一種銀黃顆粒指紋圖譜的測定方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及的銀黃顆粒質(zhì)量控制方法，具體涉及一種銀黃顆粒指紋圖譜的測定方法，屬于藥物分析技術(shù)領(lǐng)域，該測定方法是通過以下步驟實現(xiàn)的：（1）對照品溶液的制備；（2）內(nèi)標(biāo)溶液的制備；（3）供試品溶液的制備；（4）利用高效液相色譜?質(zhì)譜法進(jìn)行分析測定。本發(fā)明采用液相色譜與質(zhì)譜連用的方法，精確測定銀黃顆粒共有峰的化學(xué)成分，簡便準(zhǔn)確、靈敏度高、重復(fù)性好。本發(fā)明能夠更全面地監(jiān)控原料藥材、半成品和成品質(zhì)量，監(jiān)控生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性。
【專利說明】
一種銀黃顆粒指紋圖譜的測定方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及藥物分析技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種銀黃顆粒指紋圖譜的測定方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 銀黃顆粒系由金銀花提取物、黃芩提取物組成的復(fù)方制劑，具有清熱解毒、消炎等 功效，被廣泛用于治療上呼吸道感染、急性扁桃體炎、咽炎、流行性腮腺炎、眼科疾病、燒傷 感染等疾病。目前該品種在國家食品藥品監(jiān)督管理局獲得批準(zhǔn)文號的有102家企業(yè)，生產(chǎn)廠 家眾多，加之原料藥、生產(chǎn)工藝等方面的差異都會影響產(chǎn)品質(zhì)量。
[0003] 中藥指紋圖譜采用各種先進(jìn)的分析手段(光譜、波譜、色譜等技術(shù))標(biāo)示中藥組分 群體的特性，是實現(xiàn)鑒別中藥真實性、評價質(zhì)量一致性和產(chǎn)品穩(wěn)定性的可行模式，具有信息 量大、特征性強(qiáng)、整體性和模糊性等特點。指紋圖譜包括了對已知成分和未知成分的分析， 反映的化學(xué)成分信息(具體表現(xiàn)為相對保留時間和相對峰面積)具有高度特異性和選擇性， 可較充分地反映出中藥復(fù)雜混合體系中各種化學(xué)成分量分布的整體狀況，尤其是在現(xiàn)階段 有效成分絕大多數(shù)沒有明確的情況下，能夠結(jié)合各種色譜、光譜、波譜手段，特征性地鑒定 中藥的真?zhèn)闻c優(yōu)劣，成為中藥自身的"化學(xué)條碼"。
[0004] 《藥物分析雜志》2009年第29卷第8期的一篇《銀黃顆粒的HPLC特征圖譜分析》論文 中，建立了銀黃顆粒RP-HPLC指紋圖譜測定方法，流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液，梯度洗脫， 流速為1. OmL/min，檢測時間為35min，采用自身所含成分綠原酸峰為參照峰，共確定12個共 有峰作為該品種指紋圖譜的數(shù)學(xué)表達(dá)?！斗治鲈囼炇摇?015年第34卷第7期的一篇《超高效液 相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜法測定銀黃顆粒中化合成分和主要成分》論文中，建立了超高 效液相色譜一四極桿飛行時間質(zhì)譜（UHPLC-QTOF-MS)測定銀黃顆粒中活性成分的定性和 定量分析方法，以〇. 5%甲酸水溶液-乙腈為流動相，梯度洗脫，流速0.4 mL/min，檢測時間25 min，對色譜圖中的12種已知成分進(jìn)行了定量檢測。
[0005]但是，指紋圖譜只單純反映中藥的化學(xué)信息，與藥效指標(biāo)無關(guān)聯(lián)，難以準(zhǔn)確評價中 藥產(chǎn)品質(zhì)量，而藥效是評價藥品質(zhì)量的終極指標(biāo)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為解決上述問題，本發(fā)明提供一種銀黃顆粒指紋圖譜的測定方法，采用液相色譜 與質(zhì)譜連用的方法，精確測定銀黃顆粒共有峰的化學(xué)成分，簡便準(zhǔn)確、靈敏度高、重復(fù)性好。
