一種水產(chǎn)蛋白-植物蛋白復(fù)合型活性肽的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種水產(chǎn)蛋白-植物蛋白復(fù)合型活性肽的制備方法，屬于水產(chǎn)品加工與利用領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]蛋白質(zhì)酶解的后的產(chǎn)物小肽不但容易消化、吸收，而且還具有抗高血壓、抗膽固醇、抗血栓形成、改善脂質(zhì)代謝、增強(qiáng)人體體能、幫助恢復(fù)疲勞、促進(jìn)鈣磷和其它微量元素的吸收、促進(jìn)大腦發(fā)育、提高記憶力、增強(qiáng)巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞活力、增強(qiáng)免疫功能、保護(hù)表皮細(xì)胞、防止黑色素沉淀、消除體內(nèi)自由基等功效。
[0003]關(guān)于水產(chǎn)蛋白活性肽的制備，國(guó)內(nèi)進(jìn)行了大量的研究。目前，水產(chǎn)蛋白活性肽的制備方法主要有自溶酶解、酶解法、液態(tài)發(fā)酵法和固態(tài)發(fā)酵與液態(tài)酶解相結(jié)合的方法這四種。專(zhuān)利申請(qǐng)200810195646.4“內(nèi)源酶制備生物活性小肽的工藝”公開(kāi)了一種利用海洋低值魚(yú)體內(nèi)的內(nèi)源酶自溶酶解的方法制備水產(chǎn)蛋白生物活性小肽的方法。專(zhuān)利申請(qǐng)201410145196.3“一種制備扇貝裙邊活性肽的方法”公開(kāi)了一種酶解法制備水產(chǎn)蛋白活性肽的方法。專(zhuān)利申請(qǐng)CN102028091A “一種納豆菌發(fā)酵法制備低分子魚(yú)肽的方法”公開(kāi)了一種液體發(fā)酵法制備魚(yú)蛋白肽的方法，專(zhuān)利申請(qǐng)201210539941.3“一種由魚(yú)蛋白肽和與大豆肽組成的蛋白肽的生產(chǎn)方法”公開(kāi)了一種由固態(tài)發(fā)酵與液態(tài)酶解相結(jié)合制備水產(chǎn)蛋白活性肽的方法。
[0004]現(xiàn)有的水產(chǎn)蛋白活性肽制備技術(shù)中存在以下缺陷。首先，現(xiàn)有的水產(chǎn)蛋白活性肽制備技術(shù)中都有高溫處理的過(guò)程。以上制備技術(shù)中都有高溫滅酶這一工序;微生物發(fā)酵的方法原料需要滅菌。以上這些高溫處理，會(huì)在一定程度減弱制備的功能肽或水產(chǎn)蛋白本身所含其它功能性成分中的生物學(xué)活性;另外高溫處理過(guò)程，會(huì)增強(qiáng)美拉德，使得酶解液顏色變深，為成品加工過(guò)程增加了負(fù)擔(dān)。其次，外加酶酶解的方法需要外加蛋白酶，增加了成本；自溶酶解由于內(nèi)源酶的不足，導(dǎo)致酶解不徹底。另外，微生物發(fā)酵法雖然不用外加蛋白酶，但是原料需要滅菌導(dǎo)致內(nèi)源酶失活，不能充分地有效利用內(nèi)源酶。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對(duì)現(xiàn)有的水產(chǎn)蛋白活性肽制備技術(shù)存在的問(wèn)題。本發(fā)明的主要目的是提供一種低溫的制備水產(chǎn)蛋白活性肽的方法，以便更好地保留制備的功能肽和水產(chǎn)蛋白本身所含功能性成分的生物學(xué)活性。本發(fā)明的另一目的是提供一種發(fā)酵法制備活性肽的方法，使得微生物發(fā)酵與內(nèi)源酶酶解過(guò)程能有機(jī)結(jié)合在一起。本發(fā)明還有一目的是簡(jiǎn)化活性肽的制備工序，降低其生產(chǎn)成本。
[0006]為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下:一種水產(chǎn)蛋白-植物蛋白復(fù)合型活性肽的制備方法，包括如下步驟:
