黃花列當(dāng)指紋圖譜建立方法以及質(zhì)量評(píng)價(jià)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及藥物分析領(lǐng)域，具體涉及中藥材指紋圖譜建立方法和藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 黃花列當(dāng)，又名獨(dú)根草。為列當(dāng)科列當(dāng)屬植物黃花列當(dāng)（Orobanche pycnostachya Hance)的干燥全草。分布于東北、華北、山西、陜西等地。具有補(bǔ)腎助陽(yáng)，強(qiáng)筋骨的功效，用于 治療腎虛腰膝冷痛、陽(yáng)痿遺精、神經(jīng)官能癥，小兒腹瀉等癥。民間也作為名貴藥材"沙漠人 參"肉從蓉的代用品。列當(dāng)科植物普遍含有苯乙醇苷，是苯乙醇苷類(lèi)成分的重要資源植物。 現(xiàn)代藥理研究表明該類(lèi)化合物具有良好醫(yī)療價(jià)值，如:抗菌、抗炎、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、 清除自由基、免疫調(diào)節(jié)、增強(qiáng)記憶、保肝、強(qiáng)心等作用。
[0003] 中藥指紋圖譜是目前國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的能較全面的反映藥材信息，鑒別藥材品種和評(píng) 價(jià)中藥質(zhì)量的有效手段之一，它主要是通過(guò)采用現(xiàn)代色譜及波普技術(shù)得到中藥組分群體共 有特征的圖譜或圖像。
[0004] 目前關(guān)于對(duì)列當(dāng)藥材的質(zhì)量控制未見(jiàn)較全面的報(bào)道，《中國(guó)藥典》中也未對(duì)其質(zhì)量 標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行收載。因此，建立能較全面反映列當(dāng)藥材質(zhì)量信息的方法，對(duì)于指導(dǎo)列當(dāng)藥材入 藥，加大列當(dāng)藥材開(kāi)發(fā)利用限度是非常有必要和有意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提出一種黃花列當(dāng)指紋圖譜的建立方法，包括以下步驟：
[0006] 1)供試品溶液的制備:取黃花列當(dāng)藥材粉末，加70 %甲醇，稱(chēng)定重量，浸泡，超聲處 理，用溶劑補(bǔ)足減失的重量，濾過(guò)，取續(xù)濾液以〇. 45μπι微孔濾膜濾過(guò)，備用；
[0007] 2)將供試品溶液注入高效液相色譜儀中，獲得指紋圖譜，采用的色譜條件為:色譜 柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱;流動(dòng)相：乙腈(Α)_1%〇磷酸水溶液(Β)，梯度洗脫89 %Β (Omin)~85%B(13min)~81 %B(22min)~78%B(33min)~76%B(50)min;流速：lml/min; 檢測(cè)波長(zhǎng)230~400nm;柱溫20~30°C;進(jìn)樣量5~15μ1〇
[0008] 作為優(yōu)選，色譜柱采用規(guī)格為250mmX4.6mm，5ym的島津Inertsil ODS-SP HPLC色 譜柱或者YMC-Pack 0DS-A色譜柱。
[0009] 進(jìn)一步的優(yōu)選是，步驟1)中，取黃花列當(dāng)藥材粉末0.15g，加70%甲醇25ml，稱(chēng)定重 量，浸泡lh，超聲處理40min，用溶劑補(bǔ)足減失的重量，濾過(guò)，取續(xù)濾液以0.45μπι微孔濾膜濾 過(guò)。
[0010] 更優(yōu)選地，流速為lml/min;檢測(cè)波長(zhǎng)295nm;柱溫25°C;進(jìn)樣量10μ1。
[0011]本發(fā)明還提供一種利用指紋圖譜評(píng)價(jià)黃花列當(dāng)藥材質(zhì)量的方法，包括以下步驟： 步驟一:建立標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，包括:a)分別從10批以上不同產(chǎn)地的樣品制備供試品溶液:取 黃花列當(dāng)藥材粉末，加70 %甲醇，稱(chēng)定重量，浸泡，超聲處理，用溶劑補(bǔ)足減失的重量，濾過(guò)， 取續(xù)濾液以〇 . 45μπι微孔濾膜濾過(guò)，備用；b)對(duì)照品溶液的制備：稱(chēng)取1)α-L-鼠李糖（1-3)
