專利名稱：：新疆雪蓮的hplc指紋圖譜及dna指紋圖譜的建立方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及新疆雪蓮的HPLC指紋圖譜及DNA指紋圖譜的建立方法，可從化學(xué)和生物學(xué)兩個(gè)角度對(duì)新疆雪蓮進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。
背景技術(shù)：
：新疆雪蓮全草入藥，是雪蓮花類藥材主流品種。雪蓮藥用歷史較久，甘、苦、溫，歸肝、脾、腎經(jīng)。具有清熱解毒、祛風(fēng)除濕、通經(jīng)活血、強(qiáng)筋助陽(yáng)、抗炎鎮(zhèn)痛、暖宮散寒等功效；用于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、宮寒腹痛、閉經(jīng)、胎衣不下、中風(fēng)、腎虛腰痛、遺精陽(yáng)痿、麻疹不透、肺寒咳嗽、高山不適應(yīng)癥等，為藏醫(yī)、藏獸醫(yī)、民間中醫(yī)所習(xí)用。近年來(lái)，隨著中藥現(xiàn)代化、國(guó)際化的深入發(fā)展，政府、企業(yè)和研究人員越來(lái)越清醒地認(rèn)識(shí)到，控制中藥的質(zhì)量是我們亟待解決的關(guān)鍵技術(shù)之一，目前全國(guó)各科研機(jī)構(gòu)已紛紛進(jìn)行中藥指紋圖譜的研究。國(guó)家藥品監(jiān)督管理局己于2000年底頒布了《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求》，在中藥注射劑領(lǐng)域率先推行指紋圖譜作為重要質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。中藥指紋圖譜按測(cè)定手段可分為中藥化學(xué)指紋圖譜和中藥生物指紋圖譜。中藥化學(xué)指紋圖譜首推色譜方法和聯(lián)用技術(shù)。中藥生物指紋圖譜主要是測(cè)定各種中藥材的DNA圖譜，利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)從不同生物樣品中人工擴(kuò)增DNA片段。這種DNA片段的大小、數(shù)目可因不同的生物而異，故稱之為"DNA指紋圖譜"。DNA指紋分析是重要的分子標(biāo)記技術(shù)，它包括限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(RFLP)、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(AFLP)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性分析(RAPD)、簡(jiǎn)單重復(fù)序列和簡(jiǎn)單重復(fù)序列區(qū)間多態(tài)性分析(SSR和ISSR)等。其中，RAPD和ISSR技術(shù)采用隨機(jī)引物對(duì)基因組DNA進(jìn)行全掃描，具有比其他分子標(biāo)記技術(shù)簡(jiǎn)單易行，經(jīng)濟(jì)快速等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)DNA多態(tài)性檢測(cè)效率高，可隨寡聚核苷酸基因引物結(jié)合位點(diǎn)的頻率有效地對(duì)基因組進(jìn)行差異性分析。目前關(guān)于雪蓮HPLC指紋圖譜的專利尚未見(jiàn)到，已發(fā)表文章共有7篇，其中苗愛(ài)東等人以烏魯木齊南山產(chǎn)新疆雪蓮藥材為分析對(duì)象，建立了7個(gè)不同產(chǎn)地的新疆雪蓮藥材樣品的指紋圖譜，確定了13個(gè)共有峰，但未對(duì)這些峰進(jìn)行指認(rèn)(苗愛(ài)東、孫殿甲、彭燕等，HPLC法建立新疆雪蓮指紋圖譜研究，中成藥，2003,25(9):691-693);苗愛(ài)東等人還研究了雪蓮注射液的HPIC指紋圖譜測(cè)定方法，以紫丁香苷為對(duì)照品，標(biāo)示出雪蓮注射液的ll個(gè)特征指紋峰(苗愛(ài)東、孫殿甲、彭燕等，雪蓮注射液HPLC指紋圖譜研究，中國(guó)中藥雜志，2004,29(11):1044-1046);薛秀峰等對(duì)10批次的雪蓮藥材制成的供試液進(jìn)行指紋研究，確定17個(gè)峰為共有指紋峰，并指認(rèn)8號(hào)峰為綠原酸，IO號(hào)峰為紫丁香苷，13號(hào)峰為戸丁(薛秀峰，張海茹，潘麗娜等，雪蓮及其注射液的指紋圖譜研究.