胃癌脾虛證唾液蛋白指紋圖譜分子診斷模型建立方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種胃癌脾虛證唾液蛋白指紋圖譜分子診斷模型建立方法，包括以下步驟：樣品收集；納米磁珠預(yù)處理；樣品預(yù)處理；唾液樣品洗脫上樣；質(zhì)譜分析；數(shù)據(jù)采集；數(shù)據(jù)分析；建立診斷模型。本發(fā)明運(yùn)用WCX與MALDI?TOF?MS蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，基于唾液蛋白質(zhì)組開(kāi)展胃癌脾虛證病證結(jié)合分子診斷研究，發(fā)現(xiàn)胃癌脾虛證與非脾虛證比較，有6個(gè)差異蛋白峰具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。胃癌脾虛證與正常對(duì)照組對(duì)比，共有106個(gè)差異蛋白質(zhì)峰有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中有101個(gè)蛋白峰差異具有非常顯著性意義，其中，26個(gè)質(zhì)峰在脾虛證組表達(dá)下調(diào)，80個(gè)質(zhì)峰在脾虛證組表達(dá)上調(diào)。
【專利說(shuō)明】
胃癌脾虛證唾液蛋白指紋圖譜分子診斷模型建立方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)譜應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種胃癌脾虛證唾液蛋白指 紋圖譜分子診斷模型建立方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 胃癌為本虛標(biāo)實(shí)之證，以痰凝、氣滯、血瘀、邪熱為標(biāo)，脾虛為本]。脾胃虛弱是胃癌 發(fā)生、發(fā)展的基礎(chǔ)，存在于胃癌前疾病-癌前病變-胃癌的整個(gè)過(guò)程。脾虛失運(yùn)可致痰飲內(nèi) 生，痰濕交阻易在局部結(jié)聚形成腫塊，且痰飲隨氣流行，機(jī)體內(nèi)外無(wú)所不至，以致腫瘤易于 復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移。江澄等對(duì)500例胃癌患者進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果顯示胃癌手術(shù)前后單一證型以胃癌所 占的比率最多。趙群等根據(jù)中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)，將102例患者分為胃癌無(wú)脾虛證和有脾虛證兩 組，分析統(tǒng)計(jì)脾虛證的有無(wú)與胃癌浸潤(rùn)深度、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及ΡΩ#分期等生物學(xué) 行為的關(guān)系，結(jié)果顯示胃癌患者脾虛證與其臨床生物學(xué)行為之間有密切的關(guān)系，脾虛證患 者的預(yù)后比非脾虛證患者差。
[0003] 病證結(jié)合已經(jīng)成為現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合臨床的主要模式。鑒于不同疾病的特征性病理 實(shí)質(zhì)不同，開(kāi)展病證結(jié)合的證候診斷客觀化研究是十分必要的。脾虛是中醫(yī)臨床最常見(jiàn)的 基本證候之一，也是胃癌的重要病機(jī)和常見(jiàn)證候。
[0004] 唾液檢測(cè)的應(yīng)用已廣泛應(yīng)用于感染性疾病、內(nèi)分泌疾病等各系統(tǒng)疾病的研究，尤 其是在各系統(tǒng)腫瘤診斷、病情變化監(jiān)測(cè)、臨床分期、療效監(jiān)測(cè)等方面具有巨大的應(yīng)用前景。 唾液中含有大量蛋白質(zhì)，而蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的執(zhí)行者和體現(xiàn)者，因而不同的疾病有蛋白 質(zhì)組學(xué)水平上的差異。已有研究證明，唾液中含有HP(HP感染是胃炎、胃癌的重要病因 ）、HP 抗體IgG、硫酸還原菌（SRP)、KYNA(具有抗結(jié)腸癌作用）等180種生物標(biāo)志物。質(zhì)譜蛋白質(zhì)組 學(xué)技術(shù)的發(fā)展促進(jìn)了唾液生物標(biāo)志物的探索進(jìn)程。
