一種牛篣苷元的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種牛蒡提取物的制備方法，具體涉及一種牛蒡苷元的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]牛蒡子苷元，化學(xué)名:(3R，4R)_[(3，4-Dimethoxyphenyl )methy ]dihydro-3-[ (4_hyd r o xy-3-methoxy phenyl) me thy I ]_2( 3H)-furanone，分子式:C21H2406，分子量:372.41。近來(lái)報(bào)到，牛蒡子苷元在抗炎，抗病毒，抗腫瘤，免疫調(diào)節(jié)等方面表現(xiàn)出較強(qiáng)的藥理活性；同時(shí)可以作為一種新型的熱休克反應(yīng)抑制調(diào)節(jié)劑，對(duì)過(guò)高溫表現(xiàn)的癌癥的治療有幫助作用。此外還具有抗老年癡呆的作用和抑制K+攣縮的作用。牛蒡苷元是木脂素類化合物，主要來(lái)源于菊科植物牛蒡(ArctiumlappaL)的果實(shí)牛蒡子。牛蒡子中主要含有牛蒡苷和牛蒡苷元。經(jīng)驗(yàn)證，牛蒡苷體外在抑菌，抗病毒和抗腫瘤方面活性較弱，牛蒡苷進(jìn)入體內(nèi)后，在消化道中被腸道菌轉(zhuǎn)化為苷元的脫甲基化合物，此脫甲基化合物在肝臟兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下恢復(fù)為苷元，苷元被血液輸送到各個(gè)器官發(fā)揮作用，說(shuō)明在抗菌抗腫瘤方面，牛蒡苷元發(fā)揮主要作用。但是牛蒡子藥材中牛蒡苷含量大于5%，而牛蒡苷元的含量較低，僅有0.19%。
[0003]目前，已有關(guān)于牛蒡苷元的制備方法的研究，如一種牛蒡子苷元的制備方法，專利號(hào)CN101736050A和一種高純度牛蒡苷元的制備方法，專利號(hào)CN103145655A，前者采用牛蒡子藥材中自身固有的水解酶將牛蒡苷水解成牛蒡苷元，再經(jīng)硅膠柱色譜分離，溶劑重結(jié)晶法得到牛蒡苷元結(jié)晶，后者采用石油醚對(duì)牛蒡子脫脂，再用乙酸乙酯滲漉提取，將乙酸乙酯提取物在酸性條件下進(jìn)行牛蒡苷水解為牛蒡苷元，采用溶劑重結(jié)晶法和反相高效制備液相色譜法純化得到牛蒡苷元。第一種方法利用牛膀胱自身的水解酶進(jìn)行水解，第二種直接在酸性條件下進(jìn)行水解，兩者反應(yīng)時(shí)間慢，水解效率低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于，針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)，提供一種牛蒡苷元的制備方法。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案:本發(fā)明采用的發(fā)酵菌種為里氏木霉(Trichodermareesei，01(^40932)和泡盛曲霉變種(厶8口6作;[11118 awamorivar ,CICC2203)；
所述的制備方法包括以下步驟:
(1)菌種活化:將處于真空干燥管內(nèi)并低溫保存的菌種凍干粉取出后恢復(fù)至室溫，轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái)內(nèi)，以沾有75%酒精的棉花，擦拭外管，在火焰上加熱外管尖端，滴數(shù)滴無(wú)菌水于加熱處，使外管破裂，取出隔熱均勻涂布于PDA平板上，分離培養(yǎng)I?2d，培養(yǎng)溫度為28?30 Γ;
(2)制備種子菌液:將活化好的菌株接種于TOA平板上，置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)在28?30°C下培養(yǎng)5?6d，加入無(wú)菌水至平板中晃動(dòng)，沖下瓊脂表面的孢子，過(guò)濾，取得孢子懸浮液，計(jì)算孢子濃度，并配制成孢子濃度為16?17個(gè)/mL的懸浮液，將孢子懸浮液按1:25的體積比置于Mandel培養(yǎng)液中在28?30°C下培養(yǎng)I?2d即得種子菌液； (3)牛蒡子粉的發(fā)酵炮制:將里氏木霉種子菌液和泡盛曲霉變種種子菌液按接種比為1:1?4，接種量為I?5mL/l 1mL接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30 °C下發(fā)酵培養(yǎng)36?168h，發(fā)酵完后向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加I Omo I/LNaOH至NaOH的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2 %，終止發(fā)酵；
