專利名稱：：一種轉(zhuǎn)化芽孢桿菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)化芽孢桿菌的方法。
背景技術(shù)：
：芽孢桿菌作為一個屬，于1872年被首次提出，至今已有一百多年。目前人們對芽孢桿菌的研究幾乎涉及到了革蘭氏陽性可生孢細菌的各個領(lǐng)域。尤其是在感受態(tài)、芽孢形成及其調(diào)控、遺傳操作、菌種改良、生物技術(shù)等領(lǐng)域進行了大量的工作?？茖W(xué)研究中應(yīng)用最多的當(dāng)屬枯草芽孢桿菌?？莶菅挎邨U菌能發(fā)展成為芽孢桿菌中的第一個基因工程表達系統(tǒng)是與艽早期的遺傳學(xué)工作密切相關(guān)的。Spizizen于1958年發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌168菌株為可轉(zhuǎn)化菌株以來，枯草芽孢桿菌的遺傳學(xué)工作不斷深入和發(fā)展。美國俄亥俄州立大學(xué)BacUlus遺傳保藏中心(BGSC，http:〃ww.bgsc.org)至1999年保藏的168菌株的遺傳突變株就有890個。它牽涉到了諸多營養(yǎng)要求、各種酶、芽孢形成和發(fā)芽、感受態(tài)、Sigma因子、腿A重組與修復(fù)以及正負調(diào)控等各方面基因的突變體。70年代發(fā)明了DNA重組技術(shù)以后，特別是發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌的帶有抗性標(biāo)志的質(zhì)粒可作為枯草芽孢桿菌的載體以后，克服了枯草芽孢桿菌只有隱秘性質(zhì)粒的困難，枯草芽孢桿菌基因工程的工作更是加速發(fā)展。迄今，已經(jīng)在枯草芽孢桿菌及其近緣種中克隆和表達了大量的原核和真核基因，其中有的已應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)，取得了不少成績。將攜有外源基因載體導(dǎo)入宿主細菌中是細菌基因工程表達系統(tǒng)的必要條件。大腸桿菌的氯化鈣轉(zhuǎn)化法對枯草芽孢桿菌無效，所以枯草芽孢桿菌基因工程表達系統(tǒng)中的宿主菌株用的最廣泛的就是在DNA重組技術(shù)發(fā)明之前就可以進行感受態(tài)轉(zhuǎn)化(Spizizen1958)的168菌株及其突變體。Spizizen感受態(tài)轉(zhuǎn)化的基本原理是細胞在Spizizen最低鹽培養(yǎng)基中形成一段饑餓、易于攝取外源DNA片段的時期。一般步驟是先將其在較為豐富的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)接到貧瘠的培養(yǎng)基中，使其形成感受態(tài)(一般非常短暫)。以枯草芽孢桿菌感受態(tài)細胞為宿主進行轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化效率很低。細胞電穿孔具有普遍性，可用于動物、植物和微生物等各類細胞，且效率高、無殘余毒性、參數(shù)容易控制。但一般電轉(zhuǎn)化是將質(zhì)粒直接導(dǎo)入宿主細胞。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種轉(zhuǎn)化芽孢桿菌方法。本發(fā)明所提供的芽孢桿菌轉(zhuǎn)化方法是以芽孢桿菌原生質(zhì)體為轉(zhuǎn)化受體，用電穿孔3法將DNA分子導(dǎo)入芽孢桿菌原生質(zhì)體中。其中，芽孢桿菌原生質(zhì)體可以用現(xiàn)有的多種方法獲得。所述芽孢桿菌原生質(zhì)體具體可按照如下方法制備的芽孢桿菌在PAB培養(yǎng)液培養(yǎng)，收集所述芽孢桿菌，用菌體保護液重懸，然后加入溶菌酶獲得芽孢桿菌原生質(zhì)體；所述PAB培養(yǎng)液為25。/。(體積百分含量)4XPAB培養(yǎng)液，所述4XPAB培養(yǎng)液由如下物質(zhì)組成5-7g/L牛肉膏、5-7g/L酵母膏、18-22g/L蛋白胨、4.3-6.5g/LKH2P04、13-15g/LNaCl、17.5-20.3g/LK2HP04*3H20、3-5g葡萄糖；所述菌體保護液由如下物質(zhì)組成19-22g/LBSA、1.8-2.2M蔗糖、25%(體積百分含量)4XPAB培養(yǎng)液，50%(體積百分含量)2XS麗培養(yǎng)液，所述2XS麗培養(yǎng)液含有3.8-5.0g/L馬來酸、7.5-9.0g/LMgCl26H20，1.8-2.2M蔗糖，p服.2-6.8。所述芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌。