專(zhuān)利名稱(chēng)：一種體外評(píng)價(jià)甲型h1n1流感病毒抗體效價(jià)的檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于人畜共患病研究領(lǐng)域，涉及一種人畜共患病的鑒別診斷方法。選擇了 公開(kāi)的甲型H1N1加利福尼亞病毒株(A/California/08/2009(HlNl))cDNA序列中HA基因 為研究?jī)?nèi)容，首先根據(jù)結(jié)構(gòu)生物學(xué)軟件分析出HA蛋白漏在包膜外部分的序列，再根據(jù)抗 原性分析，選出免疫原性比較高的部分，通過(guò)基因合成方法獲得基因片段構(gòu)建原核表達(dá)載 體pGEX-6P-l-HA ;將陽(yáng)性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中得到重組菌株(Escherichia coli BL21rosseta/pGEX-6P-l-HA截短蛋白)；通過(guò)多種層析方法獲得純化后的H1N1的HA截短 蛋白，并利用所述的表達(dá)蛋白建立酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)間接法實(shí)驗(yàn)原理評(píng)價(jià)病人體內(nèi)因?yàn)榱?感病毒感染或疫苗免疫產(chǎn)生的抗體效價(jià)。 本發(fā)明提供重組強(qiáng)致病性的甲型H1N1流感病毒HA重要抗原表位蛋白的表達(dá)與純 化方法以及用該蛋白建立的H1N1抗體的診斷方法。
背景技術(shù)：
甲型H1N1流感是一種由A型豬流感病毒引起的豬呼吸系統(tǒng)疾病，該病毒可在豬群 中造成流感暴發(fā)。2009年3月底至4月中旬，墨西哥、美國(guó)等多國(guó)接連暴發(fā)甲型H1N1型流 感疫情，接著在短短的幾個(gè)月時(shí)間在全世界迅速蔓延。此次引發(fā)疫情的病毒是豬流感病毒 A(H1N1)亞型，是一種從未在人和豬身上出現(xiàn)過(guò)的新型豬流感病毒。截止2009年9月3日， 全球188個(gè)國(guó)家和地區(qū)發(fā)生了疫情，共報(bào)告25萬(wàn)病例，累計(jì)死亡病例2800多例，實(shí)際上發(fā) 病人數(shù)要遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)報(bào)告的病例數(shù)。目前，北半球進(jìn)入秋季，疫情呈快速上升趨勢(shì)。從我國(guó)內(nèi) 地來(lái)看，近期疫情形勢(shì)也發(fā)生了一些新的變化，疫情從沿海向全國(guó)、從城市向農(nóng)村擴(kuò)散，由 輸入為主變?yōu)楸就翞橹?，由散發(fā)病例向聚集疫情發(fā)展。目前，內(nèi)地31個(gè)省份都發(fā)現(xiàn)疫情，每 日?qǐng)?bào)告病例數(shù)呈上升趨勢(shì)，近期還陸續(xù)出現(xiàn)了重癥病例。我們面臨的疫情防控形勢(shì)不容樂(lè) 觀。截至9月10日，我國(guó)內(nèi)地31個(gè)省份累計(jì)報(bào)告甲型H1N1流感確診病例6968例。
甲型H1N1流感的潛伏期，較普通流感、禽流感潛伏期長(zhǎng)，潛伏期時(shí)長(zhǎng)七天。早期癥 狀與普通人流感相似，包括發(fā)熱、咳嗽、喉痛、身體疼痛、頭痛等，有些還會(huì)出現(xiàn)腹瀉或嘔吐、 肌肉痛或疲倦、眼睛發(fā)紅等癥狀。部分患者病情可迅速進(jìn)展，來(lái)勢(shì)兇猛、突然高熱、體溫超過(guò)
39t:，甚至繼發(fā)嚴(yán)重肺炎、急性呼吸窘迫綜合癥、肺出血、胸腔積液、全身血細(xì)胞減少、腎功