[0007] 本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的： 一種銀黃顆粒指紋圖譜的測定方法，其特征在于，包括以下步驟： (1)對照品溶液的制備:精密稱取異鼠李素、黃芩苷、黃芩素、木犀草苷、隱綠原酸、新綠 原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、千層紙素、白楊素、漢黃芩苷、漢黃芩素，分別加甲 醇溶解，再加入等體積的水，分別制成〇. lmg/ml對照品溶液； (2 )內(nèi)標(biāo)溶液的制備:精密稱取異鼠李素，加甲醇溶解，再加入等體積的水，定容成濃度 為30yg ? mL-1的內(nèi)標(biāo)溶液； (3) 供試品溶液制備方法：取銀黃顆粒，加入甲醇溶液制成濃度為40mg ? ml/1樣品溶 液;將樣品溶液與30y g ? ml/1的內(nèi)標(biāo)溶液等體積混勻，經(jīng)0.22ym微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作 為供試品溶液； (4) 測定:利用高效液相色譜-質(zhì)譜法進(jìn)行分析測定。
[0008]進(jìn)一步，所述步驟（3)中供試品溶液的制備方法為：取銀黃顆粒，精密稱取細(xì)粉 1. 〇g，置于50 mL圓底燒瓶內(nèi)，精密加入體積分?jǐn)?shù)為50%甲醇水溶液25mL，稱重，加熱回流 20min，放冷，補(bǔ)重，過濾，得續(xù)濾液1;取續(xù)濾液1與內(nèi)標(biāo)溶液等體積混勻，經(jīng)0.22ym微孔濾膜 濾過，得續(xù)濾液2作為供試品溶液。
[0009] 進(jìn)一步地，所述高效液相色譜儀色譜條件為:4〖613\^11118；[1103&8色譜柱(4.6111111 X 250mm，5ym);條件為:柱溫30°C，流速1 ? 0 mL ? min-1，檢測波長235nm，進(jìn)樣量為：10yL，以 乙腈為流動相A，體積分?jǐn)?shù)為0.2%磷酸水溶液為流動相B，體積分?jǐn)?shù)為0.5%的磷酸水溶液為 流動相C進(jìn)行梯度洗脫。
[0010]進(jìn)一步地，梯度洗脫的條件為： 0-10 min，5-9%流動相A，95-91%流動相B; 10-31 min，9-16%流動相A，91-84%流動相B; 31-42 min，16%流動相A，84%流動相B;42-65 min，16-20%流動相A，84-80%流動相B;65-90min，20-22% 流動相A，80-78% 流動相 B; 90-120min，22% 流動相 A，78% 流動相C; 120-150min， 22-25%流動相A，78-75%流動相C; 150-170min，25-32%流動相A，75-68%流動相C; 170-185min，32-45%流動相A，68-55%流動相C; 185-200 min，45-60%流動相A，55-40%流動相C; 200-220 min，60-80%流動相A，40-20%流動相C; 220-250min，80-100%流動相A，20-0%流動相 C。所述百分比為體積百分比。
[0011]進(jìn)一步地，所述質(zhì)譜法的條件為:采用ESI離子源，正負(fù)離子交替掃描模式;離子阱 質(zhì)量分析器，質(zhì)量掃描范圍：50~1500 m/z;掃描速度26000 噴霧氣壓力35.0psi; 干燥氣溫度350°C;干燥氣流速gi^mirT1;毛細(xì)管電壓4000 V;碰撞氣:氦氣。
[0012] 本發(fā)明的有益效果： (1)在梯度洗脫過程中，選擇了不同時間段選用不同酸濃度(0.2%和0.5%的磷酸)進(jìn) 行洗脫，通過改變流動相中磷酸濃度，分離效果好，更好的分辨共有峰的化學(xué)成分。
[0013] (2)本發(fā)明針對成品所含有效成分的結(jié)構(gòu)特點和理化特征，對供試品溶液配制方 法、流動相、洗脫程序、色譜柱及質(zhì)譜參數(shù)等條件進(jìn)行了篩選和優(yōu)化，利于液相色譜與質(zhì)譜 的連用，且方法重復(fù)性及穩(wěn)定性好;對選取的20個共有峰均進(jìn)行了線性關(guān)系考察，進(jìn)樣量在 相當(dāng)于樣品〇. lmg-0.5mg范圍內(nèi)，各共有峰線性關(guān)系良好。
[0014] (3)選用異鼠李素為參照物，對含有內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的供試液進(jìn)行指紋圖譜的測定，采用 共有峰與內(nèi)標(biāo)峰的相對峰面積比值作為該指紋圖譜的數(shù)學(xué)表達(dá)，這樣比通常選用中藥自身 成分做參照計算各共有峰的相對峰面積，更能體現(xiàn)各共有峰含量的絕對變化與相對變化。 [0015] (4)該方法能夠更全面地監(jiān)控原料藥材、半成品和成品質(zhì)量，監(jiān)控生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定 性。
