專利名稱：一種篩選d－核糖高轉(zhuǎn)化率菌種的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種產(chǎn)D-核糖菌種的篩選方法，尤其涉及一種通過(guò)測(cè)定中間代謝產(chǎn)物篩選D-核糖高轉(zhuǎn)化率菌種的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
D-核糖是一種具有醛基的五碳糖，是生物體內(nèi)核糖核酸(RNA)、脫氧核糖核酸(DNA)以及核苷酸的重要組成部分，是合成部分氨基酸、輔酶和堿基的中間產(chǎn)物，具有重要的生理功能。D-核糖產(chǎn)品主要用于合成維生素B2和生產(chǎn)食品鮮味劑，還可用來(lái)合成類固醇、前列腺素類、萜類化合物、凝乳酶抑制因子等。近年來(lái)利用D-核糖為原料合成抗病毒和抗癌藥物等核酸類藥物的研究也十分活躍。D-核糖還具有一定的醫(yī)療保健作用，具有增強(qiáng)心臟抵抗心肌局部缺血的能力，還可用于治療由于劇烈運(yùn)動(dòng)引起的肌肉酸痛和由于腺苷脫氫酶缺失引起的肌肉僵硬等病癥。
D-核糖的生產(chǎn)方法主要有三種，一是由核酸類物質(zhì)水解提取，二是以葡萄糖、阿拉伯糖等為原料化學(xué)合成，三是利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)。比較而言微生物發(fā)酵法生產(chǎn)D-核糖生產(chǎn)效率高、工藝簡(jiǎn)便、生產(chǎn)成本低。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)D-核糖通常采用轉(zhuǎn)酮酶缺失菌株，一般是以從土壤獲得或保藏菌株作為親株，通過(guò)誘變篩選積累D-核糖的轉(zhuǎn)酮酶缺失突變株，然后通過(guò)誘變篩選不生孢子的突變株來(lái)提高D-核糖產(chǎn)率。利用轉(zhuǎn)酮酶缺失微生物菌株發(fā)酵生產(chǎn)D-核糖的專利有US3919046(1975)，US3970522(1976)，US4904587(1990)，US5281531(1994)。
從微生物代謝途徑分析，轉(zhuǎn)酮酶缺失菌種自身不能合成莽草酸，表現(xiàn)為莽草酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型，所以D-核糖生產(chǎn)菌株的篩選一般采用誘變以后，以莽草酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型為標(biāo)記篩選轉(zhuǎn)酮酶缺失菌株。具體做法為菌種通過(guò)誘變處理以后涂布完全培養(yǎng)基平板，然后挑取單菌落同時(shí)點(diǎn)種于基本培養(yǎng)基平板和添加有莽草酸的基本培養(yǎng)基平板，放置合適的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，然后挑取在基本培養(yǎng)基沒(méi)有生長(zhǎng)，在添加有莽草酸的平板有生長(zhǎng)的菌落，再通過(guò)搖瓶培養(yǎng)篩選積累D-核糖的菌株。
經(jīng)檢索，文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)一步提高D-核糖產(chǎn)率的方法有以下幾種1.采用傳統(tǒng)誘變方法以芽孢桿菌不生內(nèi)生孢子為依據(jù)篩選高產(chǎn)D-核糖菌株。