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2005,39(1):72-74);黃毅等研究了采自奇臺(tái)縣種植基地的天山雪蓮不同部位的HPLC指紋圖譜，得出了15個(gè)共有峰，但未進(jìn)行色譜峰的指認(rèn)(黃毅，周茜，閻明等，天山雪蓮不同部位總黃酮含量及高效液相指紋圖譜分析，中藥材，2005,28(11):980-982);王曉玲等人建立了購(gòu)于新疆藥材公司的10批新疆雪蓮樣品的指紋圖譜，標(biāo)示出12個(gè)共有峰，鑒定出其中7個(gè)化學(xué)成分，分別為東莨菪苷、蘆丁、異槲皮苷、忍冬苷、斛皮苷、高車(chē)前素和粗毛豚草素(王曉玲，蔡敏，周燕等，新疆雪蓮的高效液相指紋圖譜及液-質(zhì)聯(lián)用分析，天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2006，18(4):624-627);閏明等人采用HPLC/DAD法對(duì)7個(gè)產(chǎn)地的雪蓮色譜圖中共有8強(qiáng)峰進(jìn)行了光譜相似檢驗(yàn)，共有8強(qiáng)峰的UV光譜圖完全一致，光譜相似指數(shù)為l，8個(gè)共有峰中峰3為蘆丁(閆明，黃貌仲婕等，HPLC/DAD光譜相似指數(shù)法在雪蓮指紋圖中的研究，藥物分析雜志，2007,27(4):506-509);歐元等人以綠原酸、紫丁香苷、蘆丁、木犀草素、芹菜素5種對(duì)照品為對(duì)照，建立了10個(gè)不同產(chǎn)地天山雪蓮的指紋圖譜，標(biāo)示出天山雪蓮的13個(gè)特征指紋峰(歐元，袁曉凡，徐春明等，天山雪蓮HPLC指紋圖譜研究，中草藥，2008,39(1):I05-10S)。以上7篇文章中除1篇研究的只是雪蓮注射劑外，其余用于指紋圖譜研究的雪蓮藥材的制備都是使用雪蓮的醇提物(不同濃度的甲醇或乙醇提取物)直接進(jìn)行色譜分析，得出的共有峰數(shù)較少，很多研究中還未對(duì)共有峰進(jìn)行指認(rèn)。此外，很多文章中雪蓮藥材的來(lái)源地單一或不夠廣泛。樣品收集是研究指紋圖譜最初也是最關(guān)鍵的步驟，由于不同產(chǎn)地的中藥材化學(xué)成分很可能差異很大，所以收集的樣品要有足夠的代表性，只有在相當(dāng)數(shù)量的樣品中，才能清楚地顯現(xiàn)出它的特征。所以，至少要對(duì)10個(gè)產(chǎn)地以上不同等級(jí)的樣品進(jìn)行分析和考察，從中歸納出各批合格樣品所共有、峰面積相對(duì)穩(wěn)定的色譜峰作為指紋峰。只有保證樣品的代表性，才能保證建立的指紋圖譜的藥效性。同時(shí)，雪蓮化學(xué)成分非常復(fù)雜，包括黃酮、生物堿、多糖、內(nèi)酯、揮發(fā)油等多類化學(xué)成分。由于每種分析方法只能表達(dá)中藥材的部分信息，對(duì)于化學(xué)成分復(fù)雜的中藥材，可以采取分部位提取分別研究或采用不同分析方法的策略獲得更多的信息，必要時(shí)可以由多種方法制定一組圖譜共同構(gòu)成指紋圖譜。雪蓮DNA指紋圖譜研究尚未見(jiàn)報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供10個(gè)產(chǎn)地的新疆雪蓮不同提取部位的、色譜峰表征信息量大的HPLC指紋圖譜以及新疆雪蓮DNA指紋圖譜的建立方法，用于對(duì)雪蓮進(jìn)行有效的質(zhì)量檢測(cè)。本發(fā)明同時(shí)提供了10個(gè)產(chǎn)地新疆雪蓮的乙酸乙酯和正丁醇兩個(gè)不同極性提取部位的HPLC指紋圖譜。