[0005] 目前MALDI-T0F蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已較多應(yīng)用于胃癌的病因、診斷、治療、預(yù)后以及 是否發(fā)生轉(zhuǎn)移的判斷等多方面的研究。Ding Y發(fā)現(xiàn)胃上皮AGS細(xì)胞癌變與EBV病毒感染有 關(guān);Oya-Ito T通過(guò)該技術(shù)發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白27的翻譯后修飾在胃腸腫瘤上皮細(xì)胞損傷的過(guò) 程中發(fā)揮著重要的作用;Repetto 0等發(fā)現(xiàn)胃癌與自身免疫性胃炎存在27個(gè)差異蛋白點(diǎn)；南 蛇藤可使胃癌患者HSP蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，而過(guò)度表達(dá)的HSP蛋白也可降低南蛇藤的療效； Bal Iuf f B等研究發(fā)現(xiàn)HNP-I、S100-A6可進(jìn)一步用來(lái)區(qū)分早期胃癌（UICC-I)和晚期胃癌 (UICC-II和III)，而CRIPl則為一個(gè)新型、有效且獨(dú)立的腫瘤預(yù)后因子。ZhangF等發(fā)現(xiàn) TRAKl/MGb2-Ag可作為診斷胃印戒細(xì)胞癌和粘液腺癌的生物標(biāo)志物。與親代細(xì)胞系相比，順 鉑耐藥細(xì)胞系，PK_M2(丙酮酸激酶-M2)蛋白表達(dá)和活性水平均降低，而使用反義寡核苷酸 抑制PK-M2表達(dá)可進(jìn)一步增加細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性。PAR-I-直參與胃腸道炎癥、腫瘤細(xì)胞 生長(zhǎng)和胃癌細(xì)胞的入侵，據(jù)研究，在華裔受試者中，PAR-IIVSn-HT等位基因的表達(dá)是發(fā)生 幽門(mén)螺旋桿菌相關(guān)型胃癌的風(fēng)險(xiǎn)因素之一，而PAR-1-506ins/del基因的多態(tài)性則沒(méi)有參與 胃癌過(guò)程。胃癌患者胃癌組著和血衆(zhòng)中的AGP(alpha-l_acid glycoprotein)水平均表達(dá)增 高。胃癌患者15-PGDH與C0X-2表達(dá)承負(fù)相關(guān)，并與胃癌的??Μ分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。胃 癌組織中CLICl過(guò)度表達(dá)，實(shí)驗(yàn)證明，胃癌患者體內(nèi)CLICl低表達(dá)者5年生存率明顯高于高表 達(dá)者，因而CLICl可作為判斷胃癌預(yù)后的重要分子。胃癌存在β-cat異常表達(dá)，檢測(cè)β-cat的 表達(dá)可作為判斷胃癌分化、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移和預(yù)后的良好參考指標(biāo)。環(huán)氧化酶-2(C0X-2)和基質(zhì) 金屬蛋白酶-9(MMP_9)表達(dá)與胃癌的生物學(xué)行為密切相關(guān)。可作為反映胃癌浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移和預(yù) 后的重要指標(biāo)。
[0006] 因此，提供一種診斷模型簡(jiǎn)便、快速、標(biāo)本用量少，靈敏度高，特異性好的胃癌脾虛 證唾液蛋白指紋圖譜分子診斷模型的建立方法，就成為該技術(shù)領(lǐng)域急需解決的技術(shù)難題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 有鑒于此，本發(fā)明所要解決現(xiàn)有方法對(duì)于胃癌脾虛證的診斷復(fù)雜，診斷時(shí)間長(zhǎng)， 靈敏度低，特異性差的問(wèn)題，提供了一種胃癌脾虛證唾液蛋白指紋圖譜分子診斷模型建立 方法。
[0008] 為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明公開(kāi)了一種胃癌脾虛證唾液蛋白指紋圖譜分子診 斷模型建立方法，包括以下步驟：
[0009] (1)樣品收集；
[0010] (2)納米磁珠預(yù)處理；
[0011] (3)樣品預(yù)處理:取出冷凍保存的唾液樣品，冰上解凍，所有唾液樣品均1次凍融， 取5μ1唾液樣品加入?ομL的U9裂解液，混合孵育30min后，加入185μ1的Wash Buffer稀釋（唾 液最終上樣量為2.5μ1);
[0012] (4)唾液樣品洗脫上樣:③向每個(gè)裝有納米磁珠的PCR管中分別加入100μΙ預(yù)處理 后的唾液樣品，混勻，置于室溫孵育30min，將所述PCR管置于磁鐵上孵育lmin，去除上清液； ④每管加入100μΙ的Wash Buffer洗脫5min，然后將所述PCR管置于磁鐵上孵育Imin，去除上 清液;再重復(fù)步驟④操作一次，以洗脫更干凈，獲得較純的目的蛋白；⑤在所述PCR管中加入 10μ1的Elution Buffer洗脫5min，將所述PCR管置于磁鐵上孵育lmin，取5μ1上清液移至另 一個(gè)PCR管中；⑥將裝有5μ1上清液的PCR管中加入5μ1的CHCA飽和溶液，充分混勻，至樣品顏 色發(fā)灰，而沒(méi)有明顯的沉淀時(shí)，取2μ1混合溶液，加樣到Au/Steel芯片上，晾干后放入儀器讀 ?。?br>[0013] (5)質(zhì)譜分析:采用質(zhì)譜儀讀取所述Au/Steel芯片信息，設(shè)置激光強(qiáng)度為190,靈敏 度為5;
[0014] (6)數(shù)據(jù)采集；
[0015] (7)數(shù)據(jù)分析；
[0016] (8)建立診斷模型：用Biomarker Pattern Software 5.0.2采用決策樹(shù)算法計(jì)算 出多個(gè)變量變化對(duì)兩樣本的判別價(jià)值，確定最佳的診斷模型。
