專(zhuān)利名稱(chēng)：一種篩選自身抗原的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞生物學(xué)和蛋白質(zhì)領(lǐng)域，具體而言涉及一種快速篩 選自身抗原的方法。本發(fā)明的方法可以在幾個(gè)月內(nèi)從細(xì)胞提取的蛋白 中有效地篩選出自身抗原，而適合為自身免疫病、肺瘤等各種能夠產(chǎn) 生自身抗體的疾病的藥物制備提供有用的靶標(biāo)。
背景技術(shù)：
生物、物理、化學(xué)以及藥物等因素作用于機(jī)體時(shí)，可以使自身抗 原發(fā)生改變、免疫隔離部位抗原釋放、分子模擬效應(yīng)產(chǎn)生、表位擴(kuò)展 以及免疫忽視被打破，這些改變可以引起自身免疫病。二十世紀(jì)七十
年代發(fā)現(xiàn)腫瘤患者體內(nèi)可以檢測(cè)到自身抗體和(或)自身反應(yīng)性T淋 巴細(xì)胞，證實(shí)了腫瘤抗原(自身抗原的一種)的存在[1]。目前認(rèn)為腫
子，^i因突變或重排使正常蛋白分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，糖基化等原因?qū)?致異常的細(xì)胞蛋白特殊的降解產(chǎn)物，隱蔽抗原表位的暴露，胚胎抗原 或分化抗原的異常表達(dá)等。
自身抗原的鑒定對(duì)研究自身免疫病，肺瘤疾病的發(fā)病機(jī)理，機(jī)體
的免疫功能與疾病發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)歸的相互關(guān)系至關(guān)重要；是發(fā)展有效 的疫苗，診斷試劑，治療性抗體，篩選有效藥物靶點(diǎn)的必要前提。因 此自身抗原鑒定的新方法不斷出現(xiàn)，根據(jù)研究目的不同大致可以分為 兩大類(lèi)[2]， 一是以探索新型抗原或抗體為目的方法；二是以評(píng)價(jià)被報(bào) 道過(guò)的抗原或重要功能蛋白為目的方法。第一類(lèi)抗原鑒定的方法應(yīng)用 比較多的主要有兩種，基于cDNA表達(dá)文庫(kù)篩選的血清學(xué)分析方法 (serological analysis of recombinant cDNA expression libraries, SEREX )和基于二維凝膠電泳(two-dimensionalelectrophoresis, 2-DE ) 、 Western-blot的血清學(xué)蛋白質(zhì)組分析方 法(Serological proteome analysis, SERPA)。 第二大類(lèi)方法包括 常規(guī)免疫檢測(cè)方法和應(yīng)用肽序列標(biāo)簽研究抗原的方法，前者包括酶聯(lián) 免疫吸附測(cè)定(enzyme-labeled immunosorbent assay, ELISA )和 蛋白芯片法。
第一大類(lèi)方法立足于發(fā)現(xiàn)新型的自身抗原。cDNA表達(dá)文庫(kù)篩選 的血清學(xué)分析方法是目前文獻(xiàn)報(bào)道比較多的方法，該方法的主要優(yōu)點(diǎn) 是通量高，應(yīng)用多個(gè)抗原特異的血清在一次實(shí)驗(yàn)中可以檢測(cè)多個(gè)腫瘤 相關(guān)抗原。用SEREX方法雖然已經(jīng)鑒定多種腫瘤相關(guān)的抗原[3—9]，但該 技術(shù)的主要缺點(diǎn)比較明顯[6]: l.免疫篩選的原核表達(dá)系統(tǒng)不能對(duì)外源 表達(dá)蛋白進(jìn)行糖基化修飾，不能保證重組蛋白的正確折疊，因此體液 免疫反應(yīng)不能檢測(cè)相應(yīng)抗原的特定表位甚至所有表位；2. cDNA文庫(kù) 的建立對(duì)高表達(dá)水平的抗原有偏好，而相應(yīng)的低豐度抗原可能被漏掉； 3抗原鑒定需要的時(shí)間相當(dāng)長(zhǎng)，工作量很大。SERPA技術(shù)是2000年出 現(xiàn)的鑒定自身抗原的一種方法，該方法以2-DE和Western-blot為基 礎(chǔ)，聯(lián)合蛋白質(zhì)語(yǔ)鑒定策略篩選自身抗原[1°]。與SEREX方法比較，該 方法主要的優(yōu)點(diǎn)是整個(gè)實(shí)驗(yàn)耗時(shí)較短，避免了構(gòu)建cDNA文庫(kù)和預(yù)雜交 消除非特異性結(jié)合的步驟，可以保持蛋白的轉(zhuǎn)錄后修飾，更好地提供
抗原決定簇。
