專利名稱：一種篩選菌種的方法及其引物和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于菌種篩選純化領(lǐng)域，特別涉及一種篩選菌種的方法及其引物和試劑
品.O
背景技術(shù)：
良好的菌種是微生物發(fā)酵工業(yè)的基礎(chǔ)。能夠用于食品的菌種和不同食品的可用菌 種，如乳酸菌、雙歧桿菌等，在各個(gè)國家都是有相關(guān)規(guī)定的。現(xiàn)在大部分用的菌種都是國外 公司壟斷的，且他們篩選的益生菌適合外國人群，但不一定適合中國人群。中國擁有自己專 利的菌種數(shù)量少，種類、功能單一。得到功能良好、合適的菌株是食品益生菌領(lǐng)域要解決的 主要技術(shù)問題之一。常用的篩選菌種的方法是從自然界的生態(tài)環(huán)境中分離出新菌株。由于 微生物到處都有，無孔不入，所以它們在自然界大多是以混雜的形式群居于一起的。自然界 工業(yè)菌種分離篩選的主要步驟是樣品采集，增殖培養(yǎng)、培養(yǎng)分離和篩選鑒定。通過樣品采 集和增殖培養(yǎng)后，樣品中的微生物還處于混在生長狀態(tài)，還需要進(jìn)行純種分離。常用的培養(yǎng) 分離方法包括稀釋分離法和劃線分離法。待長出獨(dú)立的單個(gè)菌落，進(jìn)行挑選分離，然后對該 菌落進(jìn)行菌種鑒定。鑒定包括菌落形態(tài)、菌落性狀以及菌落的生理生化指標(biāo)鑒定。這些篩 選菌種的方法，周期長，工作量大，試劑設(shè)備投資多，效率差。并且，因?yàn)楹Y選具有隨機(jī)性，一 旦所篩選的樣品中無目標(biāo)菌，則浪費(fèi)大量人力物力。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題就是針對現(xiàn)有的篩選菌種的方法存在盲目性、速 度慢、效率低、工作量大、周期長的缺陷，提供一種新的篩選菌種的方法，該方法快速、高效。 本發(fā)明還提供一種篩選菌種的引物及其試劑盒。本發(fā)明人經(jīng)過廣泛的研究和大量的試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)隨著基因技術(shù)和網(wǎng)絡(luò)信息技術(shù)的發(fā) 展，一般細(xì)菌的基因序列在網(wǎng)上都可以免費(fèi)方便地查到，設(shè)計(jì)種、屬甚至菌株特異性PCR引 物變得很容易，并且也已經(jīng)有許多被公開了。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，利用PCR技術(shù)具有快速、靈敏、 特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，先用PCR技術(shù)篩選含有目標(biāo)菌的混合菌樣品，可以避免下一步篩選的盲 目性，大大提高篩選效率；再用PCR技術(shù)篩選目標(biāo)菌的分離純種菌落，可以大大減少篩選時(shí) 間，高效的篩選到目標(biāo)菌純種菌落，從而完成了本發(fā)明。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案之一是一種篩選菌種的方法，包括 以下步驟1)提取待篩樣品中的基因組DNA，利用目標(biāo)菌特異性的PCR引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，選 擇有特異性擴(kuò)增的樣品作為含有目標(biāo)菌的進(jìn)一步篩選樣品；2)將步驟1)所述的含有目標(biāo)菌的進(jìn)一步篩選樣品培養(yǎng)分離，挑選單克隆，提取單 克隆的基因組DNA，用目標(biāo)菌特異性的PCR引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，選擇有特異性擴(kuò)增的單克隆 即為目標(biāo)嫌疑菌；3)目標(biāo)嫌疑菌進(jìn)行菌種鑒定，確定目標(biāo)菌。
根據(jù)本發(fā)明，步驟1)為提取待篩樣品中的基因組DNA，利用目標(biāo)菌特異性的PCR引 物進(jìn)行PCR反應(yīng)，選擇有特異性擴(kuò)增的樣品作為含有目標(biāo)菌的進(jìn)一步篩選樣品。其中，所述 的待篩樣品較佳的是動物或人的糞便。所述的目標(biāo)菌可以是任何待篩選的菌類，如可以篩 選雙歧桿菌(Bifidobacterium)，釀酒用的酵母菌，或者從自然發(fā)酵酸奶中分離酸奶發(fā)酵菌 種(如嗜熱鏈球菌、德氏乳桿菌保加利亞乳桿菌)等，本發(fā)明優(yōu)選雙歧桿菌為例來說明。所 述的目標(biāo)菌特異性的PCR引物較佳的選自特異性擴(kuò)增目標(biāo)菌核糖體(rRNA)基因、或種屬特 異性蛋白或酶基因的引物，更佳的是堿基序列如序列表中SEQN0 1或SEQ NO 2所示的引 物。