[0017] 進(jìn)一步的，所述步驟（1)樣品收集的方法為：胃癌脾虛證組和正常對(duì)照組在取材前 一天晚上臨睡前清水漱口，之后不再進(jìn)食任何食物和藥物，于第二天晨起后漱口前采用非 刺激性唾液采集方式空腹取材，前5min內(nèi)的唾液自然吞下后開(kāi)始收集，收集到的唾液置于 冰浴中的15ml唾液離心管內(nèi)，4°C下靜置Ih后，3000r/min、4°C下離心10min，冰浴上分裝在 Iml的EP管中，每管200μ1，于-80 °C冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?br>[0018] 進(jìn)一步的，所述步驟(2)納米磁珠預(yù)處理的方法為:①取WCX納米磁珠50μ1加入到 200μ1的PCR管中，置于磁鐵上孵育Imin，去除上清液;②再加入100μΙ的Wash Buffer洗脫 5min，在磁鐵上孵育Imin，去除上清液;再重復(fù)步驟②操作一次，這樣洗脫更干凈，質(zhì)譜檢測(cè) 受到干擾的可能性會(huì)更少。
[0019] 進(jìn)一步的，所述步驟(6)數(shù)據(jù)采集的方法為：用Ciphergen Proteinchip Software 3.2.1軟件采集數(shù)據(jù)，縱坐標(biāo)為峰強(qiáng)度，橫坐標(biāo)為蛋白質(zhì)質(zhì)荷比，收集數(shù)據(jù)的質(zhì)荷比范圍為 2000~25000m/z，信號(hào)收集位置40~60,平均每點(diǎn)收集20次，收集總點(diǎn)為100次，已知多肽標(biāo) 準(zhǔn)芯片標(biāo)準(zhǔn)，激光離子流0.5。
[0020] 進(jìn)一步的，所述步驟（7)數(shù)據(jù)分析的方法為：對(duì)位于2000~25000m/z峰值，用 Biomarker Wizard軟件過(guò)濾噪音;設(shè)置初始的噪音過(guò)濾值為5，二次信噪比為2，以10%為最 小閾值進(jìn)行聚類，經(jīng)上述數(shù)據(jù)預(yù)處理后，采用t檢驗(yàn)比較所述胃癌脾虛證組和所述正常對(duì)照 組唾液蛋白質(zhì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，找出所述胃癌脾虛證組和所述正常對(duì)照組之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的 差異表達(dá)蛋白質(zhì)峰。
[0021] 進(jìn)一步的，步驟(7)中，設(shè)置P<0.01，所述胃癌脾虛證組和所述正常對(duì)照組之間具 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異表達(dá)蛋白質(zhì)峰有101個(gè)(P<〇.01)，其中所述胃癌脾虛證與所述正常對(duì) 照組比值比率>4的有17個(gè)差異蛋白，其中，有4個(gè)蛋白質(zhì)峰在所述胃癌脾虛證組表達(dá)下調(diào)， 13個(gè)蛋白質(zhì)峰在所述胃癌脾虛證組表達(dá)上調(diào)，所述17個(gè)差異蛋白具體如下：

[0024] 進(jìn)一步的，步驟(6)所述荷質(zhì)比范圍為2000~15000m/z。
[0025] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明可以獲得包括以下技術(shù)效果：
[0026] 1)本發(fā)明運(yùn)用WCX與MALDI-T0F-MS蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，基于唾液蛋白質(zhì)組開(kāi)展胃癌 脾虛證病證結(jié)合分子診斷研究，發(fā)現(xiàn)胃癌脾虛證與非脾虛證比較，有6個(gè)差異蛋白峰具有統(tǒng) 計(jì)學(xué)意義(P<〇.〇5)，其中有2個(gè)差異蛋白峰(m/z分別為5439.67、5380.16)具有非常顯著意 義（P<0 · 01)。經(jīng)Biomarker Patterns 5 · 0 · 2診斷模型軟件篩選出m/z為5439 · 67、2411 ·67、 3619.18等3個(gè)差異蛋白質(zhì)峰建立胃癌脾虛證與正常對(duì)照組的診斷判別模型。經(jīng)臨床回代檢 驗(yàn)，該模型的靈敏度和特異度分別達(dá)100% (40/40)和93% (42/45);通過(guò)交叉驗(yàn)證法進(jìn)一步 驗(yàn)證診斷模型的可靠性，結(jié)果該模型的靈敏度和特異度分別為87% (35/40)和89% (40/ 45)。說(shuō)明該模型對(duì)胃癌脾虛證的診斷效率優(yōu)良，靈敏度高、特異性強(qiáng)。
[0027] 2)本發(fā)明的研究結(jié)果已顯示出良好的應(yīng)用前景，值得進(jìn)一步深入研究并在臨床推 廣轉(zhuǎn)化。
[0028] 當(dāng)然，實(shí)施本發(fā)明的任一產(chǎn)品必不一定需要同時(shí)達(dá)到以上所述的所有技術(shù)效果。
【附圖說(shuō)明】
[0029] 此處所說(shuō)明的附圖用來(lái)提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，構(gòu)成本發(fā)明的一部分，本發(fā) 明的示意性實(shí)施例及其說(shuō)明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的不當(dāng)限定。在附圖中：