2.據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道D-核糖生產(chǎn)菌株一般都在發(fā)酵液中積累D-葡萄糖酸，這樣不但減少了D-核糖的收率，并給D-核糖提取帶來(lái)了一定的困難。D-葡萄糖酸是通過(guò)D-葡萄糖脫氫酶旁路合成，基于這樣一個(gè)事實(shí)，Eur.Pat.0501756-A1提出并實(shí)施了一種通過(guò)基因工程技術(shù)選育高產(chǎn)D-核糖菌種的策略，即通過(guò)提高D-核糖生產(chǎn)菌株的葡萄糖酸操縱子的表達(dá)量，加快葡萄糖酸被利用并轉(zhuǎn)化為D-核糖速率。
3.采用傳統(tǒng)誘變方法通過(guò)測(cè)定發(fā)酵液中D-核糖含量篩選高產(chǎn)菌株，是目前D-核糖菌種選育過(guò)程中最常使用的方法，但這種方法工作量大，并且?guī)в忻つ啃?，另外D-核糖的分析測(cè)定方法也限制了該方法的大量使用。D-核糖是一種具有還原性的呋喃型單糖，沒(méi)有特異性的化學(xué)分析測(cè)定方法，目前使用的苔黑酚比色法是測(cè)定五碳糖的方法，專一性不強(qiáng)，容易受其它五碳糖的干擾。另外該方法所用化學(xué)試劑苔黑酚穩(wěn)定性差，需要新鮮配制，并且用量較大，價(jià)格偏高，不適合做大量的菌種選育的分析。用高壓液相色譜分析，測(cè)定專一性強(qiáng)，但運(yùn)行費(fèi)用昂貴，直接測(cè)定發(fā)酵液，分離柱容易受到污染，同樣不適合菌種篩選工作。
目前工業(yè)生產(chǎn)中使用的生產(chǎn)菌株絕大多數(shù)仍是通過(guò)傳統(tǒng)誘變的方法選育獲得的，通過(guò)代謝工程選育生產(chǎn)菌株仍處于研究階段。然而，在生產(chǎn)實(shí)踐中建立一套行之有效的菌株選育方法對(duì)保證生產(chǎn)的正常運(yùn)行非常必要。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明要解決的問(wèn)題是在發(fā)酵法生產(chǎn)D-核糖技術(shù)深入研究的基礎(chǔ)上提出一種篩選高產(chǎn)、高轉(zhuǎn)化率D-核糖生產(chǎn)菌種的方法。
實(shí)驗(yàn)表明本發(fā)明提供的篩選D-核糖高轉(zhuǎn)化率菌種的方法，簡(jiǎn)便易行，準(zhǔn)確度高，特別適用于企業(yè)、科研對(duì)D-核糖生產(chǎn)菌株的日常選育和定期復(fù)壯。
本發(fā)明涉及的篩選D-核糖高轉(zhuǎn)化率菌種的方法是基于以下原理設(shè)計(jì)的。
申請(qǐng)人研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)酮酶缺失D-核糖生產(chǎn)菌株在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生一種與斐林試劑發(fā)生反應(yīng)的非糖類化合物，經(jīng)色質(zhì)聯(lián)用儀分析鑒定該化合物為3-羥基丁酮。經(jīng)文獻(xiàn)檢索，文獻(xiàn)(J.Appl.Microbiol.8325-30.)曾報(bào)道D-核糖生產(chǎn)菌株ATCC21951在發(fā)酵液中也積累3-羥基丁酮，本申請(qǐng)人又進(jìn)一步對(duì)多株D-核糖生產(chǎn)菌株進(jìn)行發(fā)酵分析，發(fā)現(xiàn)并證實(shí)D-核糖生產(chǎn)菌株在發(fā)酵液中積累3-羥基丁酮具有普遍性。
