定的標(biāo)準(zhǔn)方法全血指南，血紅蛋白病的實(shí)驗(yàn)診斷被認(rèn)為是最低標(biāo)準(zhǔn)。用HbA2/HbA^雙程序試劑盒(Bio-RadLaboratoriesLtd,HemelHempstead,UK)使用變體TMII操作，通過高效液相色譜法(HPLC)進(jìn)行血紅蛋白病篩選與血紅蛋白A2的定量。血紅蛋白Lepore變體通過HPLC被初步檢測(cè)到，并通過質(zhì)譜分析確認(rèn)(Wildefa/，2001(上文))。血斑全血EDTA樣本通過HPLC與質(zhì)譜分析進(jìn)行分析。每個(gè)樣品7個(gè)血斑，然后將每個(gè)斑移液35jxl血液到Schleicher與Schuell903濾紙上。血斑干燥過夜，沖壓，在第1天，第8天和第29天，通過HPLC與質(zhì)譜分析進(jìn)行分析。為了進(jìn)行HPLC分析，2個(gè)沖壓的斑點(diǎn)洗脫90分鐘，并放入到lmlBio-Rad洗滌緩沖液中(Bio-RadLaboratoriesLtd,HemelHempstead,UK)，得到標(biāo)準(zhǔn)分析所需的1:201稀釋的當(dāng)量。對(duì)照與標(biāo)準(zhǔn)獲自國(guó)家生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)與對(duì)照研究所的用于血紅蛋白A2的WHO國(guó)際參考試劑用作標(biāo)準(zhǔn)。一系列對(duì)照獲自新西蘭CanterburyScientific公司，這些包含正常的與高的HbA2/HbF，正常的與高的HbA2以及HbFASC。根據(jù)各個(gè)廠家說明書所述的制備方法，重新制備并儲(chǔ)存所有的對(duì)照。一旦重新制備，對(duì)照如全血樣品進(jìn)行處理。用于MSMS的樣品制備全血按照Wild"a/，2001(上文)所述的方法，和上所述方法。血斑通過把1個(gè)3mm的斑點(diǎn)沖壓到200^1的去離子水中，并在自動(dòng)化混合器中洗脫30分鐘，制備工作溶液，然后根據(jù)上述方法處理100^il該溶液。質(zhì)譜分析根據(jù)上述方法進(jìn)行MSMS分析。總的采樣時(shí)間保持在60秒。結(jié)果使用MSMS，具有升高的A2值的所有血液將與具有正常的A2值的血液中清洗地區(qū)分開。在以干燥的血斑形式儲(chǔ)存1天，8天或21天后的儲(chǔ)存品中并沒有改變。HPLC數(shù)據(jù)還沒有進(jìn)行評(píng)論。討論1990年在引入基于HPLC的方法之前，用于定量HbA2的技術(shù)是費(fèi)時(shí)費(fèi)力的。HPLC使高通量地篩選血紅蛋白變體和P地中海貧血，能在常規(guī)基礎(chǔ)上進(jìn)行，并引發(fā)了快速增長(zhǎng)的群體篩選方案。然而，由于樣品材料與應(yīng)用操作程序方面的差異，新生兒血斑與成人全血篩選應(yīng)在不同的平臺(tái)中進(jìn)行。批準(zhǔn)用于嬰兒的篩選方法包括HPLC和等電聚焦(IEF)，而HPLC是唯一批準(zhǔn)用于成人的方法(DepartmentofHealth,UK，2000;NHSSickleCellandThalassaemiaScreeningProgramme,2005)。新生兒血斑HPLC平臺(tái)需要專業(yè)儀器與方法，其不同于用于成人篩選的儀器與方法。IEF作為用于(3地中海貧血癥的篩選方法是不合適的，因?yàn)槠洳辉试S進(jìn)行HbA2測(cè)定。我們已經(jīng)描述的技術(shù)能夠特異性地檢測(cè)并定量S鏈，而不是HbA2(2條a鏈與2條S鏈的組合)。靶向S鏈的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，存在可能阻止或妨礙使用傳統(tǒng)方法進(jìn)行HbA2定量的因素時(shí)，也能夠進(jìn)行檢測(cè)并定量。例如，在一些HPLC系統(tǒng)中存在與HbA2共同洗脫或存在HbS的變體，可以引起HbA2值錯(cuò)誤的升高。當(dāng)存在導(dǎo)致形成S鏈變體的S鏈突變時(shí)，對(duì)HbA2的影響將使該值降低至約一半。通過把變體與正常量的HbA2加到一起，來獲得總的HbA2是重要的，可以確保不遺漏p地中海貧血癥。選擇2個(gè)5肽轉(zhuǎn)換確保S鏈雜合體與純合體不會(huì)被該技術(shù)所遺漏。對(duì)于個(gè)人，遺傳兩種不同的S鏈突變是可能的，但勿庸置疑這是很少存在的情況，在本研究中我們選擇分析了3個(gè)轉(zhuǎn)換來測(cè)定5鏈信號(hào)。該方法確保在復(fù)合雜合體S鏈突變這種不可能發(fā)生的情況下，一個(gè)轉(zhuǎn)換將仍然能夠產(chǎn)生正確的值。而為了實(shí)現(xiàn)常規(guī)篩選的目的，這可能被視為多余的，值得注意的是，采樣數(shù)量的增加沒有增加分析時(shí)間，但是允許更進(jìn)一步的特異性與靈敏度。最常見的S鏈突變發(fā)生在5鏈的T2肽中，而且雖然存在一個(gè)爭(zhēng)論，即不應(yīng)該使用該肽，但是如果需要檢測(cè)血紅蛋白Lepore變體，那么其為必需的。3個(gè)Lepore變體是Sp融合的全部結(jié)果，并且具有下述的5序列HbLepore-HollandiaS序列直到第22位氨基酸；血紅蛋白LeporeBaltimore5直到第50位氨基酸；血紅蛋白LeporeBostonWashingtonS直到第87位氨基酸。