一種類(lèi)芽孢桿菌細(xì)菌素制劑的制備方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種類(lèi)芽孢桿菌細(xì)菌素制劑的制備方法及其 應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 細(xì)菌素是某些細(xì)菌產(chǎn)生的具有抗菌活性的物質(zhì)，主要成分為多肽、蛋白質(zhì)或蛋白 質(zhì)復(fù)合物，最早由Jacob于1953年提出。近年來(lái)，廣譜抗生素的普及甚至濫用所帶來(lái)的負(fù)面 效應(yīng)日益突出，新型抗生素替代品的研宄迫在眉睫。作為蛋白質(zhì)類(lèi)物質(zhì)的細(xì)菌素，由于可被 蛋白酶降解，其安全性很高，故受到越來(lái)越多的關(guān)注。盡管目前開(kāi)發(fā)獲得的細(xì)菌素（Nisin) 已具備了極高的防腐與抑菌的應(yīng)用價(jià)值，但受Nisin本身的特性（低pH條件下性質(zhì)穩(wěn)定， pH>7. 0抑菌活性逐漸喪失）的影響，其應(yīng)用的范圍受到了極大的局限性，其次，制備細(xì)菌素 的成本非常高、細(xì)菌素的來(lái)源相對(duì)有限，上述問(wèn)題很大程度上限制了細(xì)菌素的開(kāi)發(fā)和利用。
[0003] 中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)（CN 103740618A)公開(kāi)了類(lèi)芽孢桿菌屬的一個(gè)新菌種， Paenibacillus damxungensis sp.nov.，并將其中的模式菌株 BD3526 于 2013 年 10 月 14 日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（CGMCC)，該菌株的保藏編號(hào)為： CGMCC No. 8333,該菌株的菌落非常粘稠，表明該菌株具有高產(chǎn)胞外多糖的生理特性，但尚 未得到該菌株產(chǎn)出的抑菌性細(xì)菌素。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 因此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題就是針對(duì)現(xiàn)有細(xì)菌素制劑穩(wěn)定性差，制備成本高， 來(lái)源不足的現(xiàn)狀，提供了一種類(lèi)芽孢桿菌細(xì)菌素制劑的制備方法及其應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)類(lèi)芽孢桿菌（Paenibacillus sp.)CGMCC No. 8333菌株的發(fā)酵液上 清，經(jīng)乙醇沉淀處理后可獲得具有強(qiáng)烈抑菌活性的細(xì)菌素制劑，從而完成了本發(fā)明。
[0006] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案之一為：一種類(lèi)芽孢桿菌細(xì)菌素制 劑的制備方法，所述制備方法包括以下步驟：
[0007] (1)將類(lèi)芽孢桿菌（Paenibacillus sp.)接種于培養(yǎng)類(lèi)芽孢桿菌的培養(yǎng)基中，震 蕩發(fā)酵培養(yǎng)獲得發(fā)酵液，將所得發(fā)酵液離心取上清液；
[0008] (2)將步驟⑴上清液與乙醇混合，乙醇與上清液混合的體積比為2:1~4:1，將 所得混合液靜置，靜置的溫度為2~10°C，靜置的時(shí)間為12~36小時(shí)，將混合液離心收集 沉淀物，除去溶劑即得。
[0009] 其中步驟（1)為將類(lèi)芽孢桿菌（Paenibacillus sp.)接種于培養(yǎng)類(lèi)芽孢桿菌的 培養(yǎng)基中，震蕩發(fā)酵培養(yǎng)獲得發(fā)酵液，將所得發(fā)酵液離心取上清液。其中所述類(lèi)芽孢桿菌 (Paenibacillus sp.)為本領(lǐng)域常規(guī)的類(lèi)芽孢桿菌，較佳地為發(fā)酵產(chǎn)生細(xì)菌素的類(lèi)芽孢桿 菌，更佳地為類(lèi)芽孢桿菌（Paenibacillus sp.)，其保藏編號(hào)為CGMCC No. 8333。所述類(lèi)芽 孢桿菌為現(xiàn)有技術(shù)，其制備方法為本領(lǐng)域常規(guī)制備方法，或者通過(guò)從保藏中心購(gòu)買(mǎi)獲得。其 中所述養(yǎng)類(lèi)芽孢桿菌的培養(yǎng)基為本領(lǐng)域常規(guī)的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基的配方較佳地為：氮源 1 ~3%、碳源 1 ~10%、L-胱氨酸 0? 01 ~0? 03%、硫酸鈉 0? 01 ~0? 03%、Na2HP04.12H20 0? 1~0.3%、乙酸鈉1~3%、氯化鈉0.05~0? 15%、碳酸氫鈉0? 1~0.3%，余量為水，所 述百分比為質(zhì)量百分比。其中所述氮源為本領(lǐng)域常規(guī)氮源，只要能夠?yàn)轭?lèi)芽孢桿菌的發(fā)酵 提供氮元素即可，所述氮源較佳地為酵母膏，蛋白胨和/或酪朊水解物中的一種或多種。其 中所述碳源為本領(lǐng)域常規(guī)的碳源，只要能夠?yàn)轭?lèi)芽孢桿菌的發(fā)酵提供碳元素即可，所述碳 源較佳地為蔗糖和/或糖蜜。其中所述類(lèi)芽孢桿菌的接種量較佳地為1~5%，更佳地為 1. 5~4%，最優(yōu)地為2%，所述百分比為體積百分比，所述類(lèi)芽孢桿菌的發(fā)酵溫度較佳地為 25~37°C，更佳地為32~35°C，所述發(fā)酵的時(shí)間較佳地為18~48小時(shí)，更佳地為24~ 36小時(shí)，優(yōu)選地為30小時(shí)，所述震蕩培養(yǎng)的速度較佳地為100~300rpm，更佳地為150~ 200rpm，優(yōu)選地為 180rpm。