(I)將斜面保藏的能產(chǎn)耐高溫蛋白酶的枯草芽孢桿菌(Baci IIus subtil is)HL_2接入到滅菌后冷卻的LB液體培養(yǎng)基中，于55 °C、150r/min培養(yǎng)12h，制備成枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HL_2種子液備用；
(2)將新鮮的水產(chǎn)蛋白絞碎后備用，將植物蛋白粉碎后過(guò)60目篩備用；
(3)將步驟(2)制得的絞碎水產(chǎn)蛋白和粉碎的植物蛋白按質(zhì)量比為0.5-1.5:1的比例混合，并加營(yíng)養(yǎng)物和水混勻，獲得最終水分含量控制在40%?80%范圍內(nèi)的發(fā)酵培養(yǎng)基；
(4)往步驟然(3)制得的發(fā)酵培養(yǎng)基上接入步驟(I)所制備的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)HL-2種子液，并混勾；
(5)固態(tài)發(fā)酵:將步驟(4)獲得的加入菌的發(fā)酵培養(yǎng)基按照下列方法進(jìn)行發(fā)酵:發(fā)酵培養(yǎng)基分裝在已消毒的發(fā)酵淺盤(pán)中，裝料厚度為4cm?8cm，淺盤(pán)中發(fā)酵培養(yǎng)基表面覆蓋已滅菌的濕紗布，再將淺盤(pán)置于已滅菌的固體發(fā)酵房?jī)?nèi)的擱架上發(fā)酵，控制環(huán)境溫度在50t>55°C，發(fā)酵時(shí)間為38h?48h;
(6)液態(tài)酶解:將步驟(5)得到固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物與水按質(zhì)量比為1:3的比例混合，并攪拌均勻后加入到酶解罐中，控制酶解溫度為55°C，酶解2h;
(7)成品的加工:將步驟(6)得到的液態(tài)酶解產(chǎn)物進(jìn)行過(guò)濾去除沉淀得到酶解液;酶解液通過(guò)截留分子量為5000道爾頓的超濾膜的超濾去除大分子蛋白質(zhì)而得到透過(guò)液;透過(guò)液然后通過(guò)截留分子量為200道爾頓的納濾膜的納濾去除氨基酸而得到濃縮液;濃縮液經(jīng)過(guò)冷凍干燥而得到活性肽成品。
[0007]所述步驟(I)中所用的能產(chǎn)耐高溫蛋白酶的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)1-2已于2016年1月18日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏編號(hào)為GDMCC No:60001，保藏地址為廣州市先烈中路100號(hào)大院59號(hào)樓5樓廣東省微生物研究所。
[0008]所述步驟(2)中的水產(chǎn)蛋白為羅非魚(yú)下腳料、南極磷蝦、蝦頭、牡蠣、扇貝裙邊、鱈魚(yú)下腳料、魷魚(yú)下腳料、青鱗魚(yú)下腳料、青魚(yú)下腳料、鰱魚(yú)下腳料、草魚(yú)下腳料和鰹魚(yú)下腳料中的一種。所述步驟(2)中的植物蛋白為豆柏、花生柏、棉籽柏和菜柏中的一種或其中兩種以上的混合物。
[0009]所述步驟(3)中的營(yíng)養(yǎng)物為玉米粉、食品級(jí)氯化鈣、食品級(jí)氯化亞鐵和食品級(jí)磷酸氫二鉀組成的混合物。所述步驟(3 )中的營(yíng)養(yǎng)物的加入量以添加的營(yíng)養(yǎng)物的質(zhì)量占發(fā)酵培養(yǎng)基總質(zhì)量百分比計(jì)，分別為:玉米粉0.0I %?5%，食品級(jí)氯化|丐0.01 %?5%，食品級(jí)氯化亞鐵0.01%?5%，食品級(jí)磷酸氫二鉀0.01%?5%。
[0010]所述步驟(4)中枯草芽孢桿菌(Baci I Ius subtil is )HL_2種子液的接種量以接入種子液的質(zhì)量占發(fā)酵培養(yǎng)基總質(zhì)量百分比計(jì)，為I %?15%。
[0011 ]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)。