[0030] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例中胃癌脾虛證組與正常對(duì)照組蛋白質(zhì)代表性圖譜；
[0031] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例中胃癌脾虛證組與胃癌非脾虛證組蛋白質(zhì)代表性圖譜；
[0032] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例中胃癌脾虛證組與正常對(duì)照組中放大后的蛋白質(zhì)峰m / z = 3255的質(zhì)譜峰圖；
[0033]圖4為本發(fā)明實(shí)施例中胃癌脾虛證組與正常對(duì)照組中放大后的蛋白質(zhì)峰m/z = 5439的質(zhì)譜峰圖；
[0034]圖5為本發(fā)明實(shí)施例中胃癌脾虛證組與正常對(duì)照組唾液無(wú)創(chuàng)分子診斷模型樹(shù)狀 圖；
[0035]圖6為本發(fā)明實(shí)施例中診斷模型十字交叉驗(yàn)證的ROC曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0036]以下將配合附圖及實(shí)施例來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方式，藉此對(duì)本發(fā)明如何應(yīng)用 技術(shù)手段來(lái)解決技術(shù)問(wèn)題并達(dá)成技術(shù)功效的實(shí)現(xiàn)過(guò)程能充分理解并據(jù)以實(shí)施。
[0037] 實(shí)施例
[0038] 1病例選擇
[0039] 1.1診斷標(biāo)準(zhǔn)
[0040] 1.1.1胃癌診斷標(biāo)準(zhǔn)
[0041 ]胃癌的診斷根據(jù)《內(nèi)科學(xué)》的診斷標(biāo)準(zhǔn)。
[0042] 1.1.2脾虛證診斷標(biāo)準(zhǔn)
[0043] (1)脾虛證:脾虛證包括脾虛與氣虛兩部分：
[0044] 氣虛主癥:①體倦乏力；②神疲懶言；③舌質(zhì)淡、舌體胖或有齒痕，苔薄白；④脈細(xì) 弱。
[0045] 脾虛主癥:①胃納減少或食欲差;②大便不正常(溏、爛、先硬后溏、時(shí)溏時(shí)硬）；③ 食后腹脹，午后腹脹。
[0046] 脾虛次癥：口淡不渴，喜熱飲，口泛清涎，腹痛綿綿或喜按喜溫，或得食則減，或遇 勞則發(fā)，惡心嘔吐，脘悶?zāi)c鳴，消瘦或虛胖，面色萎黃，唇淡，短氣，浮腫，久嗽，痰多清稀，失 眠不寐，排便無(wú)力，白帶清稀，小便清長(zhǎng)。
[0047] 氣虛主癥2個(gè)+脾虛主癥2個(gè)，或氣虛主癥舌象+脾虛主癥2個(gè)，或氣虛主癥舌象+脾 虛1個(gè)加次癥2個(gè)，即可診斷為脾虛證。
[0048] (2)非脾虛證：胃癌患者不符合上述脾虛證的診斷，均為胃癌非脾虛證。
[0049] 1.2納入標(biāo)準(zhǔn)
[0050] (1)符合診斷標(biāo)準(zhǔn)，未經(jīng)手術(shù)和放化療；
[0051 ] (2)年齡在20-75歲之間；
[0052] (3)自愿且能夠配合參加的受試對(duì)象。
[0053]以上3項(xiàng)必須全部符合才能納入。
[0054] 1.3排除標(biāo)準(zhǔn)
[0055] (1)不符合上述診斷標(biāo)準(zhǔn)者；
[0056] (2)年齡 <20 或 >75 歲者；
[0057] (3)患有口腔局部及唾液腺的炎癥、消化道潰瘍、腫瘤及先天性疾??；患有舍格倫 綜合征、囊性纖維病;患有其他系統(tǒng)嚴(yán)重并發(fā)疾病。
[0058] h 4質(zhì)量控制
[0059] (1)采用統(tǒng)一診斷標(biāo)準(zhǔn)、統(tǒng)一調(diào)查表格、統(tǒng)一調(diào)查方法；
[0060] (2)調(diào)查者在調(diào)查時(shí)嚴(yán)格按照"標(biāo)準(zhǔn)化"執(zhí)行，減少調(diào)查者偏倚，確保資料的一致性 和真實(shí)性；
[0061] (3)電子胃鏡及病理結(jié)果均由1月內(nèi)三級(jí)甲等醫(yī)院診斷。
[0062] 2納入病例基本資料
[0063]本研究共納入2014年12月-2015年04月在湖南省腫瘤醫(yī)院胃十二指腸胰腺外科胃 癌脾虛證患者40例，男25例、女15例；胃癌非脾虛證患者17例，均為術(shù)前未進(jìn)行放化療，男14 例、女3例;年齡36-68歲，中位年齡52歲；正常對(duì)照組45例，男28例、女17例;年齡23-72歲，中 位年齡52歲，均來(lái)自于湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院體檢科健康自愿者。所有病例均按照 納入標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行納入。
[0064] 3研究分組
[0065] 40例未進(jìn)行任何治療的胃癌脾虛證患者為胃癌脾虛證組(A組），17例未進(jìn)行任何 治療的胃癌脾虛證患者為胃癌非脾虛證組(B組），45例健康志愿者為正常對(duì)照組(N組）。 [0066] 4實(shí)驗(yàn)方法
[0067] 4.1主要儀器和試劑