SERPA技術(shù)用于自身抗原的篩選研究雖然已有眾多報(bào)道[1°—21]，但 其主要的不足是2-DE本身的一些缺陷如分離極酸、極堿蛋白和水溶性 差的膜蛋白能力有限，檢測(cè)靈敏度的限制只能鑒定豐度相對(duì)較高的抗 原，另外2-DE是勞動(dòng)密集型實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)的血清越多工作量越大。同時(shí)，
所需患者或?qū)φ昭辶枯^大。第二大類(lèi)方法是對(duì)現(xiàn)有的抗原進(jìn)行評(píng)價(jià)， 而不是探索新型自身抗原的方法。
本發(fā)明人在前人工作的基礎(chǔ)上，對(duì)SERPA技術(shù)進(jìn)行了改進(jìn)。為提
高低豐度抗原被鑒定的幾率，采用亞細(xì)胞蛋白提取的方法將體外培養(yǎng) 的疾病細(xì)胞蛋白分成若干個(gè)組分，如細(xì)胞胞漿蛋白組分，細(xì)胞核蛋白 組分，膜蛋白組分和/或細(xì)胞骨架組份。亞細(xì)胞蛋白組分分離的方法可以采用手工的亞細(xì)胞組分分離方法，也可以釆用商品化的試劑盒進(jìn)行
分離。其次在用SERPA技術(shù)篩選自身抗原之前將每個(gè)蛋白組分用一維 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulf ate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)進(jìn)行分離，做Western印記實(shí)驗(yàn)
(l一Dimensional Western -卩i己， 一維Western -卩i己)4刀篩^玄細(xì)胞的 不同蛋白組分中是否存在自身抗原，篩選可能存在自身抗體的疾病血 清。同時(shí)對(duì)傳統(tǒng)的一維Western印記方法進(jìn)行改進(jìn)，提高檢測(cè)的通量， 降低血清用量。最后選擇含有自身抗原的蛋白組分用2-DE進(jìn)行分離， 然后選擇幾例特定的陽(yáng)性血清和陰性對(duì)照血清進(jìn)行Western印記實(shí)驗(yàn)
(2—Dimensional Western -卩i己，二維Western -卩i己)，在參t匕2—D 凝膠上找到抗原蛋白點(diǎn)，然后質(zhì)i普鑒定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及對(duì)現(xiàn)有鑒定自身抗原的方法SERPA技術(shù)的改進(jìn)。主要 改進(jìn)有四處 一、將細(xì)胞蛋白分成亞細(xì)胞組分，使得低豐度蛋白在相 應(yīng)組分富集；二、加入一維Western印記方法初篩抗原庫(kù)來(lái)源是否適 合抗原蛋白的篩選，確定抗原篩選的蛋白來(lái)源；三、對(duì)傳統(tǒng)的一維 Western印記方法進(jìn)行改進(jìn)，提高檢測(cè)的通量以適合大規(guī)模的血清篩 選；確定能夠產(chǎn)生抗體的血清和候選抗原的分子量；四、降低傳統(tǒng) SERPA技術(shù)應(yīng)用的血清例數(shù)，僅需要選擇幾例陽(yáng)性血清和陰性血清分 別做二維Western印記實(shí)驗(yàn)，在二維凝膠上確定抗原蛋白點(diǎn)的位置即 可。本發(fā)明方法可以高通量的篩選自身抗原，更適合鑒定難度大的低 豐度抗原的篩選和血清抗體發(fā)生率低的病例篩選。
本發(fā)明具體提供了下述篩選自身抗原的方法，包括步驟
1) 選擇可能含有抗原的蛋白樣品；
2) 將所述可能含有抗原的蛋白樣品分成亞蛋白組分；
3) 對(duì)每種蛋白組分進(jìn)行一維Western印記初篩；
4 )根據(jù)一維Western印記實(shí)驗(yàn)的結(jié)果選擇陽(yáng)性率高的亞蛋白組 分作為二維Western印記的可能含有抗原的蛋白樣品；5)通過(guò)二維Western印記對(duì)4)中的可能含有抗原的蛋白樣品 進(jìn)行篩選和質(zhì)語(yǔ)鑒定。
本發(fā)明還提供了下述篩選自身抗原的方法，包括步驟
1) 釆用選擇的細(xì)胞系作為可能含有抗原的蛋白樣品的來(lái)源；
2) 將所述細(xì)胞系的細(xì)胞蛋白分成亞蛋白組分；
3) 以患者或健康人對(duì)照血清作為一抗，對(duì)每種蛋白組分進(jìn)行一 維Western印記初篩；
4) 總結(jié)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組陽(yáng)性信號(hào)的規(guī)律，比較分析二者在不同 分子量的信號(hào)差異，包括陽(yáng)性率和信號(hào)相對(duì)強(qiáng)弱的差異；