【附圖說明】
[0016] 圖1為實施例1得到的銀黃顆粒指紋圖譜。
[0017] 圖2為本發(fā)明對100批銀黃顆粒進(jìn)行了指紋圖譜測定，采用中位數(shù)法生成對照指紋 圖譜。
【具體實施方式】
[0018] 下面通過實施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的闡述，下述說明僅為了解釋本發(fā)明，并不 對其內(nèi)容進(jìn)行限定。
[0019] 1.1儀器 Waters e2695高效液相色譜儀（美國Waters公司），Waters 2998紫外檢測器（美國 Waters公司），Waters Empower色譜工作站（美國Waters公司）；AGBP210S電子天平 (Sartorius公司）；MILLIP0RE純水機(jī)（MILLIP0RE公司）；Agela Venusil MP Cis色譜柱 (4.6mm X 250mm，5ym)(天津博納艾杰爾科技有限公司）。
[0020] 1.2試藥 異鼠李素（批號：110860-200406)、黃芩苷（批號：110715-200514)、黃芩素（批號： 111595-200301)、木犀草苷(批號：111720-200603)購自中國食品藥品檢定研究院。隱綠原 酸(批號：14030213)、新綠原酸(批號：13112712)、異綠原酸A(批號：14041309)、異綠原 酸B(批號：14022812)、異綠原酸C(批號：14022805)、千層紙素(批號：14062410)、白楊素 (批號：13080712)、漢黃芩苷（批號：13120401)、漢黃芩素（批號：13101809)購自成都普 瑞法科技開發(fā)有限公司，純度>98%。液相色譜用乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純，試驗 用銀黃顆粒樣品均購自藥店，來源于36個不同廠家的100批樣品。
[0021] 實施例1 一種銀黃顆粒指紋圖譜測定方法，其特征在于，包括以下步驟： (1)對照品溶液的制備:精密稱取黃芩苷、黃芩素、木犀草苷、隱綠原酸、新綠原酸、異綠 原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、千層紙素、白楊素、漢黃芩苷、漢黃芩素，分別加甲醇溶解，再 加入等體積的水，分別制成〇. lmg/ml的對照品溶液，在4°C下避光保存。
[0022] (2)內(nèi)標(biāo)溶液的制備:精密稱取異鼠李素，加甲醇溶解，再加入等體積的水，定容成 濃度為30yg ? mL-1的內(nèi)標(biāo)溶液。
[0023]內(nèi)標(biāo)物的選擇： 共考察了丹皮酚、丹酚酸B、葛根素、異鼠李素、橙皮苷、山奈酚、槲皮素、槲皮苷等對照 品最終選擇了異鼠李素為內(nèi)標(biāo)。異鼠李素的保留時間為196 min左右，與相鄰峰達(dá)到基線分 離，無干擾，相鄰峰的分離度均>1.5。
[0024]內(nèi)標(biāo)物溶媒的選擇： 內(nèi)標(biāo)物先用甲醇溶解，再加入等體積的水溶液，制備成內(nèi)標(biāo)物溶液。內(nèi)標(biāo)物溶液經(jīng)超聲 (20min)后澄清，然后再與供試液混合，混合后仍澄清，且放置24h內(nèi)不渾濁。故用此方法配 制內(nèi)標(biāo)溶液。
[0025]內(nèi)標(biāo)物濃度的確定： 隨機(jī)選取10個銀黃顆粒樣品，制備樣品溶液，并加入等體積不同濃度的內(nèi)標(biāo)溶液，混 勻，進(jìn)高效液相色譜儀測定，選擇譜圖中峰面積適中的異鼠李素濃度，以確定內(nèi)標(biāo)物的濃 度。經(jīng)考察，確定異鼠李素的濃度為30yg ? ml/1。
[0026] (3)供試品溶液制備方法:取銀黃顆粒研細(xì)，精密稱取細(xì)粉1.0g，置于50 mL圓底燒 瓶內(nèi)，精密加入體積分?jǐn)?shù)為50%甲醇水溶液25mL，稱重，加熱回流20min，放冷，補(bǔ)重，過濾，得 續(xù)濾液1;取續(xù)濾液1與內(nèi)標(biāo)溶液等體積混勻，經(jīng)0.22ym微孔濾膜濾過，得續(xù)濾液2作為供試 品溶液； (4)測定:高效液相色譜-質(zhì)譜法測定。