本發(fā)明中IO個(gè)不同產(chǎn)地的新疆雪蓮的HPLC指紋圖譜的建立通過(guò)以下歩驟實(shí)施1)本發(fā)明采用如表1所示的10個(gè)不同產(chǎn)地的新疆雪蓮為供試材料。表l雪蓮樣品來(lái)源編號(hào)12345678910產(chǎn)地奇臺(tái)焉耆和靜烏魯木齊新源鞏留哈密阜康天池巴里坤2)樣品溶液的制備分別取雪蓮樣品，粉碎后過(guò)40目篩，精密稱取，置圓底燒瓶中用70%乙醇浸泡，搖床過(guò)夜，超聲細(xì)胞粉碎機(jī)提取，離心，上清液減壓濃縮后，懸浮于水中，用等體積石油醚萃取2-3次，回收廢液，水層以乙酸乙酯萃取1-2次，乙酸乙酯層濃縮至干，甲醇定容，水層再用正丁醇萃取l-2次，合并后濃縮至干，甲醇定容，用0.20/mi有機(jī)相針式濾器過(guò)濾后取濾液進(jìn)行色譜分析。3)色譜條件的選擇島津VP-ODS色譜柱，乙腈-0.1%的乙酸梯度洗脫，梯度條件:0min-20min-40min-60min;乙腈濃度5%-30%-30%-100%，二元梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)270nm，柱溫30°C，流速1.0mL/min。4)測(cè)定分別精密吸取乙酸乙酯層和正丁醇層供試品溶液各5uL分別進(jìn)樣分析，記錄時(shí)間為60min。乙酸乙酯提取部位標(biāo)示出共有特征指紋峰20個(gè)，其峰面積總和占總峰面積的卯％以上，以其中9號(hào)峰蘆丁峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積為1，共有特征指紋峰如表2所示；正丁醇提取部位標(biāo)示出共有特征指紋峰11個(gè)，其峰面積總和占總峰面積的90%以上，以其中IO號(hào)峰蘆丁峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積為1，共有特征指紋峰如表2所示。5)HPLC-MS分析通過(guò)正負(fù)離子掃描可獲得各個(gè)化學(xué)成分的[M+H]+和[M-H]—的準(zhǔn)分子離子峰，由此得知化合物的分子量，結(jié)合相關(guān)報(bào)道(王曉玲，蔡敏，周燕等，新疆雪蓮的高效液相指紋圖譜及液-質(zhì)聯(lián)用分析，天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2006，18(4):624-627)，在乙酸乙酯提取部位指認(rèn)了7個(gè)成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)，在正丁醇提取部位指認(rèn)了3個(gè)成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)，結(jié)果如表2所示。表2新疆雪蓮乙酸乙酯提取部位和正丁醇提取部位的共有特征指紋峰<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>本發(fā)明中DNA指紋圖譜的建立通過(guò)以下步驟實(shí)施1)選用如表1所示的10個(gè)不同產(chǎn)地的新疆雪蓮為供試材料。2)新疆雪蓮DNA的提取及純化；3)用獲得高純度新疆雪蓮DNA為模板進(jìn)行RAPD和ISSR分析；4)選擇有代表性(穩(wěn)定性和重復(fù)性)的多態(tài)性RAPD和ISSR擴(kuò)增條帶，根據(jù)所選擇條帶的有、無(wú)構(gòu)建供試材料DNA指紋圖譜。該圖譜為由"1"和"0"組成的句子以陣列形式表現(xiàn)出來(lái)。所述數(shù)字"l"表示圖譜中某個(gè)位置上有擴(kuò)增帶存在，數(shù)字"0"表示在某個(gè)位置上沒(méi)有擴(kuò)增條帶存在。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)如下1)本發(fā)明以IO個(gè)不同產(chǎn)地的新疆雪蓮分成乙酸乙酯和正丁醇兩個(gè)不同極性提取部位建立起來(lái)的HPLC指紋圖譜，共有峰數(shù)多，表征信息量大，指認(rèn)的共有峰較多，代表性強(qiáng)，將兩個(gè)提取部位的指紋圖譜作為整體看待，可實(shí)現(xiàn)對(duì)化學(xué)成分復(fù)雜的雪蓮質(zhì)量?jī)?yōu)劣與真?zhèn)蔚娜?