專利名稱：一種利用糖化酶篩選高產(chǎn)檸檬酸菌株的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，具體地，涉及一種利用糖化酶篩選高產(chǎn)檸檬酸菌株的方法。
背景技術(shù)：
在我國的朽1檬酸行業(yè)中，利用淀粉質(zhì)原料，以黑曲霉(Aspergillusniger)為菌種深層發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸的水平已達(dá)到世界先進(jìn)水平。其生產(chǎn)工藝為先將淀粉質(zhì)原料粉碎、力口α -淀粉酶將淀粉液化分解為短鏈的糊精，取其液化液加適量有機(jī)氮源進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵醪液經(jīng)過提取后獲得檸檬酸。黑曲霉可以自身分泌糖化酶，并且該糖化酶可以耐受酸性環(huán)境。黑曲霉利用糖化酶對短鏈的糊精進(jìn)行分解獲得葡萄糖，葡萄糖進(jìn)入EMP途徑，經(jīng)三羧酸循環(huán)獲得檸檬酸。檸檬酸菌種進(jìn)行生產(chǎn)篩選時的主要指標(biāo)是搖瓶產(chǎn)酸。其篩選流程為平板分離后，單菌落接入試管，將成熟的孢子接入搖瓶培養(yǎng)基中，在96小時檢測搖瓶產(chǎn)酸，選取搖瓶高產(chǎn)酸的編號試管進(jìn)行傳代用于發(fā)酵生產(chǎn)。在檸檬酸發(fā)酵生產(chǎn)中經(jīng)常發(fā) 現(xiàn)，當(dāng)應(yīng)用不同批次菌種時，會出現(xiàn)產(chǎn)酸及殘?zhí)堑膮^(qū)另O。排除發(fā)酵過程中通氣、攪拌罐壓等控制因素的影響，研究發(fā)現(xiàn)，不同批次菌種篩選結(jié)果中，每一只試管斜面接種培養(yǎng)基后，其糖化酶的活力不同。當(dāng)?shù)矸圪|(zhì)原料經(jīng)α-淀粉酶液化后，糖化酶活力強(qiáng)的試管菌株產(chǎn)生的發(fā)酵菌球可以快速的分泌糖化酶，從而將短鏈糊精較快的分解為葡萄糖供給菌體進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酸。而分泌糖化酶慢或糖化酶活力較弱的菌株，將短鏈糊精分解為葡萄糖的速度較慢，這會導(dǎo)致檸檬酸發(fā)酵產(chǎn)酸速度較慢。當(dāng)檸檬酸一旦積累，發(fā)酵醪液的PH值迅速下降。如果糖化酶的耐酸性較弱，分解短鏈糊精的速度將大為下降，到發(fā)酵終點時，發(fā)酵醪液中殘?zhí)禽^高不能被利用。因此，在發(fā)酵開始后，檸檬酸產(chǎn)生菌黑曲霉的糖化酶的活力是影響檸檬酸產(chǎn)酸速率與發(fā)酵殘?zhí)堑闹匾蛩亍?br>
發(fā)明內(nèi)容
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明目的是提供一種利用糖化酶篩選高產(chǎn)檸檬酸菌株的方法。為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明的主要技術(shù)路線如下:通過測定檸檬酸發(fā)酵過程中糖化酶和朽1檬酸含量，篩選朽1檬酸高產(chǎn)菌株。具體地，通過測定24小時、36小時的發(fā)酵醪液中的糖化酶含量和測定96小時的發(fā)酵醪液中的檸檬酸含量來篩選糖化酶與檸檬酸產(chǎn)生量高的檸檬酸高產(chǎn)菌株。上述技術(shù)方案具體包括以下步驟:(I)將黑曲霉孢子接入檸檬酸發(fā)酵搖瓶中，發(fā)酵培養(yǎng)；(2)將24小時、36小時發(fā)酵醪液中菌絲體過濾，測定濾清液中糖化酶含量；(3)將96小時發(fā)酵醪液中菌絲體過濾，測定濾清液中檸檬酸含量；(4)篩選糖化酶與檸檬酸產(chǎn)生量高的檸檬酸高產(chǎn)菌株。
其中，篩選糖化酶含量高的檸檬酸高產(chǎn)菌株的標(biāo)準(zhǔn)為糖化酶含量:24小時酶活力大于2500u/100ml、36小時酶活力大于1800u/100ml。篩選朽1檬酸含量高的朽1檬酸高產(chǎn)菌株的標(biāo)準(zhǔn)為:96小時朽1檬酸的含量大于15g/100ml。優(yōu)選地，24小時酶活力 2500-2800u/100ml、36 小時酶活力 1800-2000u/100ml。篩
選朽1檬酸含量高的朽1檬酸高產(chǎn)菌株的標(biāo)準(zhǔn)為:96小時朽1檬酸的含量15-16g/100ml。其中，步驟(1)中黑曲霉孢子的發(fā)酵培養(yǎng)為常規(guī)方法培養(yǎng)。黑曲霉菌株包括各種不同來源的黑曲霉菌株。發(fā)酵培養(yǎng)基的配方例子為:所述的培養(yǎng)基為玉米粉按22%的質(zhì)量百分比用自來水配制；在IL發(fā)酵培養(yǎng)基中加α -淀粉酶0.Γ0.5mL,由水浴鍋控制液化溫度，分段液化(65°C保溫45min，然后升溫至90°C后保溫，直至終點)，以碘液不變色為液化終點。過濾后得液化清液。其中，所述玉米液化液中含糖量15 16%。發(fā)酵培養(yǎng)基中加入總重量1(Γ14%的玉米蛋白粉為有機(jī)氮源。培養(yǎng)條件的例子為:發(fā)酵條件為溫度36-39°C，搖瓶轉(zhuǎn)速為350-400r/min，培養(yǎng)時間 96h。本發(fā)明的積極效果在于:本發(fā)明中所述方法進(jìn)行檸檬酸菌株的篩選，發(fā)酵菌株性能穩(wěn)定，發(fā)酵前期產(chǎn)糖較快，檸檬酸積累速度較快，尤其突出表現(xiàn)為發(fā)酵終點發(fā)酵殘?zhí)堑停瑲埧偺窃?.0%以下。