[0027] 高效液相色譜儀色譜條件為:Agela Venusil MP Cis色譜柱(4.6mmX250mm，5ym); 條件為:柱溫30°C，流速1. OmL ? min-1，檢測波長235nm，進(jìn)樣量為10yL，以乙腈為流動相A， 體積分?jǐn)?shù)為〇. 2%磷酸水溶液為流動相B，體積分?jǐn)?shù)為0.5%的磷酸水溶液為流動相C進(jìn)行梯度 洗脫。
[0028]梯度洗脫的條件見表1:
所述百分比為體積百分比。
[0029] (5)按照上述方法得到的色譜圖，如圖1所示。
[0030] 以異鼠李素為參照，標(biāo)定了 20個共有峰，共有峰面積占總面積的85%以上，測定12 個成分的對照品溶液，通過與對照品保留時間和紫外吸收光譜的比對，確定了其中1、3、4、 7、8、9、11、16、17、18、19、20號色譜峰分別為新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠 原酸A、異綠原酸C、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、白楊素、千層紙素。
[0031] 結(jié)合質(zhì)譜解析以及對照品的比對，共確定了 14個共有峰的化學(xué)成分，分析結(jié)果見 表2。質(zhì)譜法的條件為:采用ESI離子源，正負(fù)離子交替掃描模式;離子阱質(zhì)量分析器，質(zhì)量掃 描范圍：50~1500 m/z;掃描速度26000 m/z.s-S噴霧氣壓力35.0psi;干燥氣溫度350 °C; 干燥氣流速gi^mirT1;毛細(xì)管電壓4000 V;碰撞氣:氦氣。
[0032] 表2為銀黃顆粒中部分共有峰成分解析。
[0033]
2.1線性關(guān)系的考察 精確稱取2.5g銀黃顆粒，精密加入50%甲醇溶液25mL，制備供試液，分別吸取lmL、2mL、 3mL、4mL、5mL供試液于5mL量瓶中，加入50%甲醇定容至刻度，搖勻，等體積加入不同濃度的 異鼠李素內(nèi)標(biāo)溶液，共制得含樣品濃度為O.Olg.mL '0.02 g.mL '0.03 g.mL ' 0.04 g ? mL -\0.05 g ? mL -1的供試液，使所含內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的濃度分別為10yg ? mL -\20ii g ? mL -\30yg ? mL -\40yg ? mL -\50yg ? mL -、分別進(jìn)樣10yL，按色譜條件進(jìn)樣測定，以 濃度X(yg*mL -1)為橫坐標(biāo)，以各峰與內(nèi)標(biāo)峰面積比值Y縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果顯示 進(jìn)樣量在相當(dāng)樣品1〇〇~500yg范圍內(nèi)，20個共有峰成分線性關(guān)系良好，內(nèi)標(biāo)物質(zhì)在進(jìn)樣量 0.1~0.5yg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。線性關(guān)系見表3。
[0034] 2.2精密度試驗 取同一樣品供試液，1〇此進(jìn)樣，連續(xù)進(jìn)樣5次，按色譜條件進(jìn)樣測定，以異鼠李素為參照 峰，計算共有峰的相對保留時間和峰面積比值。結(jié)果顯示各共有峰的相對保留時間RSD< 0.12%，相對峰面積RSD < 1.75%，表明儀器精密度良好。
[0035] 2.3重復(fù)性試驗 取同一批供試品5份，按制備方法制備供試品溶液，按色譜條件進(jìn)樣測定，以異鼠李素 為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和峰面積比值。結(jié)果顯示各共有峰的相對保留時 間RSD < 1.01%，相對峰面積RSD < 2.05%，表明分析方法重現(xiàn)性良好。
[0036] 2.4穩(wěn)定性試驗 取同一批供試品溶液，按色譜條件，分別在0 h、5 h、10 h、15 h、20 h、25 h進(jìn)樣，記錄 色譜圖，以異鼠李素為參照峰，計算共有峰的相對保留時間和峰面積比值。結(jié)果顯示各共有 峰的相對保留時間RSD<0.09%，相對峰面積RSD<2.11 %，表明供試品溶液室溫放置在25h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。