、有效判斷?)本發(fā)明建立的新疆雪蓮HPLC指紋圖譜方法簡(jiǎn)便，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性好，能從色譜的整體面貌上把握雪蓮藥材的化學(xué)成分。3)本發(fā)明提出的新疆雪蓮DNA指紋圖譜的建立方法，采用RAPD和ISSR兩種技術(shù)能從遺傳本質(zhì)上準(zhǔn)確、可靠地對(duì)雪蓮進(jìn)行種質(zhì)鑒定。4)本發(fā)明提供的新疆雪蓮HPLC指紋圖譜與提出的DNA指紋圖譜的建立方法相結(jié)合，可以從化學(xué)和生物學(xué)兩個(gè)角度對(duì)雪蓮質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)。圖1:IO個(gè)產(chǎn)地新疆雪蓮乙酸乙酯提取部位的HPLC指紋圖譜圖2:10個(gè)產(chǎn)地新疆雪蓮正丁醇提取部位的HPLC指紋圖譜具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，下述實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而并非對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例一新疆雪蓮HPLC指紋圖譜的建立1.儀器與材料ShimadzuLC-20A色譜儀，配自動(dòng)進(jìn)樣器，PDA二極管陣列檢測(cè)器，LCsolution色譜工作站，日本島津公司；LTQ液質(zhì)聯(lián)用儀，美國(guó)熱電公司；有機(jī)相過(guò)濾膜d:50mm，孔徑0.22pm，有機(jī)相針式過(guò)濾器13mmx0.20nm,上海安譜公司；40目標(biāo)準(zhǔn)篩，孔徑0.45pm:上虞市儀器廠；JY99-2D超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)；寧波新芝科器研究所；TDL-5-A型低速臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；超純水器，美國(guó)Mimpore公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；KQ5200DB型數(shù)控超聲清洗器，中國(guó)玉環(huán)曙峰。甲醇、乙腈(色譜醇J&KChemical);無(wú)水甲醇、乙酸(分析純，北京化工廠)；水為超純水，IO個(gè)不同產(chǎn)地的雪蓮。2.樣品的制備與"
發(fā)明內(nèi)容"所述"樣品的制備"相同。3.新疆雪蓮的HPLC指紋圖譜測(cè)定3.1色譜條件與"
發(fā)明內(nèi)容"所述"色譜條件"相同3.2共有峰確定如"
發(fā)明內(nèi)容"所述在乙酸乙酯提取部位標(biāo)示出20個(gè)共有峰(表3和表4)，在正丁醇提取部位標(biāo)示出11個(gè)共有峰(表5和表6)。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>140.0320.0400.2503.3540.1920.2040.4600.6210.0920.2930.5541.81150.0430.0996.4910.2850.2550.9890.4770.9290.3870.6321.0591.83160.1280.0911.7521.4240.2581.2200.3751.9800.0740.2290.7531.00170.0250.0261.5550.2290.0690.8690.1272.1670.0650.0850.5221.46180.4760.3836.7322.5951.0923.7991.9975.2121.9522.3453.6581.32190攝0.0070.2440.1180.0150.1000.0430.4320.0160.0150.1001.40200.0190.0300.7610.3800.0440.3360.1341.1570.0460.0430.2951.30表510個(gè)產(chǎn)地新疆雪蓮藥材正丁醇層共有峰的相對(duì)保留吋間共有峰雪蓮樣品'詢RSD(0/。)