玉米丙酮酸磷酸雙激酶基因的專一性ssr標記及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及玉米丙酮酸磷酸雙激酶基因的專一性SSR標記及其應(yīng)用，屬于生物技 術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] C4植物具有低光呼吸、高氮素和水分利用效率、高光能利用效率的優(yōu)點；與C4光合 有關(guān)的酶在對生物和非生物逆境（如機械創(chuàng)傷、低溫、鹽害及紫外輻射）的防御反應(yīng)中也有 較重要的作用。由于主要糧食作物如水稻與小麥等C3植物不具有這些優(yōu)勢，人們就希望將 c4這些優(yōu)勢特征引入水稻等c3作物中。丙酮酸磷酸雙激酶（proK)是(：4植物光合作用的 關(guān)鍵酶，主要功能是催化〇)2原初受體磷酸烯醇式丙酮酸（PEP)的再生，其中PEP參與固定 〇)2及碳骨架的形成。在C4種子發(fā)育過程中，PPDK參與淀粉合成、淀粉一蛋白平衡等重要生 物學(xué)過程（王珍梅等，2012;董洋等，2013)。國內(nèi)外對該基因的研究報道比較多，已有不少 將玉米PPDK基因成功轉(zhuǎn)入水稻中或克隆不同玉米品種（系）PPDK基因的報道（焦德茂等， 2001 ;王德正等，2002 ;袁莉民等，2006 ;張建福等，2006 ;袁定陽等，2007 ;張邊江等，2008 ; 王重等，2010 ;宋濤等，2013 ;龔付全等，2014)。這些轉(zhuǎn)基因水稻的C02補償點和光呼吸速率 顯著降低，表觀凈光合速率提高，產(chǎn)量也有不同程度的提高。
[0003] 為了加快轉(zhuǎn)PPDK基因水稻的選育進程，利用分子標記進行輔助選擇是一種比較 快速、適用的技術(shù)。一些文獻對玉米PPDK基因開發(fā)了分子標記進行基因檢測（張建福等， 2006 ;袁定陽等，2007;張邊江等，2008;龔付全等，2014)。但這些分子標記的堿基序列要么 位于非編碼區(qū)，要么跨疊非編碼區(qū)，不利于基因表達分析（轉(zhuǎn)基因的重要目的之一就是希 望目的基因能正常表達）；而且這些標記在不同玉米品種之間或者不同水稻品種之間存在 著差異，不能快速、簡單、高效地區(qū)分所有玉米PPDK基因與水稻PPDK基因的差異。截止目 前，還未見一個只針對玉米PPDK基因篩選用的專一分子標記的報道。本專利利用NCBI數(shù) 據(jù)庫中有關(guān)所有玉米和水稻PPDK基因編碼區(qū)的遺傳信息，通過序列比對軟件DNAStar分析 發(fā)現(xiàn)，玉米與水稻之間在PPDK基因上差異眾多，基本上沒有辦法進行引物設(shè)計，而且不同 玉米品種（系）之間也具有很多差異位點，幾乎沒有超過50bp完全比對上的位置，這也為 玉米專用PPDK基因引物提出了很大的挑戰(zhàn)。于是，我們試著從另外一個角度去考慮這個問 題，選用經(jīng)典玉米品種B73的PPDK基因（NC_024464)的序列作為參考序列，首先比較不同 品種（系）玉米的PPDK基因在編碼區(qū)即18個外顯子上的差異，其中第2，11和18這3個 外顯子序列比較短（彡90bp)，不利于SSR引物設(shè)計；第1、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、16 和17外顯子在不同玉米品種（系）中差異就比較大，也不適合設(shè)計用于只針對玉米PPDK基 因的通用引物；而外顯子15(以玉米品種B73為例，9445-9573,129bp)在NCBI數(shù)據(jù)庫比對 中偶然發(fā)現(xiàn)該序列在已報道的所有玉米品種（系）中的堿基序列完全一致，遂利用Primer 5. 0軟件對該129bp的堿基序列進行引物設(shè)計，其中第39-128bp之間（前后引物各17bp) 具有比較好的SSR引物特征，再把第39-128bp之間這90bp的堿基序列放入NCBI數(shù)據(jù)庫的 水稻基因組中進行比對，沒有任何比對結(jié)果，說明利用該引物（命名為PK15)在水稻中沒法 擴增出相應(yīng)的90bp長度的片段（圖1和圖2)，隨后合成該引物，進行PCR擴增，結(jié)果表明該 引物只在玉米或轉(zhuǎn)玉米PPDK基因水稻中有90bp的擴增片段出現(xiàn)，而在各種不同水稻品種 中沒有擴增條帶，這為轉(zhuǎn)任何玉米品種（系）的PPDK基因用于水稻育種分子標記輔助選擇 提供了一個簡單、統(tǒng)一的標準，有利于加快轉(zhuǎn)玉米PPDK基因在水稻育種上的應(yīng)用。