通過(guò)對(duì)糖代謝途徑分析發(fā)現(xiàn)3-羥基丁酮是由丙酮酸通過(guò)2，3-丁二醇環(huán)途徑合成的。微生物一般通過(guò)兩條代謝途徑降解葡萄糖生成丙酮酸糖酵解途徑(EMP)和磷酸戊糖循環(huán)途徑(PPC)途徑。在EMP途徑中葡萄糖轉(zhuǎn)化成1，6-二磷酸果糖后，在醛縮酶的催化下，裂解成兩個(gè)3碳化合物(3-磷酸甘油醛和磷酸二羥丙酮)，由此轉(zhuǎn)化成2分子丙酮酸；在PPC途徑中葡萄糖轉(zhuǎn)化生成6-磷酸葡萄糖酸后，通過(guò)戊糖磷酸循環(huán)生成3-磷酸甘油醛，3-磷酸甘油醛直接進(jìn)入EMP生成丙酮酸。D-核糖是生產(chǎn)菌株經(jīng)由PPC途徑合成的，但D-核糖生產(chǎn)菌株因?yàn)檗D(zhuǎn)酮酶缺失，PPC途徑不完整，不能合成3-磷酸甘油醛，因此D-核糖產(chǎn)生菌株發(fā)酵液中積累的3-羥基丁酮可以斷定是通過(guò)EMP途徑生成的。
在D-核糖發(fā)酵過(guò)程中EMP和PPC途徑對(duì)底物葡萄糖形成競(jìng)爭(zhēng)性消耗，從代謝調(diào)控的角度來(lái)講，如果能有效抑制EMP途徑的代謝流，減少葡萄糖通過(guò)EMP途徑的代謝量，使葡萄糖最大限度的通過(guò)PPC途徑代謝，合成D-核糖，則有利于提高葡萄糖生成D-核糖的轉(zhuǎn)化率，增加D-核糖產(chǎn)率。
理想的D-核糖生產(chǎn)代謝菌株，EMP代謝途徑缺失或越弱越好。通過(guò)上述分析可知轉(zhuǎn)酮酶缺失的D-核糖生產(chǎn)菌株副產(chǎn)物3-羥基丁酮主要通過(guò)EMP途徑合成。因此通過(guò)測(cè)定D-核糖發(fā)酵液中3-羥基丁酮的含量就可以估計(jì)D-核糖發(fā)酵菌株EMP途徑代謝流的強(qiáng)弱，以此來(lái)評(píng)價(jià)D-核糖發(fā)酵菌株轉(zhuǎn)化葡萄糖生產(chǎn)D-核糖的能力的大小。
基于上述原理，申請(qǐng)人提出了一種篩選高產(chǎn)、高轉(zhuǎn)化率D-核糖生產(chǎn)菌種方法。
本發(fā)明所述的篩選D-核糖高轉(zhuǎn)化率菌種的方法，其步驟是以常規(guī)方法誘變轉(zhuǎn)酮酶缺失的D-核糖生產(chǎn)菌株，涂布平板分離單菌落，挑取單菌落移接斜面，35-37℃培養(yǎng)45-55小時(shí)，選成熟斜面再以35-37℃、200轉(zhuǎn)/分鐘條件進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)55-65小時(shí)，取發(fā)酵液4000-5000轉(zhuǎn)/分鐘離心10-15分鐘，然后測(cè)定離心后發(fā)酵清液中的3-羥基丁酮、還原糖及葡萄糖含量，選擇3-羥基丁酮、葡萄糖含量低、還原糖含量高的菌株再常規(guī)方法進(jìn)行復(fù)篩，即可得到D-核糖產(chǎn)率及轉(zhuǎn)化率高的菌株。
在應(yīng)用上述的篩選D-核糖高轉(zhuǎn)化率菌種的方法時(shí)所述3-羥基丁酮含量低，可判定D-核糖發(fā)酵菌株糖酵解途徑(EMP)代謝流弱；葡萄糖含量低說(shuō)明菌株轉(zhuǎn)化葡萄糖的能力強(qiáng)、速度快；在本發(fā)明中斐林試劑測(cè)定的D-核糖發(fā)酵液中還原糖含量是葡萄糖、D-核糖和3-羥基丁酮含量之和，因此如果發(fā)酵液中葡萄糖、3-羥基丁酮含量一定，還原糖含量越高就證明D-核糖含量越高。選擇3-羥基丁酮、葡萄糖含量越低低、還原糖含量越高的菌株轉(zhuǎn)化葡萄糖生產(chǎn)D-核糖的能力的越大，該轉(zhuǎn)酮酶缺失的D-核糖生產(chǎn)菌株越有選擇價(jià)值。
在上述的篩選D-核糖高轉(zhuǎn)化率菌種的方法中所述斜面培養(yǎng)條件優(yōu)選是37℃培養(yǎng)48小時(shí)。
在上述的篩選D-核糖高轉(zhuǎn)化率菌種的方法中所述發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)選是37℃、200轉(zhuǎn)/分鐘條件發(fā)酵培養(yǎng)60小時(shí)。