[0068] 蛋白指紋圖譜（液體芯片）試劑盒(WCX磁珠、Wash Buffer、Elution Buffer、U9裂 解液)及MALDI-TIF-MS(蛋白指紋圖譜儀I型），均為湖州賽爾迪生物醫(yī)藥科技有限公司產(chǎn) 品，試劑盒批號(hào)為K20150501; dH20(HPLC級(jí)）、CHCA為Sigma公司產(chǎn)品。
[0069] 4.2樣品收集
[0070]按照本課題專用臨床觀察表進(jìn)行臨床觀察記錄。取材前一天晚上臨睡前清水漱口 三次(不再進(jìn)任何食物和藥物），采用非刺激性唾液采集方式，第二天晨起后漱口前空腹取 材。由經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的課題組專人取材，前5min內(nèi)的唾液自然吞下后開(kāi)始收集，患者將已經(jīng)過(guò)消 毒的無(wú)菌小圓柱形棉花含入口中，口腔唾液積聚至一定量后，將該棉花吐入置于冰浴中的 15ml唾液離心管內(nèi)，4°C下靜置Ih后，3000r/min、4°C下離心10min，冰浴上分裝在Iml的EP管 中，每管200μ1，于-80°C冰箱冷凍保存。實(shí)驗(yàn)時(shí)取出樣本，冰上解凍，所有檢測(cè)唾液樣本均1 次凍融。取5μ1唾液加入10μ1的U9裂解液，混合孵育30min后，加入185μ1的Wash Buffer稀釋 (唾液最終上樣量為2· 5μ1)。
[0071] 4.3納米磁珠預(yù)處理
[0072] ①取WCX納米磁珠50μ1加入到200μ1的PCR管，置于磁鐵上孵育lmin(注意避免由于 孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致磁珠結(jié)塊），去除上清液;②再依次加入IOOyl的Wash Buffer洗脫5min， 在磁鐵上孵育Imin，去除上清液;再重復(fù)步驟②操作一次。
[0073] 4.4唾液樣品洗脫上樣
[0074]①向每個(gè)裝有納米磁珠的PCR管中加入100μΙ處理好的唾液樣品，混勻后，置于室 溫孵育30min，將PCR管置于磁鐵上孵育Imin，去除上清液;②每管加入100μΙ的Wash Buffer 洗脫5min，然后將PCR管置于磁鐵上孵育lmin，去除上清液;再重復(fù)步驟②操作一次。③在 PCR管中加入10μ1的Elution Buffer洗脫5min(不能少于5min)，將PCR管置于磁鐵上孵育 lmin，取5μ1上清液移至另一個(gè)PCR管中；④裝有5μ1上清液的PCR管中加入5μ1的CHCA(基質(zhì)） 飽和溶液，充分混勻（混合到樣品顏色發(fā)灰，而沒(méi)有明顯的沉淀并及時(shí)上樣），取2μ1混合溶 液(ΙμL唾液樣品+ΙμL基質(zhì)）加樣到Au/Steel芯片上，待干后放入儀器讀取。
[0075] 4.5芯片檢測(cè)、數(shù)據(jù)采集和參數(shù)設(shè)置
[0076] 采用蛋白指紋圖譜儀I型(湖州賽爾迪生物醫(yī)藥科技有限公司）質(zhì)譜儀讀取芯片信 息。設(shè)置激光強(qiáng)度為190，靈敏度為5，收集數(shù)據(jù)的質(zhì)荷比(m/z)范圍為2000~25000m/z，優(yōu)化 范圍為2000~15000m/z，信號(hào)收集位置40~60,平均每點(diǎn)收集20次，收集總點(diǎn)為100次。已知 多肽標(biāo)準(zhǔn)芯片標(biāo)準(zhǔn)（all-in-one)，激光離子流0 · 5。用Ciphergen Proteinchip Software 3.2.1軟件自動(dòng)采集數(shù)據(jù)，縱坐標(biāo)為峰強(qiáng)度(蛋白相對(duì)含量），橫坐標(biāo)為蛋白質(zhì)質(zhì)荷比(m/z)。
[0077] 4.6數(shù)據(jù)分析
[0078] 對(duì)位于2000~25000m/z峰值，用Biomarker Wizard軟件過(guò)濾噪音。設(shè)置初始的噪 音過(guò)濾值為5,二次信噪比為2,以10%為最小閾值進(jìn)行聚類，經(jīng)上述數(shù)據(jù)預(yù)處理后，采用t檢 驗(yàn)比較2組唾液蛋白質(zhì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)（由Biomarker Wizard軟件完成），找出2組之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué) 意義的差異表達(dá)蛋白質(zhì)峰。用Biomarker Pattern Software 5.0.2采用決策樹(shù)算法計(jì)算出 多個(gè)變量(m/z蛋白質(zhì)質(zhì)譜峰)變化對(duì)兩樣本的判別價(jià)值(診斷貢獻(xiàn)度），確定最優(yōu)化的診斷 模型。
[0079] 5 結(jié)果
[0080] 5.1胃癌脾虛證組與正常對(duì)照組對(duì)比
[0081 ] 兩組共85份唾液標(biāo)本，經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化后，在相對(duì)分子質(zhì)量為2000~25000Da范圍內(nèi)共 檢測(cè)到375個(gè)蛋白質(zhì)峰，兩組間比較，符合m/z強(qiáng)度平均值的比值>2(脾虛證/正常對(duì)照組> 2,或者正常對(duì)照組/脾虛證>2)的條件，共有106個(gè)差異蛋白質(zhì)峰有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)， 其中有101個(gè)蛋白峰差異具有非常顯著性意義（P<0.01)(胃癌脾虛證與正常對(duì)照組之間 ratio>4差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的蛋白質(zhì)峰，見(jiàn)表1)，（胃癌脾虛證及正常對(duì)照組典型圖譜，圖 1)。其中，26個(gè)質(zhì)峰在脾虛證組表達(dá)下調(diào)，80個(gè)質(zhì)峰在脾虛證組表達(dá)上調(diào)。