5) 根據(jù)一維Western印記實(shí)驗(yàn)的結(jié)果選擇可以產(chǎn)生自身抗體的 典型血清為一抗，選擇陰性血清為對(duì)照，選擇陽(yáng)性率高的亞蛋白組分 作為二維Western印記的可能含有抗原的蛋白樣品；
6) 采用5)中選擇的一抗、對(duì)照，通過(guò)二維Western印記對(duì)5) 中的可能含有抗原的蛋白樣品進(jìn)行篩選和質(zhì)語(yǔ)鑒定。
本發(fā)明還提供了下述篩選自身抗原的方法，包括步驟
1) 首先確定可能含有抗原的蛋白樣品的來(lái)源。由于組織難以避 免血清的污染和組織的異質(zhì)性，建議用細(xì)胞系作為蛋白庫(kù)的來(lái)源。用 商品化的試劑盒將細(xì)胞蛋白分成亞蛋白組分，即胞漿蛋白組分，膜系 統(tǒng)蛋白組分，細(xì)胞核蛋白組分和/或細(xì)胞骨架組份。
2) 將每種蛋白組分用一維的SDS聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行分離， 將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜或硝酸纖維素膜上。轉(zhuǎn)有蛋白的PVDF切 成盡量窄的小條，每個(gè)PVDF小條做好標(biāo)記放入8通道或12通道的雜 交盤(pán)中，每個(gè)通道放一根，然后以患者或健康對(duì)照血清為一抗按照 Western印記的程序做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
3) 總結(jié)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組陽(yáng)性信號(hào)的規(guī)律，比較分析二者在不同 分子量的信號(hào)差異，包括陽(yáng)性率和信號(hào)相對(duì)強(qiáng)弱的差異。
4) 二維Western印記實(shí)驗(yàn)才艮據(jù)一維Western印記實(shí)驗(yàn)的結(jié)果 選擇幾例可以產(chǎn)生自身抗體的典型血清為一抗，進(jìn)行二維Western印記實(shí)驗(yàn)篩選候選抗原，同時(shí)選擇陰性血清為對(duì)照。在未轉(zhuǎn)膜的2-D聚丙 烯酰胺凝膠上找到對(duì)應(yīng)的蛋白點(diǎn)，然后挖點(diǎn)、酶解、質(zhì)傳鑒定、生物學(xué) ^i。


圖1.本發(fā)明的疾病自身抗原鑒定的方法的流程圖。
圖2.免疫沉淀和Western印記方法IHi食管癌和健康對(duì)照血清中
抗enolase-l自身抗體的表達(dá)量。C表示食管癌血清，N表示對(duì)照血清，
B表示陰性對(duì)照。
圖3.免疫組化方法驗(yàn)證食管鱗癌候選相關(guān)抗原enolase-1在癌 組織和癌旁正常食管上皮中的表達(dá)，其中①，②為食管癌組織，③，④ 為食管癌旁正常組織，①，③x 200;②，④x 400。
圖4.腫瘤候選相關(guān)抗原PGK1在食管鱗狀細(xì)胞癌組織和癌旁正常 組織中的表達(dá)，其中①，②為食管癌組織，③，④為食管癌旁正常組織， ①，③x 200;②，④x 400。
具體實(shí)施例方式
^^明將在下面的實(shí)施例中進(jìn)"^^^ ^i^L明并不局限于實(shí)施例。 實(shí)施例l:食管鱗癌腫瘤相關(guān)抗原的鑒定
細(xì)lfe^養(yǎng)^f絲細(xì)胞系EC0156和KYSE410 (EC0156細(xì)胞系源自中國(guó)醫(yī)學(xué)辨 ^Jt瘤艦所，可以參考級(jí)Wang Q， Xu Y， Zhao X， Chang Y， Liu Y， Jiang L， Sha簡(jiǎn)J， Seo DK ， Yan H. A facile one-step in situ functionalization of quantum dots with preserved photoluminescence for bioconjugation, /血Cta 5bc2007; 129: 6380"6381; KYSE410細(xì)胞系是日^:科醫(yī)學(xué)院島田豐t^Hfttt)
1) EC0156和KYSE410細(xì)胞分別培養(yǎng)于達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基 (Dulbecco， s Modified Eagle， s Medium,醒M)和RPMI1640培養(yǎng)基