[0010] 本發(fā)明所述的發(fā)酵方法將所述類(lèi)芽孢桿菌CGMCCNo. 8333接種于培養(yǎng)基之前，較 佳地還包括該類(lèi)芽孢桿菌CGMCCNo. 8333活化獲得類(lèi)芽孢桿菌種子的步驟。所述步驟較 佳地包括以下步驟：將本發(fā)明所述類(lèi)芽孢桿菌CGMCCNo. 8333接種在TYC固體培養(yǎng)基中， 25~30°C培養(yǎng)18~28小時(shí)即得類(lèi)芽孢桿菌CGMCCNo. 8333種子；將所得類(lèi)芽孢桿菌CGMCC No. 8333種子的菌落均勻分散于TYC液體培養(yǎng)基內(nèi)，再按2%~5%體積百分比的接種量接 種于TYC液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為100~200rpm，培養(yǎng)18-28小時(shí)，將所得培養(yǎng) 物離心棄去上清，所得菌體用無(wú)菌蒸餾水洗滌后，用原培養(yǎng)體積的無(wú)菌蒸餾水懸浮，即得發(fā) 酵用的類(lèi)芽孢桿菌的種子。
[0011] 其中步驟（2)為將步驟（1)上清液與乙醇混合，乙醇與上清液混合的體積比為 2:1~4:1，將所得混合液靜置，靜置的溫度為2~10°C，靜置的時(shí)間為12~36小時(shí)，將混 合液離心收集沉淀物，除去溶劑，即得。
[0012] 其中所述離心的速度較佳地為8, 000~15, 000g，更佳地為10, 000~12, 000g，離 心的時(shí)間較佳地為5~15分鐘，更佳地為8~10分鐘，離心的溫度較佳地為4~8°C，更佳 地為5~7°C。其中所述乙醇與上清液混合的體積比為較佳地為2:1~4:1，更佳地為3:1， 所述靜置的溫度較佳地為2~10°C，更佳地為5~8°C，所述靜置的時(shí)間較佳地為12~36 小時(shí)，更佳地為18~30小時(shí)，最佳地為24小時(shí)。其中所述乙醇為本領(lǐng)域常規(guī)的乙醇，更佳 地為無(wú)水乙醇。當(dāng)所述離心的條件或者乙醇沉淀?xiàng)l件的技術(shù)參數(shù)值在本發(fā)明請(qǐng)求保護(hù)范圍 之外時(shí)，會(huì)使所得類(lèi)芽孢桿菌細(xì)菌素制劑的抑菌活性顯著降低。
[0013] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案之二為：一種如本發(fā)明所述制備方 法所得類(lèi)芽孢桿菌細(xì)菌素制劑。
[0014] 本發(fā)明所述類(lèi)芽孢桿菌細(xì)菌素制劑的制備方法中各步驟技術(shù)特征的優(yōu)選范圍與 上文所述制備方法中相應(yīng)的技術(shù)內(nèi)容完全一致，具體請(qǐng)參見(jiàn)上文所述技術(shù)內(nèi)容，此處不再 贅述。
[0015] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案之三為：如本發(fā)明所述的類(lèi)芽孢桿 菌細(xì)菌素制劑在制備食品防腐劑中的應(yīng)用。
[0016] 本發(fā)明所述類(lèi)芽孢桿菌細(xì)菌素制劑可以廣泛應(yīng)用于制備各種食品防腐劑，功能性 食品或者功能性飼料中。所述應(yīng)用較佳地為在制備食品防腐劑中的應(yīng)用。
[0017] 在符合本領(lǐng)域常識(shí)的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實(shí) 例。
[0018] 本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。
[0019] 本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于：
[0020] 1、解決了當(dāng)前細(xì)菌素來(lái)源狹隘的現(xiàn)狀，開(kāi)創(chuàng)性地將類(lèi)芽孢桿菌應(yīng)用于細(xì)菌素制劑 的制備方法；
[0021] 2、與傳統(tǒng)細(xì)菌素Nisin相比，采用本發(fā)明制備的細(xì)菌素制劑性質(zhì)更穩(wěn)定，尤其在 中性條件下抑菌活性顯著高于Nisin，因此，具有比Nisin更優(yōu)的應(yīng)用價(jià)值；
[0022] 3、采用本發(fā)明制備的類(lèi)芽孢桿菌細(xì)菌素制劑可以直接用于食品的生產(chǎn)，從而達(dá)到 抑制腐敗菌的增殖，延長(zhǎng)食品貨架期的目的，進(jìn)而降低了食品防腐劑的應(yīng)用成本。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 下面通過(guò)實(shí)施例的方式進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí) 施例范圍之中。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商 品說(shuō)明書(shū)選擇。本發(fā)明中所述的"室溫"是指進(jìn)行試驗(yàn)的操作間的溫度，