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。黑曲霉菌株(ATCC16404)購自廣東省微生物研究所。實施例1菌種分離用接種環(huán)取一環(huán)成熟孢子于裝有無菌水及玻璃珠的三角瓶中，置于搖瓶機(jī)上震蕩5分鐘，使孢子懸浮于水中。取已滅菌的裝有9mL無菌水試管數(shù)支，做好標(biāo)號，另用無菌吸管吸取菌懸液lmL，注入I號試管，充分搖勻，使孢子均勻地懸浮在無菌水中。吸取此懸浮液ImL注入2號試管中，依次類推，直至最后一支試管。每稀釋一管，必須更換一支無菌吸管。從最后2 3支試管中分別用無菌吸管吸取0.1mL放入無菌平板中，每個梯度做31塊平板。對滴加孢子懸液的平板利用無菌刮棒進(jìn)行涂布。將涂布后平板包好置培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)40小時，選取菌絲白色、表面突起、邊緣整齊、菌落較小、皺褶較深、孢子穗大而稀疏的黑曲霉菌落進(jìn)入試管斜面。對不同菌落進(jìn)行編號，分別為1#、2#、3#。實施例21#菌種搖瓶篩選情況1.搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的制備將玉米粉按22%的粉漿比調(diào)漿，加入0.Γ0.5mL/L α -淀粉酶，由水浴鍋控制液化溫度，分段液化(65°C保溫45min，然后升溫至90°C后保溫，直至終點)，以碘液不變色為液化終點(液化液含糖量為15-16%)，過濾后得液化清液，加入總重量1(Γ14%的玉米蛋白粉的有機(jī)氮源。2.接種培養(yǎng)條件:
搖瓶培養(yǎng)基121°C滅菌30min，冷卻后備用。在凈化臺上按無菌操作每只搖瓶接入一環(huán)黑曲霉孢子。接種后搖瓶置搖床上，轉(zhuǎn)速為400rpm/min, 39°C培養(yǎng)96hr,離心后測酸。3、檢測結(jié)果發(fā)酵周期在24、36小時時，將發(fā)酵瓶從搖瓶機(jī)上取下，將發(fā)酵醪液用濾紙過濾，取濾液進(jìn)行糖化酶酶活的測定。發(fā)酵96小時后，將發(fā)酵瓶從搖瓶機(jī)上取下，將發(fā)酵醪液用濾紙過濾，取濾液Iml用
0.1429mol/L的氫氧化鈉溶液滴定終點(以酚酞為指示劑)。1#試管斜面菌種搖瓶篩選見表1，以3次結(jié)果的平均值計量。表11#試管斜面菌種搖瓶篩選結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種利用糖化酶篩選高產(chǎn)檸檬酸菌株的方法:其特征在于，通過測定檸檬酸發(fā)酵過程中糖化酶和朽1檬酸含量，篩選朽1檬酸高產(chǎn)菌株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，測定24小時、36小時的發(fā)酵醪液中的糖化酶含量。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，測定96小時的發(fā)酵醪液中的檸檬酸含量。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的方法，具體包括以下步驟: (1)將黑曲霉孢子接入檸檬酸發(fā)酵搖瓶中，發(fā)酵培養(yǎng)； (2)將24小時、36小時發(fā)酵醪液中菌絲體過濾，測定濾清液中糖化酶含量； (3)將96小時發(fā)酵醪液中菌絲體過濾，測定濾清液中檸檬酸含量； (4)篩選糖化酶與朽1檬酸含量高的朽1檬酸高產(chǎn)菌株。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，篩選糖化酶含量高的檸檬酸高產(chǎn)菌株的標(biāo)準(zhǔn)為糖化酶含量:24小時酶活力大于2500u/100ml、36小時酶活力大于1800u/100ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法,其特征在于,篩選朽1檬酸含量高的朽1檬酸高產(chǎn)菌株的標(biāo)準(zhǔn)為:96小時朽1檬酸的含量大于15g/100ml。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟(1)中的發(fā)酵培養(yǎng)基含有玉米液化液。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟(1)中的發(fā)酵培養(yǎng)條件為發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度36-39°C，搖瓶轉(zhuǎn)速為350-400r/min，培養(yǎng)時間96h。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用糖化酶在篩選高產(chǎn)檸檬酸菌種中的方法。包括通過測定檸檬酸發(fā)酵過程中糖化酶和檸檬酸含量，篩選糖化酶含量高的檸檬酸高產(chǎn)菌株。本發(fā)明方法篩選的發(fā)酵菌株性能穩(wěn)定，發(fā)酵前期產(chǎn)糖較快，檸檬酸積累速度較快，尤其突出表現(xiàn)為發(fā)酵終點發(fā)酵殘?zhí)堑?，殘總糖?.0%以下。
文檔編號C12R1/685GK103074235SQ20121058365
公開日2013年5月1日 申請日期2012年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月28日
發(fā)明者李榮杰, 尚海濤, 楊為華, 鄧遠(yuǎn)德, 穆曉玲, 李維理 申請人:安徽豐原發(fā)酵技術(shù)工程研究有限公司