在上述的篩選D-核糖高轉(zhuǎn)化率菌種的方法中所述3-羥基丁酮含量的測(cè)定方法是將離心后發(fā)酵清液稀釋至可測(cè)定范圍濃度后取1ml，加蒸餾水4ml，充分混勻后再加入以蒸餾水配制的濃度為1g/L的肌酸1ml、以1mol/L NaOH配制的濃度為5g/L的α-萘酚1ml，室溫反應(yīng)50分鐘，以1cm比色池，波長(zhǎng)530nm，測(cè)定吸光度(A)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算發(fā)酵液中3-羥基丁酮的含量。
在上述的篩選D-核糖高轉(zhuǎn)化率菌種的方法中所述還原糖含量的測(cè)定采用斐林試劑定糖法。
在上述的篩選D-核糖高轉(zhuǎn)化率菌種的方法中所述葡萄糖含量的測(cè)定采用SBA-40C型葡萄糖測(cè)定儀。
在上述的篩選D-核糖高轉(zhuǎn)化率菌種的方法中涉及的3-羥基丁酮的測(cè)定原理是3-羥基丁酮與肌酸和甲萘酚反應(yīng)形成粉紅色復(fù)合物，3-羥基丁酮的含量在0-100ug時(shí)該復(fù)合物的在530nm吸光度(A)與3-羥基丁酮的含量呈線性關(guān)系。該方法是經(jīng)典的測(cè)定3-羥基丁酮的方法，反應(yīng)靈敏、專一性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便，適合批量分析。
涉及的3-羥基丁酮標(biāo)準(zhǔn)曲線及其制作方法是配制10mg/L的標(biāo)準(zhǔn)3-羥基丁酮水溶液，取6只比色管，按次序分別加入10mg/L的標(biāo)準(zhǔn)3-羥基丁酮水溶液0ml，0.5ml，1.0ml，1.5ml，2.0ml，2.5ml，然后在上述比色管中加入蒸餾水，使總體積至5ml，再依次加入1g/L的肌酸(蒸餾水配制)1ml、5g/L的α-萘酚(1mol/L NaOH配制)1ml，室溫反應(yīng)50分鐘，以1cm比色池，波長(zhǎng)530nm，測(cè)定吸光度(A)，以3-羥基丁酮的量為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
在斐林試劑定糖法實(shí)驗(yàn)中斐林試劑是常用的單糖的定量測(cè)定方法之一，測(cè)定原理是根據(jù)單糖中含有的醛基和羰基具有還原性，能和斐林試劑中的二價(jià)銅離子定量發(fā)生氧化還原。D-核糖，葡萄糖和3-羥基丁酮都可以與斐林試劑發(fā)生定量反應(yīng)。
在應(yīng)用SBA-40C型葡萄糖測(cè)定儀測(cè)定葡萄糖中測(cè)定原理是利用固定化葡萄糖脫氫酶與葡萄糖進(jìn)行專一性反應(yīng)，不受其它化合物的干擾。
涉及菌種的誘變和培養(yǎng)方法是出發(fā)菌種經(jīng)常規(guī)誘變后，涂布平板分離單菌落，挑取單菌落移接斜面，待斜面菌種成熟后將1～2環(huán)活化的菌種，接種于裝有30ml種子培養(yǎng)基的250ml的三角瓶中，200轉(zhuǎn)/分鐘條件振蕩培養(yǎng)55～72小時(shí)，發(fā)酵液離心去菌體，發(fā)酵清液用來(lái)測(cè)定其中的3-羥基丁酮、還原糖及葡萄糖含量，以還原糖含量高、葡萄糖和3-羥基丁酮含量低的為標(biāo)準(zhǔn)，選育本發(fā)明所述的D-核糖產(chǎn)率及轉(zhuǎn)化率高的菌株。