[0082]表1胃癌與正常對(duì)照組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的蛋白質(zhì)峰(ratio>4)

[0085]圖1為胃癌脾虛證組與正常對(duì)照組典型圖譜，上第1、2幅圖為胃癌脾虛證組，下第 3、4幅圖為正常對(duì)照組。胃癌脾虛證組質(zhì)峰范圍主要在1000-4500Da，正常對(duì)照組質(zhì)峰范圍 主要在1000-5000Da?？v坐標(biāo)為峰強(qiáng)度(蛋白相對(duì)含量），橫坐標(biāo)為蛋白質(zhì)質(zhì)荷比(m/z)。 [0086] 圖3為胃癌與正常對(duì)照組MALDI質(zhì)譜峰圖(m/z = 3255 )，縱坐標(biāo)為峰強(qiáng)度(蛋白相對(duì) 含量），橫坐標(biāo)為蛋白質(zhì)質(zhì)荷比(m/z)。上第1、2幅圖為胃癌脾虛證組，下第3、4幅圖為正常對(duì) 照組。與正常對(duì)照組對(duì)比，胃癌脾虛證組表達(dá)下調(diào)。
[0087] 5.2胃癌脾虛證組與胃癌非脾虛證組對(duì)比
[0088] 兩組共57份唾液標(biāo)本，經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化后，在相對(duì)分子質(zhì)量為2000~25000m/z范圍內(nèi) 共檢測(cè)到375個(gè)蛋白質(zhì)峰，質(zhì)峰多集中在0~15000m/z之間（胃癌脾虛證及胃癌非脾虛證典 型圖譜，圖2)。滿足P<0.05,且兩組m/z強(qiáng)度平均值得比值>2(脾虛證/非脾虛證>2,或者 非脾虛證/脾虛證>2)的條件，兩組間比較，共有6個(gè)差異蛋白質(zhì)峰（3225.359、2493.291、 5380.163、5306.461、5355.632、5439.673)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Ρ<0· 05)，共有2個(gè)蛋白峰 (5380.163、5439.673)(圖3、圖4)差異具有非常顯著性意義（Ρ<0.01)(表2)。其中， 3225.359、2493.291兩個(gè)質(zhì)譜峰在脾虛證組表達(dá)下調(diào)，而5380.163、5306.461、5355.632、 5439.673在脾虛證組表達(dá)上調(diào)。
[0089]表2癌脾虛證組與胃癌非脾虛證組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的蛋白質(zhì)峰(ratio>2)
[0091]圖2為胃癌脾虛證組與胃癌非脾虛證組典型圖譜，上第1、2幅圖為胃癌脾虛證組， 下第3、4幅圖為正常對(duì)照組。胃癌脾虛證組質(zhì)峰范圍主要在0-40000Da，正常對(duì)照組質(zhì)峰范 圍主要在0_30000Da?？v坐標(biāo)為峰強(qiáng)度(蛋白相對(duì)含量），橫坐標(biāo)為蛋白質(zhì)質(zhì)荷比(m/z)。 [0092] 圖4為胃癌與正常對(duì)照組MALDI質(zhì)譜峰圖（m/z = 5439)上第1、2幅圖為胃癌脾虛證 組，下第3、4幅圖為正常對(duì)照組。與正常對(duì)照組對(duì)比，胃癌脾虛證組表達(dá)上調(diào)。縱坐標(biāo)為峰強(qiáng) 度(蛋白相對(duì)含量），橫坐標(biāo)為蛋白質(zhì)質(zhì)荷比(m/z)。
[0093] 5.3胃癌脾虛證分子診斷模型建立
[0094] 用Biomarker Pattern Software 5.0.2米用決策樹(shù)算法計(jì)算出多個(gè)變量(m/z蛋 白質(zhì)質(zhì)譜峰)變化對(duì)兩組樣本的判別價(jià)值(診斷貢獻(xiàn)度），最終選定m/z為5439.67、2411.67、 3619.18建立胃癌脾虛證唾液無(wú)創(chuàng)分子診斷模型（圖5)，經(jīng)臨床回代檢驗(yàn)，該模型的靈敏度 和特異度分別為100 % (40/40)和93 % (42/45)(見(jiàn)表3)。
[0095] 弄3所律詮斷樽型對(duì)g癌胞慮證的詮斷效鑾0你床冋代拾3合結(jié)里）
LUU7/」 團(tuán)07^111/^1 - 0/±0?.0/、2/±丄丄.0//|^00丄》.丄00，0'「:111有左開(kāi)'蟲(chóng)|=| 11|軍姐；3乂口、」冃；1街胖膽^： 診斷模型。當(dāng) 5439.67m/z>l .72,或者 5439.67m/z < 1.72 且 2411.67m/z>4.15,或者 5439 · 67m/z < 1 · 72且2411 · 67m/z < 4 · 15且3619 · 18m/z>9 · 02提示為早期胃癌脾虛證患者； 當(dāng)5439 · 67m/z < 1 · 72且2411 · 67m/z < 4 · 15且3619 · 18m/z < 9 · 02提示為正常。M:質(zhì)譜峰相對(duì) 強(qiáng)度。