中，培養(yǎng)基含有10。/。滅活胎牛血清，100U/ml青霉素和100jjg/ml鏈霉素， 在5%(]02的37X:孵箱(NAPC0, Winchester, VA )中培養(yǎng)。
2) 應(yīng)用亞細(xì)胞蛋白提取試劑盒"ProteoExtract Kits" (Cat-No. 539790， MERCK公司)將EC0156和KYSE410細(xì)胞蛋白分成三個(gè)或四個(gè)亞組分，包括胞漿蛋白，細(xì)胞膜系統(tǒng)蛋白、細(xì)胞核蛋白組分和細(xì)
胞骨架組份。應(yīng)用Bradford法進(jìn)行蛋白定量[22]。
3) 用一維SDS聚丙烯酰胺凝膠分離不同蛋白組分采用微型電 泳槽(VE-180型，上海天能科技有限公司;Mini PROTEAN 3， Bio-Rad 公司)，12%的聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白。用1. Omm厚含有2個(gè)梳齒的 梳子(其中一個(gè)梳齒寬約3mm;另外一個(gè)梳齒寬約75mm)取代常規(guī)的 10或15個(gè)梳齒的梳子制作上層積聚膠。將預(yù)染蛋白分子量標(biāo)記加入 到3隱寬的孔中，將要分離的蛋白樣品加入到75mm寬的孔中。也可以 選用商品化的預(yù)置梯度膠進(jìn)行蛋白分離。
4) 轉(zhuǎn)膜用小型轉(zhuǎn)印i殳備(Mini Trans-Blot轉(zhuǎn)印槽，Bio-Rad 公司)將聚丙烯酰胺凝膠釆用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜條件為4 。C110V電壓1. 5小時(shí)。
5) 分割PVDF膜將轉(zhuǎn)有蛋白的PVDF膜夾入兩層干凈的玻璃紙 中間，玻璃紙下面墊一塊兒干凈的玻璃板，用一次性手術(shù)刀片沿與預(yù) 染蛋白分子量標(biāo)記平行的方向?qū)⒛で谐?-4mm寬的小條，將每個(gè)小條 做好標(biāo)記后放入8通道的雜交盤(pán)中，每條通道放一個(gè)。
6) —維Western印記實(shí)驗(yàn)每個(gè)通道加入lml的TBST (20mM Tris-HCl， pH7.5; 50mMNaCl; 0. l%Tween-20)配置的5°/。脫脂牛奶室 溫封閉3小時(shí)或4匸封閉過(guò)夜；吸出封閉液，加入lml 5%脫脂牛奶稀 釋的食管癌或健康對(duì)照血清(稀釋比例1: 200 )，室溫孵育3小時(shí)或 4匸孵育過(guò)夜；用洗膜緩沖液(20mMTris-HCl， pH7. 5; 200mMNaCl; 0. l°/。Tween-20)洗10次，每次5min;然后加入辣纟艮過(guò)氧化物酶標(biāo)記 的山羊抗人IgG的二抗，室溫孵育1小時(shí)，用洗膜緩沖液洗10次，每 次5min。將每個(gè)PVDF膜小條重新拼接在一起，等比例混合ECL超敏 化學(xué)發(fā)光試劑盒(Cat.No.P1020，北京普利萊基因科技有限公司)的 A液和B液，均勻地加到膜上，暗室曝光、顯影、定影。
7) 陽(yáng)性信號(hào)規(guī)律總結(jié)確定腫瘤相關(guān)抗原可能存在的蛋白組分 和相對(duì)分子量的大小，總結(jié)食管癌和健康對(duì)照血清中自身抗體發(fā)生的 陽(yáng)性率，相對(duì)信號(hào)強(qiáng)弱的規(guī)律。本實(shí)例發(fā)現(xiàn)EC0156胞漿蛋白組分中腫瘤候選相關(guān)抗原有明顯的規(guī)律分布，主要集中在50, 43， 37， 110， 82, 105， 70, 25kDa的蛋白條帶上；細(xì)胞膜系統(tǒng)蛋白組分無(wú)明顯腫瘤 相關(guān)抗原規(guī)律分布。KYSE410胞漿蛋白組分中腫瘤候選相關(guān)抗原主要 集中在53, 45和37kDa的蛋白條帶上；而細(xì)胞膜系統(tǒng)蛋白組分無(wú)明顯 腫瘤相關(guān)抗原規(guī)律分布。