PCR反應(yīng)的條件和程序和本領(lǐng)域常規(guī)相同。通過PCR擴(kuò)增可以大量初篩樣品，甚至可以 通過PCR條帶的強(qiáng)弱初步判斷目標(biāo)菌含量的多少，節(jié)約時(shí)間、人力和物力。根據(jù)本發(fā)明，步驟2)為將步驟1)所述的含有目標(biāo)菌的進(jìn)一步篩選樣品培養(yǎng)分離， 挑選單克隆，提取單克隆的基因組DNA，用目標(biāo)菌特異性的PCR引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，選擇有特 異性擴(kuò)增的單克隆即為目標(biāo)嫌疑菌。其中，所述的培養(yǎng)分離的方法可以是本領(lǐng)域的常規(guī)方 法，較佳的為選擇富集培養(yǎng)法、稀釋計(jì)數(shù)法、劃線分離法或這些方法的組合。所述的目標(biāo)菌 特異性的PCR引物，較佳的和步驟1)中相同，選自特異性擴(kuò)增目標(biāo)菌核糖體小亞基基因、或 種屬特異性蛋白或酶基因的引物，更佳的是堿基序列如序列表中SEQ NO 1或SEQ NO 2所 示的引物。該引物通過PCR可以快速初步篩選到屬水平的雙歧桿菌，對該雙歧桿菌的種水 平的鑒定還需要其他的方法進(jìn)一步的鑒定，如生理生化反應(yīng)鑒定法、基因測序法，通過PCR 擴(kuò)增，可以快速高效地檢測判斷可疑菌落，大大提高目標(biāo)菌篩選速度和效率。根據(jù)本發(fā)明，步驟3)為目標(biāo)嫌疑菌進(jìn)行菌種鑒定，確定目標(biāo)菌。其中，所述的菌種 鑒定的方法可以是本領(lǐng)域的常規(guī)方法，如生理生化反應(yīng)鑒定法等，較佳的為基因測序鑒定 法。根據(jù)各種篩選目的，可以將目標(biāo)嫌疑菌一直鑒定到種或菌株水平。經(jīng)過鑒定的菌株可 按本領(lǐng)域常規(guī)方法保存。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案之二是一種引物，其堿基序列是序 列表中SEQ NO :1或SEQ N0 2所示。本發(fā)明還提供一種試劑盒，其中，包括如上所述的引物。根據(jù)本發(fā)明，較佳的，所述 的試劑盒中還包括耐熱DNA聚合酶和/或PCR反應(yīng)緩沖溶液。本發(fā)明所用的原料或試劑除特別說明之外，均市售可得。相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果如下本發(fā)明將分子生物學(xué)的PCR技術(shù)與傳 統(tǒng)微生物培養(yǎng)分離技術(shù)完美地結(jié)合起來，快速、高效的篩選目標(biāo)菌。本發(fā)明方法針對性強(qiáng)、 速度快、效率高、工作量小、周期短?？梢院Y選雙歧桿菌，釀酒用的酵母菌，或者從自然發(fā)酵 酸奶中分離酸奶發(fā)酵菌種(如嗜熱鏈球菌、德氏乳桿菌保加利亞乳桿菌)。篩選得到的菌株 經(jīng)過耐藥性、毒理性、安全性、功能性研究后，可以選擇應(yīng)用到實(shí)際生產(chǎn)中。比如同為篩選 得到的嗜熱鏈球菌，有的菌株產(chǎn)酸強(qiáng)，其生產(chǎn)的酸奶后酸強(qiáng)；有的產(chǎn)酸弱，其生產(chǎn)的酸奶后 酸弱；相同配方工藝條件下，有的嗜熱鏈球菌發(fā)酵的酸奶口味好，有的口味差；上述都可以 選擇應(yīng)用到不同的生產(chǎn)中。


以下結(jié)合

本發(fā)明的特征和有益效果。圖1是PCR產(chǎn)物的瓊脂糖電泳圖。其中，0為陰性對照，M為DNA分子量標(biāo)記DNAMarker DL2000。1 12為待篩樣品。
具體實(shí)施例方式下面用實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明。實(shí)施例中以雙歧桿菌為例來進(jìn)行說明，但是 本發(fā)明并不受其限制。本發(fā)明的篩選菌種的方法也可以用于篩選其他菌類或微生物。只要 在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍之內(nèi)，都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件 的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1PCR引物設(shè)計(jì)在GenBank數(shù)據(jù)庫中查找不同種雙歧桿菌(包括長雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、短雙 歧桿菌、青春雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌)16S rRNA基因序列，利用基因序列分析軟件進(jìn)行同 源性分析，找出雙歧桿菌的共有序列。