(4)牛蒡子粗提物的制備:在1000C下烘干發(fā)酵后的培養(yǎng)基并粉碎，將粉碎后的烘干制品置于甲醇溶液中，并在功率80W，頻率為20kHz下超聲輻射20min，靜置8?12h后過(guò)濾并收集濾液為牛蒡子粗提物溶液；
(5)純化:將硅膠，三氯甲烷充分溶脹后，濕法填入色譜柱，將牛蒡子粗提物溶液蒸干后溶于三氯甲烷中，上樣，洗脫液為三氯甲烷:乙酸乙酯(V: V，10: 2)，展開(kāi)劑為氯仿:甲醇(V:V,95:5),將洗脫液濃縮干燥，將干燥物再次用硅膠柱層析純化，洗脫液改為三氯甲烷:乙酸乙酯(v:v，6:l)，收集洗脫液，干燥結(jié)晶。
[0006]進(jìn)一步的，所述的Mandel營(yíng)養(yǎng)液由磷酸二氫鉀2g，硫酸銨1.4g，尿素0.3g，硫酸鎂
0.3g，氯化|丐0.3g，硫酸鐵5mg，硫酸猛1.56mg，硫酸鋅1.4mg，氯化鈷0.2mg混合后，添加蒸饋水定容至1L，添加吐溫80、蛋白胨、葡萄糖至吐溫80的濃度為2ml/L，蛋白胨的濃度為lml/L，葡萄糖的濃度10ml/L，用硫酸調(diào)PH至5.0?6.0，在115°C下滅菌20min制得。
[0007]進(jìn)一步的，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中含有50?92%的牛蒡子粉，碳源與氮源比為100:2?14，Mandel營(yíng)養(yǎng)液含量為5?30ml/110ml，發(fā)酵培養(yǎng)基的固液比為1: 1.5?5，PH為4?10。
[0008]優(yōu)選的，牛蒡子粉含量為52%，碳氮比為100:6，Mandel營(yíng)養(yǎng)液含量為10ml/110ml，發(fā)酵培養(yǎng)基的固液比為1:2，PH為5?7。
[0009]進(jìn)一步的，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中，氮源為蛋白胨、豆柏粉、尿素、(NH4)2S04、NH4NO3、NH4CL 的一種。
[0010]優(yōu)選的，本發(fā)明中，發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源為尿素。
[0011]進(jìn)一步的，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源為玉米粉、麩皮和蔗糖的一種或幾種，具體可為單一碳源、麩皮與玉米粉混合碳源、麩皮與蔗糖混合碳源、蔗糖與玉米粉混合碳源和玉米粉、麩皮、蔗糖的混合碳源。
[0012]優(yōu)選的，本發(fā)明發(fā)酵培養(yǎng)基中，碳源為麩皮:蔗糖:玉米粉為:1:1:1。
[0013]優(yōu)選的，本發(fā)明中泡盛曲霉變種與里氏木霉的種子菌液接種比為1:2，最佳接種量為2ml/110ml。
[0014]進(jìn)一步的，培養(yǎng)時(shí)間為36?16811，具體可為3611、4811、7211、9611、12011、14411、16811，但不僅限于此，優(yōu)選的培養(yǎng)時(shí)間144h。
[0015]進(jìn)一步的，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的制備方法為將牛蒡子粉、氮源、碳源裝入錐形瓶中在121 °C下滅菌15min，然后加入無(wú)菌Mandel營(yíng)養(yǎng)液和無(wú)菌水，在121 °C滅菌15min。
[0016]進(jìn)一步的，里氏木霉(Trichodermareesei)是多細(xì)胞的真核微生物，其可作為工業(yè)菌株用于生產(chǎn)分解不同植物材料的酶類，包括纖維素酶、半纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶等，里氏木霉適于蛋白生產(chǎn)，對(duì)人沒(méi)有毒性，在產(chǎn)酶條件下也不產(chǎn)生真菌毒素和抗生素，經(jīng)過(guò)基因工程手術(shù)改造的里氏木霉重組菌株安全無(wú)害。
[0017]進(jìn)一步的，泡盛曲霉變種(Aspergillus awamori var)在CYA培養(yǎng)基中，于25°C培養(yǎng)7天后菌落特征為:菌落直徑6.5cm；菌絲體白色，菌落深橄欖褐色;菌落絲絨狀，有放射狀溝紋;有滲出液;菌落反面土黃色至黃褐色。分生孢子頭放射狀;分生孢梗莖壁光滑;頂囊球形，直徑30-40μπι，表面全面可育；產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)雙層，?；?-10 X 2-4μπι，瓶梗4_8 X 2_4μπι ；分生孢子球形，直徑3.5—5.5μπι，壁稍粗糙。泡盛曲霉變種主要產(chǎn)糖化酶，果膠酶，不同化亞硝酸土卜
ΠΤΤ.0