本發(fā)明是通過(guò)測(cè)定D-核糖生產(chǎn)菌株發(fā)酵液中一種副產(chǎn)物3-羥基丁酮的含量，間接考查該菌株生產(chǎn)D-核糖的效率的，通過(guò)測(cè)定D-核糖發(fā)酵液中3-羥基丁酮的含量就可以估計(jì)D-核糖發(fā)酵菌株EMP途徑代謝流的強(qiáng)弱，以此來(lái)評(píng)價(jià)D-核糖發(fā)酵菌株轉(zhuǎn)化葡萄糖生產(chǎn)D-核糖的能力的大小，實(shí)現(xiàn)了快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、高效的設(shè)計(jì)目的，且本發(fā)明所涉及的3-羥基丁酮、還原糖和葡萄糖的測(cè)定方法都是被普遍采用的，操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、成本低，實(shí)踐證明本發(fā)明提出的生產(chǎn)D-核糖菌種的選育方法，特別適合生產(chǎn)菌種的分離篩選，一方面可以逐步提高生產(chǎn)菌種D-核糖產(chǎn)率和轉(zhuǎn)化率，另一方面可以防止菌種優(yōu)良性狀的退化和消失，在D-核糖的工業(yè)化生產(chǎn)中具有重要意義。
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明又不受實(shí)施例所局限。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1采用紫外線按照常規(guī)方法對(duì)轉(zhuǎn)酮酶缺失D-核糖生產(chǎn)菌株(枯草芽孢桿菌ATCC21952)進(jìn)行誘變，然后適當(dāng)稀釋涂布平板(平板培養(yǎng)基蛋白胨10g/L，酵母浸出物1g/L，硫酸鎂2g/L，氯化鈉3g/L，瓊脂20g/L，pH 7.0-7.2)，37℃培養(yǎng)，待長(zhǎng)出單菌落，挑取單菌落并移接斜面(斜面培養(yǎng)基蛋白胨10g/L，酵母浸出物1g/L，硫酸鎂2g/L，氯化鈉3g/L，瓊脂20g/L，pH 7.0-7.2)，共挑取單菌落移接斜面647支，斜面放置37℃培養(yǎng)48小時(shí)，取成熟斜面一支對(duì)一支接種搖瓶(250ml三角瓶裝30ml發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖120-150g/L，硫酸銨5g/L，玉米漿20g/L，硫酸錳0.2g/L，硫酸鎂0.4g/L，pH 6.0-7.2)，37℃、200轉(zhuǎn)/分鐘搖瓶培養(yǎng)60小時(shí)，發(fā)酵液4000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，留取上清液，備用。
將離心后發(fā)酵清液稀釋至3-羥基丁酮的含量約10mg/L左右，然后取1ml，加蒸餾水4ml，充分混勻后再加入以蒸餾水配制的濃度為1g/L的肌酸1ml、以1mol/L NaOH配制的濃度為5g/L的α-萘酚1ml，室溫反應(yīng)50分鐘，以1cm比色池，波長(zhǎng)530nm，測(cè)定吸光度(A)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算發(fā)酵液中3-羥基丁酮的含量。
上述涉及的3-羥基丁酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法是配制10mg/L的標(biāo)準(zhǔn)3-羥基丁酮水溶液，取6只比色管，按次序分別加入10mg/L的標(biāo)準(zhǔn)3-羥基丁酮水溶液0ml，0.5ml，1.0ml，1.5ml，2.0ml，2.5ml，然后在上述比色管中加入蒸餾水，使總體積至5ml，再依次加入1g/L的肌酸(蒸餾水配制)1ml、5g/L的α-萘酚(1mol/L NaOH配制)1ml，室溫反應(yīng)50分鐘，以1cm比色池，波長(zhǎng)530nm，測(cè)定吸光度(A)，以3-羥基丁酮的量為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