[β-D-葡萄糖（l-6)]-0-(4-0-咖啡酰)-D-葡萄糖咖啡酰三糖苷、2)芥子酸-4-0-?Η)葡萄糖 苷、3) 7-羥基毛蕊花糖苷、4) 7-甲氧基毛蕊花糖苷、5)毛蕊花糖苷、6)圓齒列當(dāng)苷、7)3'-甲 氧基毛蕊花糖苷）、8)2'_乙酰毛蕊花糖苷、9)異圓齒列當(dāng)苷共9種對(duì)照品，用甲醇溶解定容， 制成一定濃度的混合溶液，微孔濾膜〇. 45μπι濾過(guò)，備用;c)先后將各供試品溶液和對(duì)照品溶 液注入高效液相色譜儀中，分別獲得指紋圖譜，色譜條件為:色譜柱:十八烷基硅烷鍵合硅 膠色譜柱;流動(dòng)相：乙腈(Α)-1%。磷酸水溶液(Β)，梯度洗脫89%B(0min)~85%B(13min)~ 81%B(22min)~78%B(33min)~76%B(50)min;流速：lml/min;檢測(cè)波長(zhǎng) 230 ~400nm;柱溫 20~30°C;進(jìn)樣量5~15μ1;(1)用相似度評(píng)價(jià)軟件評(píng)價(jià)17個(gè)樣品的指紋圖譜，從中確定一個(gè) 標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。步驟二：用上述相同的方式獲得一個(gè)待評(píng)價(jià)樣品的指紋圖譜;步驟三：用前 述相似度評(píng)價(jià)軟件評(píng)價(jià)所述待評(píng)價(jià)樣品指紋圖譜和所述標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的相似度，相似度大 于0.9則判定所述待評(píng)價(jià)樣品質(zhì)量符合要求。
[0012] 進(jìn)一步地，所述標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜包含以下15個(gè)特征峰，其中10號(hào)峰為參照峰，其相對(duì) 保留時(shí)間和相對(duì)峰面積為1.00，各峰的相對(duì)保留時(shí)間分別為：8.07、12.22、20.11、20.74、 25·17、26·56、27·00、28·32、32·58、35·76、38·46、40·35、41·06。
[0013] 更進(jìn)一步地，所述標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的15個(gè)特征峰的相對(duì)峰面積分別為0.0035、 0·0053、0·0038、0·0099、0·0114、0·0086、0·0073、0·0041、0·0042、1·000、0·1995、0·0263、 0·0546、0·0086、0·003711·。
[0014] 更進(jìn)一步地，用所述標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜中所述9個(gè)對(duì)照品對(duì)應(yīng)的峰的參數(shù)，與待測(cè)樣品 對(duì)應(yīng)的峰參數(shù)進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，相似度大于0.90時(shí)判定藥材復(fù)合要求。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明的供試品溶液制作方法操作溶液，具有較高的精密度、穩(wěn)定性、和重現(xiàn) 性，系統(tǒng)適用性強(qiáng)，可適用于用于該屬藥材的制作。所建立的黃花列當(dāng)指紋圖譜分析方法靈 敏度高，重現(xiàn)性好;所獲得的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜具有典型性、代表性，能較全面的反映黃花列當(dāng) 藥材中所含的化學(xué)成分種類(lèi)與數(shù)量，進(jìn)而對(duì)藥材的整體評(píng)價(jià)和描述提供一個(gè)更為全面的依 據(jù)。本發(fā)明建立的黃花列當(dāng)藥材高效液相指紋圖譜技術(shù)，彌補(bǔ)了現(xiàn)今尚屬空白的列當(dāng)藥材 質(zhì)量控制的方法，使列當(dāng)藥材的質(zhì)量控制技術(shù)更加全面。
【附圖說(shuō)明】
[0016] 圖1是根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的對(duì)照品指認(rèn)圖譜。
[0017] 圖2是根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。
[0018] 圖3是17批黃花列當(dāng)藥材HPLC指紋圖譜疊加圖。
【具體實(shí)施方式】 _9] 供試品溶液的制備
[0020]該環(huán)節(jié)中，取黃花列當(dāng)藥材粉末，加入計(jì)算量的甲醇溶液，浸泡后進(jìn)行超聲處理， 用溶劑補(bǔ)足減失的重量，濾過(guò)，取續(xù)濾液，以〇. 45μπι微孔濾膜濾過(guò)，備用。
[0021 ]本發(fā)明中，使用甲醇水溶液作為供試品溶劑，甲醇溶液的濃度范圍可以在50-90% 之間，優(yōu)選在60-80 %之間，最優(yōu)選70 %的甲醇溶液。