峰號(hào)SlS2S3S4S5S6S7S8S9S10值1-0.1310.1260.1300.1330.1310.1320.1300.1310.1300.1240.1302.0820.1530.1500.1500.1510.1510.1510.1500.1520.1500.1500.1510.7130.2070.2040.2060.2060.2070.2060.2050.2050.2060.2050.2060.4840.2310.2360.2380.2440.2330.2430.2290.2280.2320.2350.2352.290.4450.4490.4510.4560.4470.4530.4420.4430.4460.4480.4480.9860.5440.5480.5490.5540.5460.5520.5400.5420.5460.5480.5470.7770.7030.7020.7020.7030.7040.7020.6990.6990.7020.7020.7020.2280.7190.7120.7120.7120.7220.7260.7150.7150.7110.7240.7170.7890細(xì)0.8420.8710細(xì)0.8670.8660.8620.8540.8390.8430.8571.4110l細(xì)1.0001.000l細(xì)l細(xì)1.0001.000l扁1.0001.0001.0000.00111.0951.0801.0791.0801.0931.0911.0931:0941.0911.0801.0880.63表610個(gè)產(chǎn)地新疆雪蓮藥材正—j舊層共有峰的相對(duì)峰面積共有峰雪蓮樣品平均峰值SlS2S3S4S5S6S7S8S9S10值10.0370.0770.036'0.1110.1040.1390.2040.1930.0130.0650.1050.620.0370據(jù)0.0140.0710.0490.0290.1100.1190.0130.0320.0510.740.1710.0220.0130.0220.0390.1270.0680.2440扁0.0270.0631.2740.0140.0770.0220細(xì)0.0420.1160.2320.2650.0180.0810.1020.860.0120.0470.0050.0200.0350.0330.0270.1450.0080.0380.0401.0260.0780.0350.0250.1550.1190.0350.0290.3160.0210.0370扁1.080.0400.1080.0590.0870.0750.1620.1420.13S'0.0860.1190.1080.3680.0210.0210.0070.0280.0740.0500.0220.1580.0180.0720細(xì)0.9190.5210.1510.1290.5620.4300.9880.3852.9560.4570.4190.7201.15101.000l扁l細(xì)l細(xì)1.0001.0001.000l扁l扁l扁l細(xì)0.00110.0240.0240.0320.0190.0370.0090.0140.0500.0190.0190.0250.493.3指紋圖譜精密度試驗(yàn)精密稱取一種新疆雪蓮粉末5g,按照2.2所示方法制備成供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，分別對(duì)共有峰的相對(duì)保留吋間和相對(duì)峰面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，RSDX小于3%。結(jié)果表明此方法精密度好。3.4指紋圖譜穩(wěn)定性試驗(yàn)精密稱取新疆雪蓮粉末5g，按照2.2所示方法制備成供試品溶液，在室溫下分別放置0、2、4、8、12、24h后進(jìn)樣分析，分別對(duì)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，RSD。