理論上，假定合適的肽片段被靶向，在熔點(diǎn)之前S肽應(yīng)當(dāng)增加，該增加可以通過MSMS測(cè)定并定量。為了檢測(cè)所有的血紅蛋白Lepore變體，選擇在肽22位之前(3序列有差異的肽，T2是唯一滿足此要求的肽。因此，選擇用于5鏈定量的T2肽也可以用于檢測(cè)血紅蛋白Lepore變體。以上所引用的所有文獻(xiàn)在此引入并作為參考。權(quán)利要求1、一種用于檢測(cè)樣品中已知的蛋白變體的方法，該方法包括(i)消化蛋白以產(chǎn)生確定的系列肽；(ii)電離所述肽，并通過質(zhì)譜分析選擇已知質(zhì)量/電荷比的指示蛋白變體的電離物質(zhì)；和(iii)使選擇的電離物質(zhì)進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離，并測(cè)量一個(gè)或多個(gè)已知質(zhì)量/電荷比的衍生電離物質(zhì)，以確認(rèn)樣品中蛋白變體的存在。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述蛋白變體為血紅蛋白變體。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述血紅蛋白變體為S、C、E、D闊ab或0咖b。4、根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述蛋白變體為血紅蛋白的S鏈。5、根據(jù)上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的方法，其中選擇已知質(zhì)量/電荷比的l-20個(gè)電離物質(zhì)。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中選擇已知質(zhì)量/電荷比的l-5個(gè)電離物質(zhì)。7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中選擇已知質(zhì)量/電荷比的單個(gè)電離物質(zhì)。8、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述樣品為血液、尿、腦脊髓液或組織樣品。9、根據(jù)本發(fā)明的方法，其中所述蛋白質(zhì)使用序列特異性的蛋白酶進(jìn)行消化。10、根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述蛋白酶為胰蛋白酶。11、根據(jù)上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的方法，其中使用電噴射電離四極場(chǎng)質(zhì)譜分析來電離肽并選擇電離物質(zhì)。12、根據(jù)上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的方法，其中使用電噴射電離四極場(chǎng)質(zhì)譜分析使所選擇的電離物質(zhì)進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離，并測(cè)定一種或多種衍生的電離物質(zhì)。13、根據(jù)上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的方法，其中使所述選擇的電離物質(zhì)進(jìn)行不引起所選擇的電離物質(zhì)的實(shí)質(zhì)性解離或?qū)е麓罅侩婋x肽片段產(chǎn)生水平的解離。14、根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中該方法另外還包括使所選擇的電離物質(zhì)進(jìn)行導(dǎo)致從電離物質(zhì)的兩個(gè)末端除去氨基酸的水平的解離，以及檢測(cè)氨基酸。15、一種用于實(shí)施權(quán)利要求1-14中任意一項(xiàng)所述方法的系統(tǒng)，其中該系統(tǒng)包括用于實(shí)施串聯(lián)質(zhì)譜分析的裝置，該裝置被設(shè)計(jì)用于實(shí)施權(quán)利要求1-14中任意一項(xiàng)所述的方法。16、一種用于實(shí)施權(quán)利要求1-14中任意一項(xiàng)所述方法的試劑盒，其中該試劑盒包括(i)用于制備蛋白質(zhì)樣品的緩沖液和試劑；(ii)用于將蛋白質(zhì)樣品消化成一系列確定肽的蛋白酶；(iii)用于將所述樣品傳遞到執(zhí)行串聯(lián)質(zhì)譜分析的裝置的載體基質(zhì)；和(iv)用于實(shí)施串聯(lián)質(zhì)譜分析的裝置，該裝置被設(shè)計(jì)用于實(shí)施權(quán)利要求1-14中任意一項(xiàng)所述的方法。17、根據(jù)權(quán)利要求16所述的試劑盒，其中，該試劑盒另外還包括適用于啟動(dòng)所述裝置以實(shí)施權(quán)利要求1-14中任意一項(xiàng)所述方法的軟件。全文摘要本發(fā)明涉及一種使用質(zhì)譜分析(MS)篩選變體肽的方法。本發(fā)明還涉及用于實(shí)施該方法的系統(tǒng)和試劑盒。文檔編號(hào)G01N33/68GK101128739SQ200680003808公開日2008年2月20日申請(qǐng)日期2006年2月1日優(yōu)先權(quán)日2005年2月1日發(fā)明者C·特納,R·N·多爾頓,Y·A·丹尼爾申請(qǐng)人:倫敦國(guó)王學(xué)院;蓋·圣托馬斯Nhs基金會(huì)