[0018]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明以牛蒡子粉為原料采用生物發(fā)酵技術(shù)制備牛蒡子提取物，利用葡萄糖苷酶和纖維素酶高產(chǎn)菌株發(fā)酵炮制牛蒡子粉，在體外可控條件下使牛蒡苷的糖苷鍵斷裂轉(zhuǎn)化為牛蒡苷元，提高了牛蒡子中牛蒡苷元的含量，并采用簡(jiǎn)單有效的提純方法，能夠提取較高純度的牛蒡苷元，本發(fā)明可以最大程度的錄用牛蒡子原料，降低浪費(fèi)率，提高提取率，轉(zhuǎn)化效率高，同時(shí)避免了強(qiáng)酸強(qiáng)堿的使用，是一種簡(jiǎn)便高效的牛蒡苷元制備方法。
【具體實(shí)施方式】
[0019]下面結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0020]實(shí)施例1
[0021]—種牛蒡苷元的制備方法包括以下步驟:(I)菌種活化:將處于真空干燥管內(nèi)并低溫保存的菌種凍干粉取出后恢復(fù)至室溫，轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái)內(nèi)，以沾有75%酒精的棉花，擦拭外管，在火焰上加熱外管尖端，滴數(shù)滴無(wú)菌水于加熱處，使外管破裂，取出隔熱均勻涂布于PDA平板上，分離培養(yǎng)2d，培養(yǎng)溫度為30°C ；
(2)制備種子菌液:將活化好的菌株接種于PDA平板上，置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)在30°C下培養(yǎng)6d，加入無(wú)菌水至平板中晃動(dòng)，沖下瓊脂表面的孢子，過(guò)濾，取得孢子懸浮液，計(jì)算孢子濃度，并配制成孢子濃度為17個(gè)/mL的懸浮液，將孢子懸浮液按1:25的體積比置于Mandel培養(yǎng)液中在30°C下培養(yǎng)2d即得種子菌液；
(3)牛蒡子粉的發(fā)酵炮制:將里氏木霉種子菌液和泡盛曲霉變種種子菌液按接種比為1:4，接種量為5mL/110mL接種至含有92%的牛蒡子粉，碳源(玉米粉、麩皮和蔗糖)與氮源(豆柏粉)比為100:14，1^11如1營(yíng)養(yǎng)液含量為301111/1101111，發(fā)酵培養(yǎng)基的固液比為1:5，？!1為10的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30°C下發(fā)酵培養(yǎng)168h，發(fā)酵完后向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加10mol/LNa0H至NaOH的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%，終止發(fā)酵；
(4)牛蒡子粗提物的制備:在1000C下烘干發(fā)酵后的培養(yǎng)基并粉碎，將粉碎后的烘干制品置于甲醇溶液中，并在功率80W，頻率為20kHz下超聲輻射20min，靜置12h后過(guò)濾并收集濾液為牛蒡子粗提物溶液；
(5)純化:將硅膠，三氯甲烷充分溶脹后，濕法填入色譜柱，將牛蒡子粗提物溶液蒸干后溶于三氯甲烷中，上樣，洗脫液為三氯甲烷:乙酸乙酯(V: V，10: 2)，展開(kāi)劑為氯仿:甲醇(V:V,95:5),將洗脫液濃縮干燥，將干燥物再次用硅膠柱層析純化，洗脫液改為三氯甲烷:乙酸乙酯(v:v，6:l)，收集洗脫液，干燥結(jié)晶。
[0022]實(shí)施例2
[0023]—種牛蒡苷元的制備方法包括以下步驟:(I)菌種活化:將處于真空干燥管內(nèi)并低溫保存的菌種凍干粉取出后恢復(fù)至室溫，轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái)內(nèi)，以沾有75%酒精的棉花，擦拭外管，在火焰上加熱外管尖端，滴數(shù)滴無(wú)菌水于加熱處，使外管破裂，取出隔熱均勻涂布于PDA平板上，分離培養(yǎng)ld，培養(yǎng)溫度為28°C ；
(2)制備種子菌液:將活化好的菌株接種于PDA平板上，置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)在28 °C下培養(yǎng)5d，加入無(wú)菌水至平板中晃動(dòng)，沖下瓊脂表面的孢子，過(guò)濾，取得孢子懸浮液，計(jì)算孢子濃度，并配制成孢子濃度為16個(gè)/mL的懸浮液，將孢子懸浮液按1:25的體積比置于Mandel培養(yǎng)液中在28°C下培養(yǎng)Id即得種子菌液；
(3)牛蒡子粉的發(fā)酵炮制:將里氏木霉種子菌液和泡盛曲霉變種種子菌液按接種比為1:1，接種量為lmL/110mL接種至含有50%的牛蒡子粉，碳源(玉米粉和蔗糖)與氮源(尿素)比為100:2，Mande I營(yíng)養(yǎng)液含量為5ml/11Oml，發(fā)酵培養(yǎng)基的固液比為1: 1.