再與其它桿菌(如大腸桿菌、保加利亞乳桿菌)的 相應(yīng)序列進(jìn)行對比，找出雙歧桿菌共有的且區(qū)別于其它菌的特異序列作為PCR引物設(shè)計(jì)的 參考序列。應(yīng)用PCR引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)雙歧桿菌的特異引物，設(shè)計(jì)的引物滿足PCR擴(kuò)增要 求，最主要的是只能特異性地?cái)U(kuò)增雙歧桿菌但不能擴(kuò)增出其它菌。本實(shí)施例1最終設(shè)計(jì)的 PCR引物為上游引物5，-GGAATA GCT CCT GGAAAC G-3，(即序列表中 SEQ IDN0 1 所示)；下游引物5，-GCG ATG GAC TTT CAC ACC-3，(即序列表中 SEQ IDN0 2 所示)。所設(shè)計(jì)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的堿基長度為500bp左右。實(shí)施例2通過PCR擴(kuò)增初步判斷待篩選樣品中是否含有雙歧桿菌提取不同動物牛、豬、兔、老鼠以及人的糞便中的菌體基因組DNA，用實(shí)施例1中所 得的兩條引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件為95°C預(yù)熱5min，30個(gè)循環(huán)(95°C，30S ；55°C, 30S ;72°C，30S)，72°C延伸5min。采用TaKaRa公司的PCR試劑盒進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng) 體系為SEQ NO :l(5umol/L)3u 1, SEQ NO 2 (5 u mol/L) 3 u 1,2. 5mmol/L dNTP 2. 4u 1, 10 X PCRBuffer 3u 1,模板 DNA 1 u 1, Taq DNA 聚合酶 1 ii，加去離子水至 30 ii 1。PCR 產(chǎn)物 進(jìn)行瓊脂糖電泳，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PCR產(chǎn)物的堿基長度為500bp左右；其中人的糞便PCR擴(kuò)增條 帶最亮，其余的沒有或條帶較弱。因此選擇人的糞便作為待篩選樣品。實(shí)施例3培養(yǎng)分離，做PCR擴(kuò)增，初步篩選雙歧桿菌嫌疑菌用涂布法在TPY瓊脂培養(yǎng)基(TPY瓊脂培養(yǎng)基為(g/L)水解酪蛋白10.0，植物胨 5. 0，酵母浸出粉2. 0，葡萄糖5. 0，瓊脂13. 0，半胱氨酸0. 5，磷酸氫二鉀2. 0，氯化鎂0. 23， 硫化鋅0. 14，氯化鈣0. 15，氯化鐵0. 03，吐溫-801ml，pH6. 5)，進(jìn)行稀釋平板計(jì)數(shù)，長出的菌 落分類編號，用無菌牙簽挑取單個(gè)菌落中的少量菌體，剩下部分備用。用簡單基因裂解液(0. 02mol/L NaOH)，快速裂解菌體釋放基因組DNA，用實(shí)施例1 中所得的兩條引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物的瓊脂糖電泳圖見圖1。圖1中1、2、3、... 12 分別代表挑取的單個(gè)菌落1、2、3、...12。有擴(kuò)增條帶的菌落為雙歧桿菌嫌疑菌。有擴(kuò)增條 帶的菌落進(jìn)行劃線分離純化，保存菌種。實(shí)施例4菌種鑒定根據(jù)細(xì)菌16S rRNA和23S rRNA兩側(cè)高度保守的區(qū)域設(shè)計(jì)通用引物上 游引物5’ -TTGTACACACCGCCCGTC-3’(即序列表中SEQ ID NO :3所示)；下游引物 5，-CCTTTCCCTCACGGTACTG-3，(即序列表中SEQ IDN0 4所示)。提取實(shí)施例3所得菌落5基因組DNA，利用上述引物做PCR，擴(kuò)增出16S-23S rDNA間區(qū)序列。PCR產(chǎn)物純化后送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。將所測序的序列在NCBI網(wǎng)站上的GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列做Blast，通過序列 同源性比對分析，發(fā)現(xiàn)測序序列僅僅和長雙歧桿菌(Bifidobacteriumlongum)的同源性為 100%，和其他菌的同源性都小于97%，因同源性大于97%即可被認(rèn)為是同一菌種，由此鑒 定為菌落5是長雙歧桿菌。序列表<110>光明乳業(yè)股份有限公司<120> 一種篩選菌種的方法及其引物和試劑盒<130>P4-091192C<160>4<170>PatentIn version 3. 4<210>1<211>19<212>DNA<213>Artificial (人工序列)<220><223> 引物<400>1ggaatagctc ctggaaacg 19<210>2<211>18<212>DNA<213>Artificial (人工序列)<220><223> 引物<400>2gcgatggact ttcacacc 18<210>3<211>18<212>DNA<213>Artificial (人工序列)<220><223> 引物<400>3ttgtacacac cgcccgtc 18<210>4<211>19<212>DNA