/。小于3。/。。說(shuō)明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。結(jié)果表明此方法穩(wěn)定性好。3.5指紋圖譜重復(fù)性試驗(yàn)取同一批新疆雪蓮粉末6份，按照2.2所示方法制備成6份供試品溶液，分別進(jìn)樣，對(duì)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，RSD。/。小于3%。結(jié)果表明此方法重復(fù)性好。4.HPLC-MS分析如"
發(fā)明內(nèi)容"所述在乙酸乙酯提取部位指認(rèn)了7個(gè)成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)，在正丁醇提取部位指認(rèn)了3個(gè)成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)，結(jié)果分別見(jiàn)表7和表8。表7新疆雪蓮乙酸乙酯層的HPLC-MS分析結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>實(shí)施例2新疆雪蓮DNA指紋圖譜的建立方法1.DNA的提取采取各產(chǎn)地藥材的干燥葉片磨樣，利用CTAB法提取其DNA，所得的DNA采用凝膠電泳結(jié)合密度掃描法鑒定其純度和濃度。2.PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)在型號(hào)為L(zhǎng)ongeneMG-96G的PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行，反應(yīng)體系為25ul。其中，RAPD分析包含模板基因組50ngDNA、2.3mmol/LMg2+、1.8UTaq酶、0.35mmol/LdNTP、0.6umol/L引物，基本擴(kuò)增程序?yàn)?5。C預(yù)變性2min,94。C變性40s,37"退火lmin,72。C延伸2min，40個(gè)循環(huán)，最后72'C延伸7min。ISSR分析包含模板基因組50ngDNA、2.5mmol/LMg2+、2.5UTaq酶、0,35mmol/LdNTP、0.8umol/L引物，基本擴(kuò)增程序?yàn)?4。C預(yù)變性5min,94"變性30s，53。C退火45s，72。C延伸2min，40個(gè)循環(huán)，最后72'C延伸7min。3.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中加入0.005%的溴酚蘭指示劑，室溫下在2%的瓊脂糖凝膠上電泳2h(100v)，條帶分子量大小通過(guò)凝膠成像掃描分析。4.數(shù)據(jù)的分析統(tǒng)計(jì)能產(chǎn)生多態(tài)性的引物在10個(gè)產(chǎn)地新疆雪蓮DNA樣品中擴(kuò)增的電泳帶總數(shù)與多態(tài)性帶的數(shù)目。在電泳圖譜同一個(gè)位點(diǎn)上有電泳帶記錄為1，無(wú)電泳帶記錄為0。0、1矩陣圖輸入計(jì)算機(jī)。根據(jù)Nei的方法計(jì)算不同產(chǎn)地新疆雪蓮間的相似系數(shù)(GS)，按平均距離法(UPGMA法)進(jìn)行聚類分析。5.DNA指紋圖譜的構(gòu)建按照上述各材料各引物的擴(kuò)增情況，挑取具有代表性的(穩(wěn)定性和重復(fù)性良好的)RAPD和ISSR多態(tài)性帶，繪制10個(gè)產(chǎn)地新疆雪蓮的DNA指紋圖譜。權(quán)利要求1、新疆雪蓮的HPLC指紋圖譜及DNA指紋圖譜的建立方法，其特征在于1)HPLC指紋圖譜是對(duì)10個(gè)不同產(chǎn)地的新疆雪蓮的乙酸乙酯和正丁醇兩個(gè)不同極性提取部位進(jìn)行指紋圖譜分析；2)DNA指紋圖譜建立方法，是采用RAPD和ISSR兩種分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行DNA多態(tài)性分析。