8 ) 2-D電泳首先將EC0156和KYSE41Q細(xì)胞的胞漿組分蛋白分 別用微型的等電聚焦設(shè)備(ZOOM IPG Runner System ， Invitrogen 公司)按照蛋白的等電點(diǎn)不同進(jìn)行分離。具體操作步驟如下將lOOjjg 的蛋白加入到155pl水化液(8M脲，2% CHAPS, 65mM DTT， 0. 5% IPG 緩沖液，痕量的溴酚藍(lán))，蛋白充分溶解后，緩慢加入到暗盒(Cat. No. ZM0003, Invitrogen公司)的IPG溝槽內(nèi)，將7cmpH3-10的線(xiàn)性IPG 膠條(Cat. No. 163-2000, Bio-Rad公司)膠面朝上緩慢插入到IPG 溝槽內(nèi)，注意避免氣泡產(chǎn)生，用膠帶封閉上樣孔，室溫水化過(guò)夜，然 后進(jìn)行等電聚焦。等電聚焦的條件200V 20min, 450V 15min, 750V 15min， 2000V lOOmin。從暗盒中取出IPG膠條在平衡緩沖液(50 mM Tris-CI pH8. 8， 6M脲，30%甘油，2% SDS， 65mM DTT，痕量的溴酚 藍(lán))中進(jìn)行平衡15min,然后向不含DTT的平衡緩沖液中加入碘乙酰 胺(終濃度140niM)進(jìn)行蛋白烷化，15min。最后進(jìn)行二維的SDS聚丙 烯酰胺凝膠電泳實(shí)驗(yàn)。
9 ) 二維Western印記實(shí)驗(yàn)將2-D聚丙烯酰胺凝膠分離的蛋白 轉(zhuǎn)到PVDF膜上，根據(jù)一維Western印記實(shí)驗(yàn)結(jié)果總結(jié)的規(guī)律有目的的 選擇疾病血清和對(duì)照血清進(jìn)行二維Western印記實(shí)驗(yàn)。
10) 在未轉(zhuǎn)膜的2-D凝膠上找到候選抗原蛋白點(diǎn)，進(jìn)行挖點(diǎn)、酶 解、質(zhì)鐠鑒定。本實(shí)例用MALDI-T0F/T0F (Ultraflex III TOF/TOF, Bruker公司)進(jìn)行鑒定，用Mascot搜索引擎搜索NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，Mascot score>65， p<0. 05。
11) 鑒定結(jié)果和生物學(xué)驗(yàn)證本實(shí)例在EC0156細(xì)胞中首次鑒定了 食管癌相關(guān)的候選腫瘤抗原enolase-l， phosphoglycerate kinase 1
(PGK1 ) , heat shock protein 105kDa ( HSP105 ) ， vi畫(huà)lin，phosphoglycerate mutase 1和triosephosphate isomerase 1; 在 KYSE410細(xì)胞中鑒定到兩個(gè)腫瘤相關(guān)抗原P53和MBP-1。眾所周知P53 是比較常見(jiàn)的腫瘤相關(guān)抗原，而MBP-1是enolase-l的截短表達(dá)形式， 是癌基因c-/z7/c P2啟動(dòng)子的負(fù)調(diào)控蛋白。目前對(duì)enolase-l和PGK1 進(jìn)行了生物學(xué)驗(yàn)證。免疫沉淀和Western印記的方法驗(yàn)證了食管癌血 清中存在高滴度的抗enolase-l的自身抗體，免疫組化結(jié)果顯示 enolase-l在食管癌組織中明顯高表達(dá)，且亞細(xì)胞定位發(fā)生了異常改 變。免疫組化結(jié)果顯示PGK1在食管癌組織中表達(dá)明顯高于癌旁正常組 織，且細(xì)胞定位也發(fā)生了異常改變。其余候選抗原正在驗(yàn)證過(guò)程中。
根據(jù)上述實(shí)施例，本領(lǐng)域的技術(shù)人員完全可以想到將本發(fā)明的方 法應(yīng)用到其他細(xì)胞系中，對(duì)自身抗原進(jìn)行篩選。對(duì)于本發(fā)明的方法的 變形、改良都包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
技術(shù)效果
通過(guò)本發(fā)明的方法可以避免傳統(tǒng)的SERPA技術(shù)篩選疾病抗原的盲 目性直接用二維Western印記去篩選自身抗原，存在某種程度的盲 目性?？乖瓉?lái)源(如細(xì)胞系)和血清的選擇雖然具有一定的隨機(jī)性， 但同時(shí)具有一定的偏見(jiàn)性和盲目性，如初選的抗原來(lái)源可能不一定適 合自身抗原的篩選或所選的血清可能根本沒(méi)有抗體的產(chǎn)生。而本發(fā)明 的方法中加入了一維Western印記實(shí)驗(yàn)初篩抗原庫(kù)，同時(shí)隨才幾的大量 篩選疾病血清，既保證了實(shí)驗(yàn)的隨機(jī)性又避免了盲目性，可以避免浪 費(fèi)大量珍貴的血清標(biāo)本和寶貴的時(shí)間。