<213>Artificial (人工序列)<220><223> 引物<400>4cctttccctc acggtactg 19
權(quán)利要求
一種篩選菌種的方法，其特征在于，包括以下步驟1)提取待篩樣品中的基因組DNA，利用目標(biāo)菌特異性的PCR引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，選擇有特異性擴(kuò)增的樣品作為含有目標(biāo)菌的進(jìn)一步篩選樣品；2)將步驟1)所述的含有目標(biāo)菌的進(jìn)一步篩選樣品培養(yǎng)分離，挑選單克隆，提取單克隆的基因組DNA，用所述的目標(biāo)菌特異性的PCR引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，選擇有特異性擴(kuò)增的單克隆即為目標(biāo)嫌疑菌；3)目標(biāo)嫌疑菌進(jìn)行菌種鑒定，確定目標(biāo)菌。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)所述的待篩樣品是動物或人的糞便。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的目標(biāo)菌是雙歧桿菌。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)或步驟2)所述的目標(biāo)菌特異性的 PCR引物選自特異性擴(kuò)增目標(biāo)菌核糖體基因、或種屬特異性蛋白或酶基因的引物。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的目標(biāo)菌特異性的PCR引物是堿基序列 如序列表中SEQ NO :1或SEQ NO 2所示的引物。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)所述的培養(yǎng)分離的方法是選擇富集 培養(yǎng)法、稀釋計(jì)數(shù)法、劃線分離法或這些方法的組合。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)所述的菌種鑒定的方法是基因測序 鑒定法或者傳統(tǒng)的生化鑒定方法。
8.一種引物，其特征在于，其堿基序列是序列表中SEQ NO 1或SEQN0 2所示。
9.一種試劑盒，其特征在于，包括如權(quán)利要求8所述的引物。
10.如權(quán)利要求9所述的試劑盒，還包括耐熱DNA聚合酶和/或PCR反應(yīng)緩沖溶液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種篩選菌種的方法及其所用的引物和試劑盒。該方法包括以下步驟1)提取待篩樣品中的基因組DNA，利用目標(biāo)菌特異性的PCR引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，選擇有特異性擴(kuò)增的樣品作為含有目標(biāo)菌的進(jìn)一步篩選樣品；2)將步驟1)所述的含有目標(biāo)菌的進(jìn)一步篩選樣品培養(yǎng)分離，挑選單克隆，提取單克隆的基因組DNA，用所述的目標(biāo)菌特異性的PCR引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，選擇有特異性擴(kuò)增的單克隆即為目標(biāo)嫌疑菌；3)目標(biāo)嫌疑菌進(jìn)行菌種鑒定，確定目標(biāo)菌。本發(fā)明將分子生物學(xué)的PCR技術(shù)與傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)分離技術(shù)完美地結(jié)合起來，篩選目標(biāo)菌速度快、效率高、工作量小、周期短。
文檔編號C12Q1/68GK101875964SQ20091005012
公開日2010年11月3日 申請日期2009年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月28日
發(fā)明者張紅發(fā), 沈玲, 王蔭榆, 舒妹 申請人:光明乳業(yè)股份有限公司