2、根據(jù)權(quán)利1要求的新疆雪蓮的HPLC指紋圖譜，其特征在于，乙酸乙酯提取部位共有特征指紋峰有20個(gè)，其峰面積總和占總峰面積的90%以上，以其中9號(hào)峰蘆丁峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積為1，共有特征指紋峰為-1號(hào)峰相對(duì)保留時(shí)間0.103-0.110,相對(duì)峰面積0.003-0.414;2號(hào)峰相對(duì)保留時(shí)間0.123-0.131,相對(duì)峰面積0.008-0.189;3號(hào)峰相對(duì)保留時(shí)間0.149-0.151，相對(duì)峰面積0.002-0.114;4號(hào)峰相對(duì)保留時(shí)間0.205-0.214，相對(duì)峰面積0.002-0.076;5號(hào)峰相對(duì)保留時(shí)間0.228-0.232，相對(duì)峰面積0.002-0.087;6號(hào)峰相對(duì)保留時(shí)間0.616-0.623，相對(duì)峰面積0.013-0.268;7號(hào)峰相對(duì)保留時(shí)間0.800-0.813，相對(duì)峰面積0.072-0.503;8號(hào)峰相對(duì)保留時(shí)間0.829-0.851，相對(duì)峰面積0.002-1.522;9號(hào)峰相對(duì)保留時(shí)間1，相對(duì)峰面積l;IO號(hào)峰相對(duì)保留時(shí)間1.056-1.060,相對(duì)峰面積0.032-0.307;ll號(hào)峰:相對(duì)保留時(shí)間1.074-1.081，相對(duì)峰面積0.027-0.203;12號(hào)峰:相對(duì)保留時(shí)間1.154-1.158，相對(duì)峰面積0.049-3.682;13號(hào)峰相對(duì)保留時(shí)間1.176-1.180，相對(duì)峰面積0.020-0.395;14號(hào)峰:相對(duì)保留時(shí)間1.323-1.343，相對(duì)峰面積0.032-3.354;15號(hào)峰相對(duì)保留時(shí)間1.872-1.894，相對(duì)峰面積0.043-6.491;16號(hào)峰相對(duì)保留時(shí)間2.251-2.267，相對(duì)峰面積0.074-1.752;17號(hào)峰相對(duì)保留時(shí)間2.275-2.289,相對(duì)峰面積0.025-2.167;18號(hào)峰相對(duì)保留時(shí)間2.293-2.308，相對(duì)峰面積0.383-16.732;19號(hào)峰相對(duì)保留時(shí)間2.742-2.759，相對(duì)峰面積0.006-0.432;20號(hào)峰相對(duì)保留時(shí)間2.765-2.786，相對(duì)峰面積0.019-1.157;正丁醇提取部位共有特征指紋峰有11個(gè)，其峰面積總和占總峰面積的90%以上，以其中IO號(hào)峰蘆丁峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積為1，共有特征指紋峰為相對(duì)峰面積0.013-0.204;相對(duì)峰面積0.013-0.119;相對(duì)峰面積0.022-0.244;相對(duì)峰面積0.014-0.265;相對(duì)峰面積0.012-0.145;相對(duì)峰面積0.021-0.316;相對(duì)峰面積0.040-0.162;相對(duì)峰面積0.007-0.158;相對(duì)峰面積0.129-2.956;相對(duì)峰面積l;相對(duì)峰面積0.019-0.050:。