[0022]本發(fā)明中，優(yōu)選將黃化列當(dāng)粉粹成40目以下，使用時(shí)過(guò)40目篩，提取方法可以是回 流或者超聲處理，優(yōu)選在處理之前浸泡若干時(shí)間，優(yōu)選浸泡1小時(shí)。優(yōu)選通過(guò)超聲提取，提取 時(shí)間可以是20_80min，優(yōu)選提取40min。
[0023] 本發(fā)明中，取樣的量可以在0.1-0.3g的范圍，在采用上述最優(yōu)選方式的情況下，優(yōu) 選取樣0.15g，加70 %甲醇25ml，稱(chēng)定重量，浸泡lh，超聲處理40min，放置到室溫后，再稱(chēng)定 重量，用溶劑補(bǔ)足減失的重量，濾過(guò)，取續(xù)濾液以〇.45μπι微孔濾膜濾過(guò)，得到供試品溶液。
[0024] 因此，在本發(fā)明的最優(yōu)選的黃花列當(dāng)供試品溶液的制備方法為：取藥材粉末約 0.15g，精密稱(chēng)定，置100mL具塞錐形瓶中，精密加入70 %甲醇25mL，浸泡lh，超聲提取40min， 放置到室溫后，再稱(chēng)定重量，用溶劑補(bǔ)足減失的重量，濾過(guò)，取濾液以0.45μπι微孔濾膜濾過(guò)， 即得。
[0025] 對(duì)照品溶液的制備
[0026]取各對(duì)照品適量，分別編號(hào)，用甲醇溶解定容，制成一定濃度的溶液，微孔濾膜 (0.45μπι)濾過(guò)，備用。所使用的對(duì)照品共有以下9個(gè)：
[0027] a-L-鼠李糖葡萄糖^46)=-0-(4-0-咖啡酰)-D-葡萄糖
[0028] 芥子酸-4-〇-0_D 葡萄糖苷（Sinapoyl_4-〇-0-D-glucopyranoside)
[0029] 7_羥基毛蕊花糖苷（campneosideΠ )
[0030] 7_甲氧基毛蕊花糖苷(campneosidel，又稱(chēng)圓齒列當(dāng)苷）
[0031 ] 3'-甲氧基毛蕊花糖苷（leucosceptosideA)
[0032] 2'-乙酰毛蕊花糖苷（2'-306七}43(^6081(16)
[0033] 異圓齒列當(dāng)昔（isocrenatoside)
[0034] 色譜條件
[0035] 本發(fā)明中使用的色譜條件優(yōu)選為:色譜柱是十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱;流動(dòng) 相是乙腈（Α)-1%。磷酸水溶液（B)，采用梯度洗脫89%B(0min)~85%B(13min)~81%B (22min)~78%B(33min)~76%B(50)min;檢測(cè)波長(zhǎng)230 ~400nm;柱溫 20 ~30°C;進(jìn)樣量 5 ~ 15μ1〇
[0036] 在本發(fā)明的最佳實(shí)施例中，確定黃花列當(dāng)HPLC指紋圖譜分析的最優(yōu)色譜條件為： 色譜柱：島津Inertsil 0DS-SP HPLC色譜柱或者YMC-Pack 0DS-A色譜柱（250mmX4.6mm，5y m);流動(dòng)相：乙腈-〇.1%磷酸水溶液，梯度洗脫：89%8(〇111丨11)~85%8(131^11)~81%8 (22min)~78%B(33min)~76%B(50)min;流速：1.0ml/min;檢測(cè)波長(zhǎng) 295nm;柱溫 25°C;進(jìn) 樣量10μ1。
[0037] 標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的建立
[0038] 采用上述色譜條件，，測(cè)定17批次不同產(chǎn)地、不同采集時(shí)間的黃花列當(dāng)樣品，獲得 17份指紋圖譜，確定15個(gè)共有峰，并以前述9個(gè)化合物作為對(duì)照指認(rèn)其中9個(gè)，用相似度評(píng)價(jià) 軟件評(píng)價(jià)17個(gè)樣品的指紋圖譜，從中選擇一個(gè)相似度最大的指紋圖譜一一S9號(hào)藥材指紋圖 譜作為標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。對(duì)照品指認(rèn)圖譜（由前述對(duì)照品獲得)與S9號(hào)藥材圖譜的比較如圖1 與圖2。
[0039] 采用前述最優(yōu)選的各項(xiàng)參數(shù)和色譜條件，該標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜包含15個(gè)共有峰，其保 留時(shí)間和相對(duì)峰面積見(jiàn)表1。
[0040] 表1黃花列當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)指紋圖中共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積
[0043]該標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜中，結(jié)構(gòu)確定的9個(gè)峰與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜中的