所述電穿孔法為在25uF電容，400Q電阻，0.3-0.5kV電擊電轉(zhuǎn)液中的枯草芽孢桿菌原生質(zhì)體。或者，所述電穿孔法為在25"F電容，400Q電阻，0.6-0.8kV電擊電轉(zhuǎn)液中的地衣芽孢桿菌原生質(zhì)體。所述電轉(zhuǎn)液由如下物質(zhì)組成19-22g/LBSA、1.8-2.2M蔗糖、47%-55%(體積百分含量)2XS麗培養(yǎng)液、20-28%(體積百分含量)4XPAB培養(yǎng)液。本發(fā)明的芽孢桿菌轉(zhuǎn)化方法以枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌原生質(zhì)體為受體，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌中，轉(zhuǎn)化效率達到60%，對枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌基因工程表達系統(tǒng)具有重要的意義。另外，地衣芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化在一般情況下是很難進行的，本發(fā)明的芽孢桿菌轉(zhuǎn)化方法對于地衣芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化也是很有效的。具體實施例方式實施例l、枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)化一、枯草芽孢桿菌原生質(zhì)體的制備枯草芽孢桿菌(i^w7^^w力"7/WCICC10157(購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心)接種于PAB培養(yǎng)液中，37t:搖床培養(yǎng)過夜。次日按照2.5ral/100ml轉(zhuǎn)接入新鮮的PAB培養(yǎng)液中培養(yǎng)4小時，至對數(shù)生長前期。5000rpm離心10分鐘收集菌體，用菌體保護液重懸，然后加入溶菌酶(sigma公司的，Lysozyrae，code0663)使其終濃度為10mg/mL，37°C，搖床培養(yǎng)60分鐘，即形成原生質(zhì)體。PAB培養(yǎng)液100ml4XPAB培養(yǎng)液加入300ml滅菌水。4XPAB培養(yǎng)液由如下物質(zhì)組成:6g牛肉膏、6g酵母膏、20g蛋白胨、5.5gK,、14gNaCl、19.5gK2HP043H20和4g葡萄糖。所述菌體保護液由如下物質(zhì)組成20g/LBSA、2M蔗糖、25%(體積百分含量)4XPAB培養(yǎng)液，50%(體積百分含量)2XS應(yīng)培養(yǎng)液。2XS麗培養(yǎng)液4.6g/L馬來酸、8.lg/LMgCl26H20，2M蔗糖，p朋.5。二、枯草芽孢桿菌以原生質(zhì)體為受體轉(zhuǎn)化當(dāng)95%的細胞變成原生質(zhì)體時，4°C，6000rpm離心5分鐘后，用預(yù)冷的電轉(zhuǎn)液(20g/LBSA、1M蔗糖、50%(體積百分含量)2XS麗培養(yǎng)液、25%(體積百分含量)4XPAB培養(yǎng)液)洗兩次，之后用500ul電轉(zhuǎn)液重懸原生質(zhì)體，使原生質(zhì)體濃度為108cfu/mL;將原生質(zhì)體以每管120uL分裝，加入0.3ugpBCJ164.3(購自美國俄亥俄州立大學(xué)菌種保存中心，」fed7^/sGeneticStockCenter(BGSC)TheOhioStateUniversity)后冰置上5分鐘；然后轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的電擊杯中，設(shè)置25uF電容，400Q電阻，以不同電壓(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7或0.8kv)電擊一次；電擊后立即加入lmL電轉(zhuǎn)液，轉(zhuǎn)移至EP管中，37°C，lOOrpm搖床培養(yǎng)12小時；然后涂于含氯霉素4.0ug/mlDM3培養(yǎng)基上篩選。實驗重復(fù)3次。結(jié)果如表1所示。DM3培養(yǎng)基由如下物質(zhì)組成8g/L瓊脂、5g/L水解酪蛋白、5g/L酵母粉、1.5g/LKH2P04、3.5g/LK2HP04、45.5g/L山梨醇、10g/L淀粉、5g/L葡萄糖;0.09g/LBSA和0.02MMgCl2。