1號(hào)峰相對(duì)保留時(shí)間0.124-0.1332號(hào)峰相對(duì)保留時(shí)間0.150-0.1533號(hào)峰相對(duì)保留時(shí)間0.204-0.2074號(hào)峰相對(duì)保留時(shí)間0.229-0.2445號(hào)峰相對(duì)保留時(shí)間0.442-0.4566號(hào)峰相對(duì)保留時(shí)間0.540-0.5527號(hào)峰相對(duì)保留時(shí)間0.699-0.7048號(hào)峰相對(duì)保留時(shí)間0.712-0.7269號(hào)峰相對(duì)保留時(shí)間0.839-0.87110號(hào)峰相對(duì)保留時(shí)間1，11號(hào)峰相對(duì)保留時(shí)間1.059-1.0943、根據(jù)權(quán)利1要求的新疆雪蓮的HPLC指紋圖譜，其特征在于，經(jīng)LC-MS分析并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，將乙酸乙酯提取部位的峰4、9、10、11、12、16、18分別指認(rèn)為東莨菪素、蘆丁、異槲皮苷、忍冬苷、斛皮苷、高車(chē)前素和粗毛豚草素；將正丁醇提取部位的峰2、3、10分別指認(rèn)為佛手內(nèi)酯、東莨菪素和蘆丁。4、根據(jù)權(quán)利1要求的新疆雪蓮的HPLC指紋圖譜，其特征在于，該圖譜的建立包括以下步驟1)樣品的制備雪蓮樣品粉碎后過(guò)40目篩，精密稱取，置圓底燒瓶中用70%乙醇浸泡，搖床過(guò)夜，超聲細(xì)胞粉碎機(jī)提取，離心，上清液減壓濃縮后，懸浮于水中，用等體積石油醚萃取2-3次，回收廢液，水層以乙酸乙酯萃取l-2次，乙酸乙酯層濃縮至干，甲醇定容，水層再用正丁醇萃取l-2次，合并后濃縮至干，甲醇定容，用0.20/xm有機(jī)相針式濾器過(guò)濾后取濾液進(jìn)行色譜分析。2)色譜條件島津VP-ODS色譜柱，乙腈-0.1%的乙酸梯度洗脫，梯度條件0mm-20min-40mhi-60min;乙腈濃度5%-30%-30%-100%，二元梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)270nm，柱溫30'C，流速1.0mL/min。3)測(cè)定分別精密吸取乙酸乙酯層和正丁醇層供試品溶液各5uL分別進(jìn)樣分析，記錄時(shí)間為60min。4)LC-MS分析。5、根據(jù)權(quán)利1要求的新疆雪蓮的DNA指紋圖譜建立方法，其特征在于，該圖譜為由'T，和"O"組成的句子以陣列形式表現(xiàn)出來(lái)，所述數(shù)字"l"表示圖譜中某個(gè)位置上有擴(kuò)增帶存在，數(shù)字"O"表示在某個(gè)位置上沒(méi)有擴(kuò)增條帶存在。6、根據(jù)權(quán)利1要求的新疆雪蓮的DNA指紋圖譜建立方法，其特征在于，按如下步驟操作1)新疆雪蓮DNA的提取及純化；2)用獲得的高純度新疆雪蓮DNA為模板進(jìn)行RAPD和ISSR分析；3)選擇有代表性的多態(tài)性RAPD和ISSR擴(kuò)增條帶，根據(jù)所選擇條帶的有、無(wú)構(gòu)建供試材料DNA指紋圖譜。全文摘要本發(fā)明涉及新疆雪蓮的HPLC指紋圖譜以及DNA指紋圖譜的建立方法，其特征是HPLC指紋圖譜包括乙酸乙酯、正丁醇兩個(gè)不同極性提取部位的指紋圖譜，乙酸乙酯提取部位的指紋圖譜標(biāo)示出20個(gè)共有峰，其中7個(gè)峰分別指認(rèn)為東莨菪素、蘆丁、異槲皮苷、忍冬苷、斛皮苷、高車(chē)前素和粗毛豚草素，正丁醇提取部位的指紋圖譜標(biāo)示出11個(gè)共有峰，其中3個(gè)峰分別指認(rèn)為佛手內(nèi)酯、東莨菪素和蘆??；DNA指紋圖譜由RAPD和ISSR兩種分子指紋圖譜組成，HPLC指紋與DNA指紋相結(jié)合能從化學(xué)和生物學(xué)角度對(duì)新疆雪蓮優(yōu)劣、真?zhèn)芜M(jìn)行全面、有效的檢測(cè)。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101418348SQ20081023917公開(kāi)日2009年4月29日申請(qǐng)日期2008年12月11日優(yōu)先權(quán)日2008年12月11日發(fā)明者戴卓昊,元?dú)W,王曉東,王美玲,袁曉凡,兵趙申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院過(guò)程工程研究所