同理，按常規(guī)實(shí)驗(yàn)室方法，以斐林試劑定糖法測(cè)定還原糖的含量；以SBA-40C型葡萄糖測(cè)定儀測(cè)定葡萄糖的含量。
選擇3-羥基丁酮、葡萄糖含量低、還原糖含量高的菌株再進(jìn)行搖瓶復(fù)篩。經(jīng)多次常規(guī)分離篩選后得到4株D-核糖產(chǎn)率和轉(zhuǎn)化率提高的菌株，其中D-核糖產(chǎn)率較現(xiàn)有菌株平均提高30％，轉(zhuǎn)化率提高11％。
實(shí)施例2采用紫外線按照常規(guī)方法對(duì)轉(zhuǎn)酮酶缺失D-核糖生產(chǎn)菌株(短小芽孢桿菌ATCC21951)進(jìn)行誘變，然后適當(dāng)稀釋涂布平板(平板培養(yǎng)基蛋白胨10g/L，酵母浸出物1g/L，硫酸鎂2g/L，氯化鈉3g/L，瓊脂20g/L，pH 7.0-7.2)，37℃培養(yǎng)，待長(zhǎng)出單菌落，挑取單菌落并移接斜面(斜面培養(yǎng)基蛋白胨10g/L，酵母浸出物1g/L，硫酸鎂2g/L，氯化鈉3g/L，瓊脂20g/L，pH 7.0-7.2)，共挑取單菌落移接斜面476支，斜面放置，35℃培養(yǎng)55小時(shí)，取成熟斜面一支對(duì)一支接種搖瓶(250ml三角瓶裝30ml發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖120-150g/L，硫酸銨5g/L，玉米漿20g/L，硫酸錳0.2g/L，硫酸鎂0.4g/L，pH 6.0-7.2)，35℃、200轉(zhuǎn)/分鐘搖瓶培養(yǎng)70小時(shí)，發(fā)酵液5000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，留取上清液，備用。
將離心后發(fā)酵清液稀釋至3-羥基丁酮的含量約10mg/L左右，然后取1ml，加蒸餾水4ml，充分混勻后再加入以蒸餾水配制的濃度為1g/L的肌酸1ml、以1mol/L NaOH配制的濃度為5g/L的α-萘酚1ml，室溫反應(yīng)50分鐘，以1cm比色池，波長(zhǎng)530nm，測(cè)定吸光度(A)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算發(fā)酵液中3-羥基丁酮的含量。
上述涉及的3-羥基丁酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法是配制10mg/L的標(biāo)準(zhǔn)3-羥基丁酮水溶液，取6只比色管，按次序分別加入10mg/L的標(biāo)準(zhǔn)3-羥基丁酮水溶液0ml，0.5ml，1.0ml，1.5ml，2.0ml，2.5ml，然后在上述比色管中加入蒸餾水，使總體積至5ml，再依次加入1g/L的肌酸(蒸餾水配制)1ml、5g/L的α-萘酚(1mol/L NaOH配制)1ml，室溫反應(yīng)50分鐘，以1cm比色池，波長(zhǎng)530nm，測(cè)定吸光度(A)，以3-羥基丁酮的量為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
同理，按常規(guī)實(shí)驗(yàn)室方法，以斐林試劑定糖法測(cè)定還原糖的含量；以SBA-40C型葡萄糖測(cè)定儀測(cè)定葡萄糖的含量。
選擇3-羥基丁酮、葡萄糖含量低、還原糖含量高的菌株再進(jìn)行搖瓶復(fù)篩。經(jīng)多次常規(guī)分離篩選后得到3株D-核糖產(chǎn)率和轉(zhuǎn)化率提高的菌株，其中D-核糖產(chǎn)率較現(xiàn)有菌株平均提高29％，轉(zhuǎn)化率提高12％。