表l.DM3培養(yǎng)基上篩選的陽性克隆<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>實施例2、枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)化一、枯草芽孢桿菌原生質(zhì)體的制備枯草芽孢桿菌(萬acj'Lws卯6^7^J)210CICC11210(購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心)接種于PAB培養(yǎng)液中，37。C搖床培養(yǎng)過夜。次日按照2.5ml/100ml轉(zhuǎn)接入新鮮的PAB培養(yǎng)液中培養(yǎng)4小時，至對數(shù)生長前期。5000rpm離心10分鐘收集菌體，用菌體保護液重懸，然后加入溶菌酶(sigma公司的，Lysozyme，code0663)使其終濃度為10mg/mL，37°C，搖床培養(yǎng)60分鐘，即形成原生質(zhì)體。PAB培養(yǎng)液100ml4XPAB培養(yǎng)液加入300ml滅菌水。4XPAB培養(yǎng)液由如下物質(zhì)組成5g牛肉膏、5g酵母膏、18g蛋白胨、4.3gKH2PO"13gNaCl、17.5gK2HP043H20和3g葡萄糖。菌體保護液19g/LBSA、1.8M蔗糖、25%(體積百分含量)4XPAB培養(yǎng)液，50%(體積百分含量)2XSMM培養(yǎng)液。2XS應(yīng)培養(yǎng)液:3.8g/L馬來酸、7.5g/LMgCl26H20，1.8M蔗糖，p朋.2。二、枯草芽孢桿菌以原生質(zhì)體為受體轉(zhuǎn)化當(dāng)95%的細胞變成原生質(zhì)體時，4°C，6000rpm離心5分鐘后，用預(yù)冷的電轉(zhuǎn)液[19g/LBSA、1.8M蔗糖、47%(體積百分含量)2XSMM培養(yǎng)液、20%(體積百分含量)4XPAB培養(yǎng)液]洗兩次，之后用500ul電轉(zhuǎn)液重懸原生質(zhì)體，使原生質(zhì)體濃度為108cfu/mL;將原生質(zhì)體以每管120yL分裝，加入0.5ugpBCJ164.3。后冰置上5分鐘；然后轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的電擊杯中，設(shè)置25uF電容，400Q電阻，以O(shè).3kv電擊一次；電擊后立即加入lmL電轉(zhuǎn)液，轉(zhuǎn)移至EP管中，37°C，100rpm搖床培養(yǎng)12小時；然后涂于氯霉素4.0iig/ralDM3培養(yǎng)基上篩選。實驗重復(fù)3次。DM3培養(yǎng)基上篩選后，平板上的菌落數(shù)為40個。實施例3、枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)化一、枯草芽孢桿菌原生質(zhì)體的制備枯草芽孢桿菌Ssci^〃s幼Z^W^074(BF-7658)，CICC10074(購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心)接種于PAB培養(yǎng)液中，37C搖床培養(yǎng)過夜。次日按照2.5ml/100ml轉(zhuǎn)接如新鮮的PAB培養(yǎng)液中培養(yǎng)4小時，至對數(shù)生長前期。5000卬ra離心IO分鐘收集菌體，用菌體保護液重懸，然后加入溶菌酶(sigma公司的，Lysozyme，code0663)使其終濃度為10mg/mL，37°C，搖床培養(yǎng)60分鐘，即形成原生質(zhì)體。PAB培養(yǎng)液100ml4XPAB培養(yǎng)液加入300ml滅菌水。4XPAB培養(yǎng)液由如下物質(zhì)組成7g/L牛肉膏、7g/L酵母膏、22g/L蛋白胨、6.5g/LK,、15g/LNaCl、20.3g/LK2HP043H20、5g葡萄糖。菌體保護液由如下物質(zhì)組成22g/LBSA、2.2M蔗糖、25%(體積百分含量)4XPAB培養(yǎng)液，50%(體積百分含量)2XS畫培養(yǎng)液。2XSMM培養(yǎng)液:5.Og/L馬來酸、9.0g/LMgCl26H20、2.2M蔗糖，p朋.8。二、枯草芽孢桿菌以原生質(zhì)體為受體轉(zhuǎn)化當(dāng)95%的細胞變成原生質(zhì)體時，4°C，6000rpra離心5分鐘后，用預(yù)冷的電轉(zhuǎn)液(22g/LBSA、2.2M蔗糖、55%(體積百分含量)2XS麗培養(yǎng)液、28%(體積百分含量)4XPAB培養(yǎng)液)洗兩次，之后用500ul電轉(zhuǎn)液重懸原生質(zhì)體，使原生質(zhì)體濃度為10"cfuAiL;將原生質(zhì)體以每管120yL分裝，加入lugpBCJ164.3。