[0037] 2.5相似度評價 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2004A版)》，采用多點校正對100批圖譜進(jìn)行 匹配，計算相似度，中位數(shù)法生成對照指紋圖譜，如圖2所示。經(jīng)計算，樣品間相似度在0.964 以上，各批樣品與生成的對照指紋圖譜相似度均在0.974~0.999之間。表明各批次間銀黃顆 粒存在一定差異，但總體上工藝較穩(wěn)定，產(chǎn)品均一性較好，該方法能較好用于銀黃顆粒質(zhì)量 控制。
【主權(quán)項】
1. 一種銀黃顆粒指紋圖譜的測定方法，其特征在于，包括以下步驟： (1)對照品溶液的制備:精密稱取異鼠李素、黃芩苷、黃芩素、木犀草苷、隱綠原酸、新綠 原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、千層紙素、白楊素、漢黃芩苷、漢黃芩素，分別加甲 醇溶解，再加入等體積的水，分別制成〇. lmg/ml對照品溶液； (2 )內(nèi)標(biāo)溶液的制備:精密稱取異鼠李素，加甲醇溶解，再加入等體積的水，定容成濃度 為30yg · mL-1的內(nèi)標(biāo)溶液； (3) 供試品溶液制備方法:取銀黃顆粒，加入甲醇溶液制成濃度為40mg · ml/1樣品溶液； 將樣品溶液與SOlIg · ml/1的內(nèi)標(biāo)溶液等體積混勻，經(jīng)0.22μπι微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供 試品溶液； (4) 測定:利用高效液相色譜-質(zhì)譜法進(jìn)行分析測定。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的指紋圖譜測定方法，其特征在于，高效液相色譜儀色譜條件 為：Agela Venusil MP Cis色譜柱（4.6mmX250mm，5ym);條件為：柱溫30°C,流速 1.0 mL· HiirT1，檢測波長235nm，進(jìn)樣量為：IOyL，以乙腈為流動相A，體積分?jǐn)?shù)為0.2%磷酸水溶液為流 動相B，體積分?jǐn)?shù)為0.5%的磷酸水溶液為流動相C進(jìn)行梯度洗脫。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的指紋圖譜測定方法，其特征在于，梯度洗脫的條件為： 0-10 min，5-9%流動相A，95-91%流動相B; 10-31 min，9-16%流動相A，91-84%流動相B; 31-42 min，16%流動相A，84%流動相B;42-65 min，16-20%流動相A，84-80%流動相B;65-90min，20-22%流動相A，80-78%流動相B; 90-120min，22%流動相A，78%流動相C; 120-150min， 22-25%流動相A，78-75%流動相C; 150-170min，25-32%流動相A，75-68%流動相C; 170-185min，32-45%流動相A，68-55%流動相C; 185-200 min，45-60%流動相A，55-40%流動相C; 200-220 min，60-80%流動相A，40-20%流動相C; 220-250min，80-100%流動相A，20-0%流動相 C； 所述百分比為體積百分比。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的指紋圖譜測定方法，其特征在于，質(zhì)譜法的條件為:采用ESI離 子源，正負(fù)離子交替掃描模式;離子講質(zhì)量分析器，質(zhì)量掃描范圍：50~1500 m/z ;掃描速度 26000 m/z.s-S噴霧氣壓力35.0psi;干燥氣溫度350°C;干燥氣流速9L.min-S毛細(xì)管電 壓4000 V;碰撞氣:氦氣。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4之一所述的指紋圖譜測定方法，其特征在于，步驟(3)中供試品溶 液的制備方法為:取銀黃顆粒，精密稱取細(xì)粉1.0 g，置于50 mL圓底燒瓶內(nèi)，精密加入體積分 數(shù)為50%甲醇水溶液25mL，稱重，加熱回流20min，放冷，補(bǔ)重，過濾，得續(xù)濾液1;取續(xù)濾液1與 內(nèi)標(biāo)溶液等體積混勻，經(jīng)〇. 22μπι微孔濾膜濾過，得續(xù)濾液2作為供試品溶液。
【文檔編號】G01N30/02GK105911186SQ201610247197
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年4月20日
【發(fā)明人】高燕, 呂凌, 丁曉彥, 劉青, 趙渤年
【申請人】山東省中醫(yī)藥研究院