此外，通過(guò)本發(fā)明的方法，對(duì)一維Western印記本身的改進(jìn)可以 明顯提高血清篩選的速度，傳統(tǒng)的一維Western印記方法一周內(nèi)只能 篩選十幾例血清，而本發(fā)明中改進(jìn)一維Western印記方法一周內(nèi)可以 篩選上百例血清，適合大規(guī)模的篩選實(shí)驗(yàn)。改進(jìn)的一維Western印記 實(shí)驗(yàn)明顯提高了抗原抗體結(jié)合的效率，血清和抗原庫(kù)蛋白需要量明顯 減少。顯改善低豐度抗原在某一組分的富集程度，提高了這類(lèi)抗原被鑒定的
可能性；另外亞組分的分離可以?xún)?yōu)先篩選抗原存在概率大的組分，如 自身免疫性疾病中抗原主要集中在胞漿和胞核蛋白組分，實(shí)際操作中 可以對(duì)這兩個(gè)組分進(jìn)行優(yōu)先篩選。
通過(guò)本發(fā)明的方法用一維Western印記實(shí)驗(yàn)初篩抗原后，明確了 典型病例血清和候選抗原的分子量大小，因此在做二維Western印記 實(shí)驗(yàn)時(shí)可以做到有的放矢，僅需要用幾例典型患者血清和對(duì)照血清為 一抗，在2-D凝膠上確定抗原蛋白點(diǎn)即可，明顯降低了傳統(tǒng)SERPA技 術(shù)的工作量。
通過(guò)本發(fā)明的方法采用微型電泳及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)較傳統(tǒng)SERPA技術(shù)中 應(yīng)用的大型電泳轉(zhuǎn)膜設(shè)備可操作性更強(qiáng)。參考文獻(xiàn) Shiku H， Takahashi T， Resnick LA， et al. Cell surface antigens of human malignant melanoma. III. Recognition of autoantibodies with unusual characteristics [J]. J Exp Med， 1977， 145: 784-789 Caron M， Choquet-Kastylevsky G, Joubert-Caron R. Cancer immunomics using autoantibody signatures for biomarker discovery[J]. Mol Cell Proteomics， 2007， 6: 1115-1122 Sahin U， Tureci 0, Schmitt H， et al. Human neoplasms elicit multiple specific immune responses in the autologous host[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1995， 92: 11810-11813 Chen YT， Scanlan MJ， Sahin U, et al. A testicular antigen aberrantly expressed in human cancers detected by autologous antibody screening [J], Proc Natl Acad Sci U S A， 1997， 94: 1914-1918 Diesinger I， Bauer C， Brass N， et al. Toward a more complete recognition of immunoreactive antigens in squamous cell lung carcinoma[J]. Int J Cancer, 2002， 102: 372-378 Wang X， Yu J， Sreekumar A， et al. Autoantibody signatures in prostate cancer [J〗.N Engl J Med， 2005， 353: 1224-1235 Fernandez Madrid F， Tang N， Alansari H， et al. Improved approach to identify cancer—associated autoantigens[J], Autoimmun Rev, 2005， 4: 230-235 Shimada H， Kuboshima M， Shiratori T， et al. Serum anti-myomegalin antibodies in patients with esophageal squamous cell carcinoma [J〗.Int J Oncol， 2007， 30: 97-103 