后冰置上5分鐘；然后轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的電擊杯中，設(shè)置25uF電容，400Q電阻，以O(shè).5kv電擊一次；電擊后立即加入lmL電轉(zhuǎn)液，轉(zhuǎn)移至EP管中，37°C，100rpm搖床培養(yǎng)12小時；然后涂于氯霉素4.0ug/mlDM3培養(yǎng)基上篩選。實驗重復(fù)3次。DM3培養(yǎng)基上篩選后，平板上的菌落數(shù)為30個。實施例4、地衣芽孢桿菌轉(zhuǎn)化一、地衣芽孢桿菌原生質(zhì)體的制備地衣芽孢桿菌69aci7^^乃'c力e/n7br肌'sJCICC10181(中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心)接種于PAB培養(yǎng)液中，37。C搖床培養(yǎng)過夜。次日按照2.5ml/100ral轉(zhuǎn)接如新鮮的PAB培養(yǎng)液中培養(yǎng)4小時，至對數(shù)生長前期。5000rpm離心10分鐘收集菌體，用菌體保護液重懸，然后加入溶菌酶(sigma公司的，Lysozyme，code0663)使其終濃度為10mg/mL，37°C，搖床培養(yǎng)60分鐘，即形成原生質(zhì)體。PAB培養(yǎng)液100ml4XPAB培養(yǎng)液加入300ml滅菌水。4XPAB培養(yǎng)液由如下物質(zhì)組成6g牛肉膏、6g酵母膏、20g蛋白胨、5.5gKH2P(^、15gNaCl、17.5gK2HP043H20和3g葡萄糖。所述菌體保護液由如下物質(zhì)組成20g/LBSA、2M蔗糖、25%(體積百分含量)4XPAB培養(yǎng)液，50%(體積百分含量)2XS醒培養(yǎng)液。2XS羅培養(yǎng)液4.6g/L馬來酸、8.lg/LMgCl26H20，2M蔗糖，p朋.5。二、地衣芽孢桿菌以原生質(zhì)體為受體轉(zhuǎn)化當(dāng)95%的細胞變成原生質(zhì)體時，4°C，6000rpm離心5分鐘后，用預(yù)冷的電轉(zhuǎn)液(20g/LBSA、1M蔗糖、50%(體積百分含量)2XS麗培養(yǎng)液、25%(體積百分含量)4XPAB培養(yǎng)液)洗兩次，之后用500ul電轉(zhuǎn)液重懸原生質(zhì)體，使原生質(zhì)體濃度為108cfu/raL;將原生質(zhì)體以每管120uL分裝，加入0.3PgpAXOI(購自美國俄亥俄州立大學(xué)菌種保存中心，fe"72w51GeneticStockCenter(BGSC)TheOhioStateUniversity)后冰置5分鐘；然后轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的電擊杯中，設(shè)置25yF電容，400Q電阻，以0.6kv電擊一次；電擊后立即加入lmL電轉(zhuǎn)液，轉(zhuǎn)移至EP管中，37°C，100rpm搖床培養(yǎng)12小時；然后涂于含10iig/ml紅霉素的DM3培養(yǎng)基上篩選。實驗重復(fù)3次。DM3培養(yǎng)基上篩選后，平板上的菌落數(shù)為20個。實施例5、地衣芽孢桿菌轉(zhuǎn)化一、地衣芽孢桿菌原生質(zhì)體的制備地衣芽孢桿菌6aciW^WcAwi/oiTZ^^CICC10181(中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心)接種于PAB培養(yǎng)液中，37'C搖床培養(yǎng)過夜。次日按照2.5ml/100ml轉(zhuǎn)接如新鮮的PAB培養(yǎng)液中培養(yǎng)4小時，至對數(shù)生長前期。5000rpm離心10分鐘收集菌體，用菌體保護液重懸，然后加入溶菌酶(sigma公司的，Lysozyme，code0663)使其終濃度為10rag/mL，37°C，搖床培養(yǎng)60分鐘，即形成原生質(zhì)體。PAB培養(yǎng)液100ml4XPAB培養(yǎng)液加入300ml滅菌水。4XPAB培養(yǎng)液由如下物質(zhì)組成6g牛肉膏、6g酵母膏、20g蛋白胨、5.5gKH2P04、15gNaCl、17.5gK2HP043H20和3g葡萄糖。所述菌體保護液由如下物質(zhì)組成20g/LBSA、2M蔗糖、25%(體積百分含量)4XPAB培養(yǎng)液，50%(體積百分含量)2XS麗培養(yǎng)液。2XS腿培養(yǎng)液:4.6g/L馬來酸、8.lg/LMgCl26H20，2M蔗糖，p朋.5。