[0004] 主要參考文獻：
[0005]焦德茂等，作物學(xué)報，2001，27(2) : 137-143
[0006] 王德正等，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2002, 35(10) : 1165-1170
[0007] 袁莉民等，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006,39(5):902-909
[0008] 張建福等，分子植物育種，2006,4(5):655-662
[0009] 張建福等，分子植物育種，2006,4(6) :797-804
[0010] 袁定陽等，雜交水稻，2007,22(2):57-63
[0011] 張邊江等，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008,41(10):3008-3014
[0012] 王重等，新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010,47(12) :2354-2360
[0013] 王真梅等，植物生理學(xué)報，2012,48(10):949-957
[0014] 董洋等，黑龍江大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報，2013,30(5):642-652
[0015] 宋濤等，江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013,41(1) :58-61
[0016] 龔付全等，熱帶生物學(xué)報，2014,5(4):326-333

【發(fā)明內(nèi)容】

[0017] 技術(shù)問題
[0018] 本發(fā)明的目的是提供玉米PPDK基因?qū)Ｒ恍許SR標記及其應(yīng)用，在轉(zhuǎn)玉米PPDK基 因水稻的分子標記輔助選擇育種中提高選育效率。
[0019] 技術(shù)方案
[0020] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案。
[0021] 一種玉米丙酮酸磷酸雙激酶基因的專一性SSR標記，其特征在于該標記PK15的正 反引物序列如下：
[0022] 正向引物 5' -3' ：TGAGAAAGTGTTCGCCA，
[0023] 反向引物Y-3^ :TCATCAGCCACCAGAGC。
[0024] 所述玉米丙酮酸磷酸雙激酶基因的專一性SSR標記在水稻育種中的應(yīng)用，包括以 下步驟：
[0025] 1)提取水稻、玉米基因組DNA和/或RNA或cDNA;
[0026] 2)使用權(quán)利要求1所述標記PK15的正反引物序列，PCR擴增轉(zhuǎn)玉米PPDK基因水 稻、玉米基因組DNA和/或RNA或cDNA;
[0027] 3)電泳檢測擴增產(chǎn)物，如果出現(xiàn)90bp的條帶，則表示該材料基因組中含有玉米丙 酮酸磷酸雙激酶基因；如果在轉(zhuǎn)玉米PPDK基因水稻的后代植株中沒有出現(xiàn)90bp的條帶，則 表示該材料基因組中不含有玉米丙酮酸磷酸雙激酶基因。其中，步驟2)PCR擴增具體操作 為：PCR采用 20yL反應(yīng)體系：模板DNA或RNA1. 0yL，10XPCRBuffer2. 0yL，Buffer中 含 1. 5mMMg2+，2mM的dNTP2. 0yL，0. 2yM的引物 2. 0yL，Taq酶 1U，加ddH20補至 20yL;