Nesslinger NJ， Sahota RA， Stone B， et al. Standard treatments induce antigen-specific immune responses in prostate cancer [J〗.Clin Cancer Res, 2007， 13: 1493-1502[10] Prasannan L， Misek DE， Hinderer R， et al. Identification of beta-tubulin isoforms as tumor antigens in neuroblastoma [J]. Clin Cancer Res， 2000， 6: 3949-3956 Klade CS， Voss T， Krystek E， et al. Ident if icat ion of tumor antigens in renal cell carcinoma by serological proteome analysis [J]. Proteomics, 2001， 1: 890-898 Brichory FM， Misek DE， Yim AM, et al. An immune response manifested by the common occurrence of annexins I and II autoantibodies and high circulating levels of IL-6 in lung cancer [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2001， 98: 9824-9829 Brichory F， Beer D， Le Naour F， et al. Proteomics-based identification of protein gene product 9.5 as a tumor antigen that induces a humoral immune response in lung cancer[J]. Cancer Res, 2001， 61: 7908-7912 Le Naour F， Misek DE， Krause MC， et al. Proteomics-based identification of RS/DJ-1 as a novel circulating tumor antigen in breast cancer [J]. Clin Cancer Res， 2001， 7: 3328-3335 Le Naour F, Brichory F， Misek DE， et al. A distinct repertoire of autoantibodies in hepatocellular carcinoma identified by proteomic analysis[J]. Mol Cell Proteomics, 2002， 1: 197-203 Kellner R， Lichtenfels R， Atkins D， et al. Targeting of tumor associated antigens in renal cell carcinoma using proteome-based analysis and their clinical significance [J]. Proteomics, 2002, 2: 1743-1751 Seliger B， Menig M， Lichtenfels R， et al. Identification of markers for the selection of patients undergoing renal cell carcinoma-specific immunotherapy [J]. Proteomics,2003， 3: 979-990 Hong SH， Misek DE， Wang H， et al. An autoant ibody-mediated immune response to calreticulin isoforms in pancreatic cancer [J]. Cancer Res， 2004， 64: 5504-5510 Canelle L， Bousquet J， Pionneau C， et al. An efficient proteomics—based approach for the screening of autoantibodies [J〗.J Immunol Methods, 2005， 299: 77-89 Cui JW，Li WH，Wang J，et