[0098] 5.4診斷模型十字交叉驗(yàn)證
[0099]對(duì)所建立的胃癌脾虛證診斷模型采用十字交叉法進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果該模型的靈敏度 和特異度分別87 % (35/40)和89 % (40/45)(表4)。
[0100]表4所建診斷模型對(duì)胃癌脾虛證的診斷效率(十字交叉驗(yàn)證結(jié)果）
[0102] 圖6為診斷模型十字交叉驗(yàn)證的ROC曲線，軸坐標(biāo)為假陽(yáng)性率（1-特異度），縱坐標(biāo) 為真陽(yáng)性率（靈敏度KROC曲線下面積越大，其診斷價(jià)值越高。圖6中ROC曲線下面積為 0.976，進(jìn)一步地驗(yàn)證所建立模型的診斷價(jià)值。
[0103] 病證結(jié)合已經(jīng)成為現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合臨床的主要模式。鑒于不同疾病的特征性病理 實(shí)質(zhì)不同，開(kāi)展病證結(jié)合的證候診斷客觀化研究是十分必要的。脾虛是中醫(yī)臨床最常見(jiàn)的 基本證候之一，也是胃癌的重要病機(jī)和常見(jiàn)證候。本發(fā)明運(yùn)用WCX與MALDI-T0F-MS蛋白質(zhì)組 學(xué)技術(shù)，基于唾液蛋白質(zhì)組開(kāi)展胃癌脾虛證病證結(jié)合分子診斷研究，發(fā)現(xiàn)胃癌脾虛證與非 脾虛證比較，有6個(gè)差異蛋白峰具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中有2個(gè)差異蛋白峰(m/z分 別為5439·67、5380.16)具有非常顯著意義（Ρ<0·01)。經(jīng)Biomarker Patterns 5.0.2診斷 模型軟件篩選出m/z為5439.67、2411.67、3619.18等3個(gè)差異蛋白質(zhì)峰建立胃癌脾虛證與正 常對(duì)照組的診斷判別模型。經(jīng)臨床回代檢驗(yàn)，該模型的靈敏度和特異度分別達(dá)100% (40/ 40)和93% (42/45);通過(guò)交叉驗(yàn)證法進(jìn)一步驗(yàn)證診斷模型的可靠性，結(jié)果該模型的靈敏度 和特異度分別為87% (35/40)和89% (40/45)。說(shuō)明該模型對(duì)胃癌脾虛證的診斷效率優(yōu)良， 靈敏度高、特異性強(qiáng)。
[0104] 如在說(shuō)明書(shū)及權(quán)利要求當(dāng)中使用了某些詞匯來(lái)指稱特定成分或方法。本領(lǐng)域技術(shù) 人員應(yīng)可理解，不同地區(qū)可能會(huì)用不同名詞來(lái)稱呼同一個(gè)成分。本說(shuō)明書(shū)及權(quán)利要求并不 以名稱的差異來(lái)作為區(qū)分成分的方式。如在通篇說(shuō)明書(shū)及權(quán)利要求當(dāng)中所提及的"包含"為 一開(kāi)放式用語(yǔ)，故應(yīng)解釋成"包含但不限定于"。"大致"是指在可接收的誤差范圍內(nèi)，本領(lǐng)域 技術(shù)人員能夠在一定誤差范圍內(nèi)解決所述技術(shù)問(wèn)題，基本達(dá)到所述技術(shù)效果。說(shuō)明書(shū)后續(xù) 描述為實(shí)施本發(fā)明的較佳實(shí)施方式，然所述描述乃以說(shuō)明本發(fā)明的一般原則為目的，并非 用以限定本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的保護(hù)范圍當(dāng)視所附權(quán)利要求所界定者為準(zhǔn)。
[0105] 還需要說(shuō)明的是，術(shù)語(yǔ)"包括"、"包含"或者其任何其他變體意在涵蓋非排他性的 包含，從而使得包括一系列要素的商品或者系統(tǒng)不僅包括那些要素，而且還包括沒(méi)有明確 列出的其他要素，或者是還包括為這種商品或者系統(tǒng)所固有的要素。在沒(méi)有更多限制的情 況下，由語(yǔ)句"包括一個(gè)……"限定的要素，并不排除在包括所述要素的商品或者系統(tǒng)中還 存在另外的相同要素。
[0106] 上述說(shuō)明示出并描述了本發(fā)明的若干優(yōu)選實(shí)施例，但如前所述，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明 并非局限于本文所披露的形式，不應(yīng)看作是對(duì)其他實(shí)施例的排除，而可用于各種其他組合、 修改和環(huán)境，并能夠在本文所述發(fā)明構(gòu)想范圍內(nèi)，通過(guò)上述教導(dǎo)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)或知識(shí) 進(jìn)行改動(dòng)。