二、地衣芽孢桿菌以原生質(zhì)體為受體轉(zhuǎn)化當(dāng)95%的細胞變成原生質(zhì)體時，4°C，6000rpm離心5分鐘后，用預(yù)冷的電轉(zhuǎn)液(20g/LBSA、1M蔗糖、50%(體積百分含量)2XS畫培養(yǎng)液、25%(體積百分含量)4XPAB培養(yǎng)液)洗兩次，之后用500ul電轉(zhuǎn)液重懸原生質(zhì)體，使原生質(zhì)體濃度為108cfu/mL;將原生質(zhì)體以每管120yL分裝，加入0.3ygpAX0I后冰置上5分鐘；然后轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的電擊杯中，設(shè)置25uF電容，400Q電阻，以O(shè).8kv電擊一次；電擊后立即加入lmL電轉(zhuǎn)液，轉(zhuǎn)移至EP管中，37°C，100rpm搖床培養(yǎng)12小時；然后涂于含10ug/ml紅霉素的DM3培養(yǎng)基上篩選。實驗重復(fù)3次。畫3培養(yǎng)基上篩選后，平板上的菌落數(shù)為30個。權(quán)利要求1、一種轉(zhuǎn)化芽孢桿菌的方法，是以芽孢桿菌原生質(zhì)體為轉(zhuǎn)化受體，用電穿孔法將DNA分子導(dǎo)入芽孢桿菌原生質(zhì)體中。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述芽孢桿菌原生質(zhì)體是按照如下方法制備的芽孢桿菌在PAB培養(yǎng)液培養(yǎng)，收集所述芽孢桿菌，用菌體保護液重懸，然后加入溶菌酶獲得芽孢桿菌原生質(zhì)體；所述PAB培養(yǎng)液為25。/。(體積百分含量)4XPAB培養(yǎng)液，所述4XPAB培養(yǎng)液含有5-7g/L牛肉膏、5-7g/L酵母膏、18-22g/L蛋白胨、4.3-6.5g/LKH2P04、13-15g/LNaCl、17.5-20.3g/LK2HP043H20、3-5g葡萄糖；所述菌體保護液含有19-22g/LBSA、1.8-2.2M蔗糖、25%(體積百分含量)4XPAB培養(yǎng)液，50%(體積百分含量)2XSMM培養(yǎng)液，所述2XS醒培養(yǎng)液含有3.8-5.0g/L馬來酸、7.5-9.0g/LMgCl26H20，1.8-2.2M蔗糖，p朋.2-6.8。3、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌。4、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述芽孢桿菌為地衣芽孢桿菌。5、根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述電穿孔法為在25yF電容，400Q電阻，0.3-0.5kV電擊電轉(zhuǎn)液中的枯草芽孢桿菌原生質(zhì)體。6、根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述電穿孔法為在25yF電容，400Q電阻，0.6-0.8kV電擊電轉(zhuǎn)液中的地衣芽孢桿菌原生質(zhì)體。7、根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于所述電轉(zhuǎn)液含有19-22g/LBSA、1.8-2.2M蔗糖、47%-55%(體積百分含量)2XSMM培養(yǎng)液、20-28%(體積百分含量)4XPAB培養(yǎng)液。全文摘要本發(fā)明公開了一種轉(zhuǎn)化芽孢桿菌的方法。該方法，是以芽孢桿菌原生質(zhì)體為轉(zhuǎn)化受體，用電穿孔法將DNA分子導(dǎo)入芽孢桿菌原生質(zhì)體中。本發(fā)明的芽孢桿菌轉(zhuǎn)化方法以枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌原生質(zhì)體為受體，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌中，轉(zhuǎn)化效率達到60％，對枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌基因工程表達系統(tǒng)具有重要的意義。另外，地衣芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化在一般情況下是很難進行的，本發(fā)明的芽孢桿菌轉(zhuǎn)化方法對于地衣芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化也是很有效的。文檔編號C12N15/87GK101481709SQ20091007764公開日2009年7月15日申請日期2009年2月10日優(yōu)先權(quán)日2009年2月10日發(fā)明者楊建國,兵汪,瑾郭申請人:北京中天諾亞體育科技有限公司