實(shí)施例3采用紫外線按照常規(guī)方法對(duì)轉(zhuǎn)酮酶缺失D-核糖生產(chǎn)菌株進(jìn)行誘變，然后適當(dāng)稀釋涂布平板(平板培養(yǎng)基蛋白胨10g/L，酵母浸出物1g/L，硫酸鎂2g/L，氯化鈉3g/L，瓊脂20g/L，pH 7.0-7.2)，36℃培養(yǎng)，待長(zhǎng)出單菌落，挑取單菌落并移接斜面(斜面培養(yǎng)基蛋白胨10g/L，酵母浸出物1g/L，硫酸鎂2g/L，氯化鈉3g/L，瓊脂20g/L，pH 7.0-7.2)，共挑取單菌落移接斜面539支，斜面放置，36℃培養(yǎng)52小時(shí)，取成熟斜面一支對(duì)一支接種搖瓶(250ml三角瓶裝30ml發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖120-150g/L，硫酸銨5g/L，玉米漿20g/L，硫酸錳0.2g/L，硫酸鎂0.4g/L，pH 6.0-7.2)，36℃、200轉(zhuǎn)/分鐘搖瓶培養(yǎng)56小時(shí)，發(fā)酵液4500轉(zhuǎn)/分鐘離心12分鐘，留取上清液，備用。
將離心后發(fā)酵清液稀釋至3-羥基丁酮的含量約10mg/L左右，然后取1ml，加蒸餾水4ml，充分混勻后再加入以蒸餾水配制的濃度為1g/L的肌酸1ml、以1mol/L NaOH配制的濃度為5g/L的α-萘酚1ml，室溫反應(yīng)50分鐘，以1cm比色池，波長(zhǎng)530nm，測(cè)定吸光度(A)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算發(fā)酵液中3-羥基丁酮的含量。
上述涉及的3-羥基丁酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法是配制10mg/L的標(biāo)準(zhǔn)3-羥基丁酮水溶液，取6只比色管，按次序分別加入10mg/L的標(biāo)準(zhǔn)3-羥基丁酮水溶液0ml，0.5ml，1.0ml，1.5ml，2.0ml，2.5ml，然后在上述比色管中加入蒸餾水，使總體積至5ml，再依次加入1g/L的肌酸(蒸餾水配制)1ml、5g/L的α-萘酚(1mol/L NaOH配制)1ml，室溫反應(yīng)50分鐘，以1cm比色池，波長(zhǎng)530nm，測(cè)定吸光值(A)，以3-羥基丁酮的量為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
同理，按常規(guī)實(shí)驗(yàn)室方法，以斐林試劑定糖法測(cè)定還原糖的含量；以SBA-40C型葡萄糖測(cè)定儀測(cè)定葡萄糖的含量。
選擇3-羥基丁酮、葡萄糖含量低、還原糖含量高的菌株再進(jìn)行搖瓶復(fù)篩。經(jīng)多次常規(guī)分離篩選后得到4株D-核糖產(chǎn)率和轉(zhuǎn)化率提高的菌株，其中D-核糖產(chǎn)率較現(xiàn)有菌株平均提高35％，轉(zhuǎn)化率提高15％。
權(quán)利要求
1.一種篩選D-核糖高轉(zhuǎn)化率菌種的方法，其步驟是以常規(guī)方法誘變轉(zhuǎn)酮酶缺失的D-核糖生產(chǎn)菌株，涂布平板分離單菌落，挑取單菌落移接斜面，35-37℃培養(yǎng)45-55小時(shí)，選成熟斜面再以35-37℃、200轉(zhuǎn)/分鐘條件進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)55-72小時(shí)，取發(fā)酵液4000-5000轉(zhuǎn)/分鐘離心10-15分鐘，然后測(cè)定離心后發(fā)酵清液中的3-羥基丁酮、還原糖及葡萄糖含量，選擇3-羥基丁酮、葡萄糖含量低、還原糖含量高的菌株再進(jìn)行復(fù)篩，即可得到D-核糖產(chǎn)率及轉(zhuǎn)化率高的菌株。