[0012](I)整個(gè)制備過(guò)程沒(méi)有高溫處理，更好地保留了制備的功能肽和水產(chǎn)蛋白本身所含其它功能性成分中的生物學(xué)活性。本發(fā)明申請(qǐng)采用耐高溫枯草芽孢桿菌發(fā)酵，在高溫條件下可以抑制致病菌和腐敗菌的生長(zhǎng)，因此本技術(shù)中培養(yǎng)基無(wú)需滅菌。另外，本技術(shù)采用超濾膜去除酶解液中的蛋白酶，無(wú)需高溫滅酶。
[0013](2)簡(jiǎn)化了工序，降低了成本。由于本發(fā)明申請(qǐng)沒(méi)有高溫滅酶的過(guò)程，這不但降低了能耗，而且還會(huì)大大降低酶解液的美拉德反應(yīng)，所以酶解液的顏色比較淺。而后續(xù)的膜分離又有一定的脫色效果，因此本技術(shù)中可以無(wú)需脫色這個(gè)程序，簡(jiǎn)化了工序，降低了成本。
[0014](3)內(nèi)源酶酶解與微生物發(fā)酵的完美結(jié)合?，F(xiàn)有的發(fā)酵技術(shù)中，原料都需滅菌，這不但增加了能耗，而且又使得水產(chǎn)蛋白的內(nèi)源酶失活。本技術(shù)中原料無(wú)需滅菌，保留了水產(chǎn)蛋白中內(nèi)源酶的活性。并且，微生物發(fā)酵的溫度與內(nèi)源酶的最適酶解溫度一致，使得內(nèi)源酶酶解與微生物發(fā)酵能完美結(jié)合在一起。正是由于本發(fā)明中充分利用內(nèi)源酶的酶解作用，使得本發(fā)明無(wú)需另加蛋白酶。
[0015](4)制備成本不但要低于現(xiàn)有固態(tài)發(fā)酵聯(lián)合液態(tài)酶解技術(shù)，而且發(fā)酵效果也要優(yōu)于現(xiàn)有的固態(tài)發(fā)酵聯(lián)合液態(tài)酶解技術(shù)。與現(xiàn)有的采用發(fā)酵法制備活性肽的技術(shù)相比，本發(fā)明申請(qǐng)?jiān)蠠o(wú)需滅絕，可降低能耗和成本；由于本發(fā)明申請(qǐng)?zhí)峁┑募夹g(shù)方案無(wú)需高溫滅絕，保留了水產(chǎn)蛋白內(nèi)源蛋白酶的酶活，這是現(xiàn)有的采用常溫發(fā)酵菌種制備活性肽無(wú)法做到的，在水產(chǎn)蛋白內(nèi)源蛋白酶的協(xié)助下，本發(fā)明申請(qǐng)可以不用外加蛋白酶。在高溫下蛋白酶酶的活性更強(qiáng)，因此，本技術(shù)采用耐高溫菌種進(jìn)行發(fā)酵，水產(chǎn)蛋白的水解度要高于現(xiàn)有的常溫菌種發(fā)酵技術(shù)。
[0016]本發(fā)明提供了一種水產(chǎn)蛋白-植物蛋白復(fù)合型活性肽的制備方法。本發(fā)明技術(shù)作用條件溫和，更多地保留了制備的功能肽和水產(chǎn)蛋白本身所含其它功能性成分中的生物學(xué)活性，并且簡(jiǎn)化了制備工序和降低了活性肽的生產(chǎn)成本，有著良好的應(yīng)用前景。
【具體實(shí)施方式】
[0017]為了更好地理解本發(fā)明，下面就水產(chǎn)蛋白的種類(lèi)、植物蛋白的種類(lèi)、發(fā)酵參數(shù)和發(fā)酵方式的選擇結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于此。
[0018]實(shí)施例1:將斜面保藏的能產(chǎn)耐高溫蛋白酶的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)HL-2接入到滅菌后冷卻的LB液體培養(yǎng)基中，于55 °C、150r/min培養(yǎng)12h，制備成枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HL-2種子液備用。將新鮮的南極磷蝦絞碎后備用;將豆柏粉碎后過(guò)60目篩備用。將100公斤絞碎的南極磷蝦和100公斤粉碎并過(guò)60目篩的豆柏混合，并加入5公斤玉米粉、400克食品級(jí)氯化鈣、300克食品級(jí)氯化亞鐵、600克食品級(jí)磷