[0028] ?〇?擴增條件為：（1)94°(：預(yù)變性5111111;(2)94°(：變性308,49.1°(：退火308,72°(：延 伸30s，擴增35個循環(huán)；（3) 72°C延伸lOmin，4°C保溫。
[0029] 有益效果
[0030] 本發(fā)明的優(yōu)點是：
[0031] 1)本發(fā)明所獲得的標記是根據(jù)玉米PPDK基因內(nèi)部編碼區(qū)堿基序列設(shè)計的引物， 為基因自身標記，故不存在遺傳交換，不需要作表型鑒定。
[0032] 2)由于PK15標記位于玉米PPDK基因的第15個外顯子區(qū)域，無論是利用基因組 DNA進行檢測，還是利用RNA或cDNA進行表達檢測，其結(jié)果都是準確可靠的。
[0033] 3)本發(fā)明的標記為共分離標記，可鑒別玉米PPDK基因存在與否，實驗重復(fù)性好， 結(jié)果可靠。
[0034] 4)由于該標記兩端所在的DNA序列在所有玉米品種（系）基因組中高度保守一 致，該標記具有專一性與通用性，在轉(zhuǎn)任一玉米PPDK基因研究中無需再開發(fā)新標記即可利 用該標記進行分子標記輔助選擇。
[0035] 5)利用本發(fā)明的標記進行輔助選擇育種，不僅節(jié)約成本，而且能夠準確、高效地將 玉米高光效PPDK基因轉(zhuǎn)育到C3植物如水稻中去。
【附圖說明】
[0036] 圖1為玉米PPDK基因第15外顯子堿基序列及標記PK15的前后引物序列位置。
[0037] 圖2為標記PK15對22個水稻或玉米品種（系）的基因型檢測結(jié)果（上圖為電 泳3〇1^11結(jié)果，下圖為電泳7〇111111的結(jié)果，電泳條件為2%的瓊脂糖，100￥電壓）。1為 50bpDNAmarker，1 ~22 分別為：蘇玉 29、蘇科懦 3 號、Kitaake、Koshihikari(越光）、轉(zhuǎn) P印c基因Kitaake-1 (PC1)、轉(zhuǎn)PPDK基因Kitaake(PK)、轉(zhuǎn)P印c基因Kitaake-2 (PC2)、轉(zhuǎn) ME基因Kitaake(PME)、R299、轉(zhuǎn)PEPC+PPDK雙基因R299-1 (T299-1)、轉(zhuǎn)PEPC+PPDK雙基因 R299-2(T299-2)、9311、蜀恢881、黃華占、廣恢128、R6547、中佳早2號、Dular、日本晴、日 光、武運粳8號、寧粳3號。
【具體實施方式】
[0038] 1、供試材料
[0039]
[0040] 2.DNA提取
[0041] 在苗期取水稻葉片，基因組DNA的提取參照Xin等（Xinetal.，BioTechniqu es，2003, 34:820-826)簡便方法，具體如下：
[0042] 1)用打孔器打取新鮮水稻或玉米葉片約30mm2,轉(zhuǎn)入96孔PCR擴增板中；
[0043] 2)每管加入50uL新鮮配制的buf ferA溶液（100mMNaOH, 2 %Tween20)放入PCR 擴增儀上在95°C下保溫lOmin;
[0044] 3)每管加入 50uL的bufferB溶液（lOOmMTris-HCl，2mMEDTA)，溫和混勻；
[0045] 4)取luL上清液加入PCR管或96孔PCR板，可作為10-20uL的PCR反應(yīng)體系的 DNA模板用。
[0046] 3.RNA提取
[0047] 按照天根生物科技有限公司生產(chǎn)的RNAprepPure植物總RNA提取試劑盒（離心 柱型）DP432的使用說明書進行。
[0048] 1)勻漿處理：50-100mg植物葉片在液氮中迅速研磨成粉末，加入450y1RL(使用 前請先檢查是否已加入0 _巰基乙醇），渦旋劇烈震蕩混勻。
[0049] 2)將所有溶液轉(zhuǎn)移至過濾柱CS上（過濾柱CS放在收集管中），12,OOOrpm離心 2-5min，小心吸取收集管中的上清至RNase-Free的離心管中，吸頭盡量避免接觸收集管中 的細胞碎片沉淀。
[0050]3)緩慢加入0? 5倍上清體積的無水乙醇（通常為225uL)，混勻（此時可能會出 現(xiàn)