2.如權(quán)利要求1所述的篩選D-核糖高轉(zhuǎn)化率菌種的方法，其特征是所述3-羥基丁酮、葡萄糖含量越低、還原糖含量越高，可判定D-核糖發(fā)酵菌株糖酵解途徑(EMP)代謝流越弱，D-核糖發(fā)酵菌株轉(zhuǎn)化葡萄糖生產(chǎn)D-核糖的能力的越大，該轉(zhuǎn)酮酶缺失的D-核糖生產(chǎn)菌株越有選擇價(jià)值。
3.如權(quán)利要求1所述的篩選D-核糖高轉(zhuǎn)化率菌種的方法，其特征是所述斜面培養(yǎng)條件是37℃培養(yǎng)48小時(shí)。
4.如權(quán)利要求1所述的篩選D-核糖高轉(zhuǎn)化率菌種的方法，其特征是所述發(fā)酵培養(yǎng)條件是37℃、200轉(zhuǎn)/分鐘條件發(fā)酵培養(yǎng)60小時(shí)。
5.如權(quán)利要求1所述的篩選D-核糖高轉(zhuǎn)化率菌種的方法，其特征是所述3-羥基丁酮含量的測(cè)定方法是將離心后發(fā)酵清液稀釋至可測(cè)定范圍濃度后取1ml，加蒸餾水4ml，充分混勻后再加入以蒸餾水配制的濃度為1g/L的肌酸1ml、以1mol/L NaOH配制的濃度為5g/L的α-萘酚1ml，室溫反應(yīng)50分鐘，以1cm比色池，波長(zhǎng)530nm，測(cè)定吸光度(A)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算發(fā)酵液中3-羥基丁酮的含量。
6.如權(quán)利要求1所述的篩選D-核糖高轉(zhuǎn)化率菌種的方法，其特征是所述還原糖含量的測(cè)定采用斐林試劑定糖法。
7.如權(quán)利要求1所述的篩選D-核糖高轉(zhuǎn)化率菌種的方法，其特征是所述葡萄糖含量的測(cè)定采用SBA-40C型葡萄糖測(cè)定儀。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種篩選D－核糖高轉(zhuǎn)化率菌種的方法，其步驟是以常規(guī)方法誘變轉(zhuǎn)酮酶缺失的D－核糖生產(chǎn)菌株，涂布平板分離單菌落，挑取單菌落移接斜面，35－37℃培養(yǎng)45－55小時(shí)，選成熟斜面再以35－37℃、200轉(zhuǎn)/分鐘條件進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)55－72小時(shí)，取發(fā)酵液4000－5000轉(zhuǎn)/分鐘離心10－15分鐘，然后測(cè)定離心后發(fā)酵清液中的3－羥基丁酮、還原糖及葡萄糖含量，選擇3－羥基丁酮、葡萄糖含量低、還原糖含量高的菌株再進(jìn)行復(fù)篩，即可得到D－核糖產(chǎn)率及轉(zhuǎn)化率高的菌株。本發(fā)明的方法操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、成本低，特別適合生產(chǎn)菌種的分離篩選，在D－核糖的工業(yè)化生產(chǎn)中具有重要意義。
文檔編號(hào)C12N1/00GK1831104SQ200610043210
公開(kāi)日2006年9月13日 申請(qǐng)日期2006年3月14日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月14日
發(fā)明者劉建軍, 趙祥穎, 張家祥, 田延軍, 李丕武, 韓延雷 申請(qǐng)人:山東省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計(jì)院