而本領(lǐng)域人員所進(jìn)行的改動(dòng)和變化不脫離本發(fā)明的精神和范圍，則都應(yīng)在本發(fā) 明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種胃癌脾虛證唾液蛋白指紋圖譜分子診斷模型建立方法，其特征在于，包括W下 步驟： (1) 樣品收集； (2) 納米磁珠預(yù)處理； (3) 樣品預(yù)處理:取出冷凍保存的唾液樣品，冰上解凍，所有唾液樣品均1次凍融，取扣1 所述唾液品加入1〇μ1的U9裂解液，混合解育30min后，加入18化1的Wash Buffer稀釋； (4) 唾液樣品洗脫上樣:③向每個(gè)裝有納米磁珠的PCR管中分別加入10化1預(yù)處理后的 所述唾液樣品，混勻，置于室溫解育30min，將所述PCR管置于磁鐵上解育Imin，去除上清液； ④每管加入10化1的Wash Buffer洗脫5min，然后將所述PCR管置于磁鐵上解育Imin，去除上 清液;再重復(fù)步驟④操作一次;⑤在所述PCR管中加入10μ1的Elution Buffer洗脫5min，將 所述PCR管置于磁鐵上解育Imin，取扣1上清液移至另一個(gè)PCR管中；⑥將裝有扣1上清液的 PCR管中加入化1的C肥A飽和溶液，充分混勻，至樣品顏色發(fā)灰，而沒(méi)有明顯的沉淀時(shí)，取化1 混合溶液，加樣到Au/Steel忍片上，驚干后放入儀器讀?。? (5) 質(zhì)譜分析:采用質(zhì)譜儀讀取所述Au/Steel忍片信息，設(shè)置激光強(qiáng)度為190,靈敏度為 5; (6) 數(shù)據(jù)采集； (7) 數(shù)據(jù)分析； (8) 建立診斷模型：用Biomarker Pattern Software 5.0.2采用決策樹(shù)算法計(jì)算出多 個(gè)變量變化對(duì)兩樣本的判別價(jià)值，確定最佳的診斷模型。2. 如權(quán)利要求1所述的胃癌脾虛證唾液蛋白指紋圖譜分子診斷模型建立方法，其特征 在于，所述步驟（1)樣品收集的方法為：胃癌脾虛證組和正常對(duì)照組在取材前一天晚上臨睡 前清水漱口，之后不再進(jìn)食任何食物和藥物，于第二天晨起后漱口前采用非刺激性唾液采 集方式空腹取材，前5min內(nèi)的唾液自然吞下后開(kāi)始收集，收集到的唾液置于冰浴中的15ml 唾液離屯、管內(nèi)，4°C下靜置化后，300化/min、4°C下離屯、lOmin，冰浴上分裝在1ml的EP管中， 每管20化1，于-80°C冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?. 如權(quán)利要求2所述的胃癌脾虛證唾液蛋白指紋圖譜分子診斷模型建立方法，其特征 在于，所述步驟(2)納米磁珠預(yù)處理的方法為:①取WCX納米磁珠50μ1加入到20化1的PCR管 中，置于磁鐵上解育Imin，去除上清液;②再加入10化1的Wash Buffer洗脫5min，在磁鐵上 解育Imin，去除上清液;再重復(fù)步驟②操作一次。4. 如權(quán)利要求3所述的胃癌脾虛證唾液蛋白指紋圖譜分子診斷模型建立方法，其特征 在于，所述步驟(6)數(shù)據(jù)采集的方法為：用〔;[曲日巧日]1?1'〇1日;[]1證19 5〇的￥日'日3.2.1軟件采 集數(shù)據(jù)，縱坐標(biāo)為峰強(qiáng)度，橫坐標(biāo)為蛋白質(zhì)質(zhì)荷比，收集數(shù)據(jù)的質(zhì)荷比范圍為2000~ 25000m/z，信號(hào)收集位置40~60,平均每點(diǎn)收集20次，收集總點(diǎn)為100次，已知多膚標(biāo)準(zhǔn)忍片 標(biāo)準(zhǔn)，激光離子流0.5。5. 如權(quán)利要求4所述的胃癌脾虛證唾液蛋白指紋圖譜分子診斷模型建立方法，其特征在 于，所述步驟(7)數(shù)據(jù)分析的方法為:對(duì)位于2000~25000m/z峰值，用Biomarker Wizard軟件 過(guò)濾噪音;設(shè)置初始的噪音過(guò)濾值為5,二次信噪比為2, WlO%為最小闊值進(jìn)行聚類，經(jīng)上 述數(shù)據(jù)預(yù)處理后，采用t檢驗(yàn)比較所述胃癌脾虛證組和所述正常對(duì)照組唾液蛋白質(zhì)質(zhì)譜數(shù) 據(jù)，找出所述胃癌脾虛證組和所述正常對(duì)照組之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異表達(dá)蛋白質(zhì)峰。6. 如權(quán)利要求5所述的胃癌脾虛證唾液蛋白指紋圖譜分子診斷模型建立方法，其特征 在于，步驟(7)中，設(shè)置P<0.01，所述胃癌脾虛證組和所述正常對(duì)照組之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 的差異表達(dá)蛋白質(zhì)峰有101個(gè)，其中所述胃癌脾虛證與所述正常對(duì)照組比值比率>4的有17 個(gè)差異蛋白，其中，有4個(gè)蛋白質(zhì)峰在所述胃癌脾虛證組表達(dá)下調(diào)，13個(gè)蛋白質(zhì)峰在所述胃 癌脾虛證組表達(dá)上調(diào)，所述17個(gè)差異蛋白具體如下：7. 如權(quán)利要求6所述的胃癌脾虛證唾液蛋白指紋圖譜分子診斷模型建立方法，其特征 在于，步驟(6)所述荷質(zhì)比范圍為2000~15000m/z。
【文檔編號(hào)】G01N27/62GK105842327SQ201610168131
【公開(kāi)日】2016年8月10日
【申請(qǐng)日】2016年3月23日
【發(fā)明人】吳正治, 謝夢(mèng)洲, 黃飛娟, 曹美群, 孫珂煥, 賀佐梅
【申請(qǐng)人】深圳市老年醫(yī)學(xué)研究所, 吳正治