al. Proteomics-based identification of human acute leukemia antigens that induce humoral immune response"]. Mol Cell Proteomics, 2005， 4: 1718-1724 Li C， Xiao Z， Chen Z， et al. Proteome analysis of human lung squamous carcinoma [J]. Proteomics, 2006， 6: 547-558 Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J]. Anal Biochem, 1976， 72: 248-25權(quán)利要求
1.篩選自身抗原的方法，包括步驟1)選擇可能含有抗原的蛋白樣品；2)將所述可能含有抗原的蛋白樣品分成亞蛋白組分；3)對(duì)每種蛋白組分進(jìn)行一維Western印記初篩；4)根據(jù)一維Western印記實(shí)驗(yàn)的結(jié)果選擇陽(yáng)性率高的亞蛋白組分作為二維Western印記的可能含有抗原的蛋白樣品；5)通過(guò)二維Western印記對(duì)4)中的可能含有抗原的蛋白樣品進(jìn)行篩選和質(zhì)譜鑒定。
2. 權(quán)利要求1中的篩選自身抗原的方法，包括步驟1) 釆用選擇的細(xì)胞系作為可能含有抗原的蛋白樣品的來(lái)源； 2 ) 將所述細(xì)胞系的細(xì)胞蛋白分成亞蛋白組分；3) 以患者或健康人對(duì)照血清作為一抗，對(duì)每種蛋白組分進(jìn)行 一維Western印記初篩；4) 總結(jié)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組陽(yáng)性信號(hào)的規(guī)律，比較分析二者在不 同分子量的印記信號(hào)差異，包括陽(yáng)性率和信號(hào)相對(duì)強(qiáng)弱的差異；5 ) 根據(jù)一維Western印記實(shí)驗(yàn)的結(jié)果選擇可以產(chǎn)生自身抗體 的典型血清為一抗，選擇陰性血清為對(duì)照，選擇陽(yáng)性率高的亞蛋白組 分作為二維Western印記的可能含有抗原的蛋白樣品；6) 釆用5)中選擇的一抗、對(duì)照，通過(guò)二維Western印記對(duì) 5)中的可能含有抗原的蛋白樣品進(jìn)行篩選和質(zhì)譜鑒定。
3. 權(quán)利要求2的方法，其中步驟l)中的細(xì)胞系選自人的腫瘤細(xì) 胞或者其他疾病相關(guān)細(xì)胞。
4. 權(quán)利要求2的方法，其中步驟2)中的亞蛋白組分包括胞漿蛋 白組分，膜系統(tǒng)蛋白組分，細(xì)胞骨架組份和/或細(xì)胞核蛋白組分。
5. 權(quán)利要求2的方法，其中步驟2)中的分成亞蛋白組分的方法 包括釆用商品化的試劑盒。
6. 權(quán)利要求1的篩選自身抗原的方法，其中含有抗原的蛋白樣品 是EC0156和KYSE410細(xì)胞。
7. 權(quán)利要求1的篩選自身抗原的方法，其中篩選到的抗原是 enolase-l、 PGK1、 HSP105、 vinculin、 phosphoglycerate mutase 1、 triosephosphate isomerase 1、 P53和MBP-1。
全文摘要
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體而言涉及一種改進(jìn)的篩選自身抗原的方法。本發(fā)明通過(guò)提供下述方法將細(xì)胞蛋白分成亞細(xì)胞組分；進(jìn)行改良的一維Western印記方法初篩；進(jìn)行二維Western印記的確定性篩選。解決了常規(guī)篩選方法流失低豐度組分，篩選效率低的問(wèn)題，所述方法可以全面高效地從細(xì)胞提取的蛋白中篩選出自身抗原，為自身免疫病、腫瘤等各種能夠產(chǎn)生自身抗體的疾病的藥物制備提供有用的靶標(biāo)。
文檔編號(hào)G01N33/53GK101556278SQ20081008958
公開(kāi)日2009年10月14日 申請(qǐng)日期2008年4月8日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月8日
發(fā)明者喬媛媛, 趙曉航, 高紅軍 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所;中國(guó)人民解放軍海軍總醫(yī)院