能衰竭、敗血癥、休克及Reye綜合癥、呼吸衰竭及多器官損傷，導(dǎo)致死亡。甲型H1N1流感的 蔓延給人群健康和經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展帶來(lái)巨大危害。疫情暴發(fā)后，我國(guó)高度重視防治防控工作， 果斷決策，統(tǒng)一部署，采取了一系列有序有效的防控措施。秋冬季節(jié)，甲型H1N1流感會(huì)進(jìn)入 一個(gè)高峰期。學(xué)校開(kāi)學(xué)成為聚集性發(fā)病的重要風(fēng)險(xiǎn)因素。所以，我國(guó)防控甲型H1NI流感形 勢(shì)嚴(yán)峻。日前，國(guó)務(wù)院對(duì)秋冬季節(jié)我國(guó)甲型H1NI流感防控工作做出了一系列重要部署。下 一階段的防控方針是強(qiáng)化預(yù)防措施，嚴(yán)控社區(qū)傳播，加強(qiáng)重癥救治，全力減少疫情危害。所 謂"社區(qū)"，重點(diǎn)包括學(xué)校、醫(yī)院等。我國(guó)將完善信息發(fā)布機(jī)制，制定針對(duì)人員密集流動(dòng)情況 下的鐵路、民航防控預(yù)案。同時(shí)，充分發(fā)揮疫苗手段，特別是在參加國(guó)慶游行的人員中首先啟動(dòng)疫苗接種。中國(guó)首批甲型H1N1流感疫苗6月22日正式下線(xiàn)，在經(jīng)過(guò)一系列生物、生化 實(shí)驗(yàn)和臨床實(shí)驗(yàn)后，這批疫苗有望于9月上市。預(yù)計(jì)在國(guó)慶之前將產(chǎn)出滿(mǎn)足500萬(wàn)人份的 用量，并將全部用于國(guó)家儲(chǔ)備。目前，我國(guó)已成為世界上第一個(gè)可以應(yīng)用甲型H1N1流感疫 苗的國(guó)家。 全國(guó)范圍內(nèi)的疫苗接種工作正在緊鑼密鼓的展開(kāi)，但一些質(zhì)疑也隨之而來(lái)。這些 質(zhì)疑主要針對(duì)甲流疫苗"一針免疫"是否能達(dá)到真正免疫的效果，免疫的持久性等方面。在 2009年9月8日召開(kāi)的新聞發(fā)布會(huì)上，國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局藥品注冊(cè)司司長(zhǎng)張偉回應(yīng) 有關(guān)甲流疫苗"一針免疫"的質(zhì)疑時(shí)表示，目前只是暫定接種一針。甲流疫苗接種一針到底 夠不夠，能不能產(chǎn)生有效的抗體？免疫的持久性如何？廣大民眾任然會(huì)有這樣的擔(dān)心。有 沒(méi)有一種快速，簡(jiǎn)便的方法對(duì)疫苗免疫效果作出精準(zhǔn)的評(píng)估？ 本公司所研制的試劑盒能夠快速、準(zhǔn)確、廉價(jià)的檢測(cè)抗體效價(jià)，有效的解決了這一難題。

發(fā)明內(nèi)容
其中所述的重組蛋白的制備方法，它包括下列步驟 1)公開(kāi)的甲型H1N1加利福尼亞病毒株(A/California/08/2009(HlNl))cDNA序列 中HA基因?yàn)槟康幕?，通過(guò)基因合成的方法獲得基因片段； 2)在原核表達(dá)載體pGEX-6p-l多克隆位點(diǎn)中定向插入甲型H1N1流感病毒非結(jié)構(gòu) 蛋白基因HA截短蛋白的DNA序列，構(gòu)建得到原核表達(dá)載體質(zhì)粒pGEX-6p-l-HA截短蛋白基 因； 3)將步驟2)所說(shuō)的原核表達(dá)載體質(zhì)粒pGEX-6p-l-HA截短蛋白轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 BL21Rosseta感受態(tài)細(xì)胞，用氨芐霉素抗性篩選單個(gè)重組菌。 4)所述純化具體是pGEX-6p-l-HA截短蛋白在大腸桿菌Rosetta中表達(dá)，克 隆接種至3ml含有100ug/ml氨芐青霉素的LB緩沖液，37°C ，過(guò)夜，220rpm ;將過(guò)夜培養(yǎng) 物l : 100稀釋至1L含有100ug/ml氨芐青霉素的LB緩沖液，37。C，220rpm，培養(yǎng)5h;加 入終濃度為0. lmM的IPTG，22°C， 180rpm，繼續(xù)培養(yǎng)22h ;以8000g， 15min， 4°C離心收菌； 菌體用50mM Tris-cl，200mM NaCl pH8. 0懸起至25ml，加入5mg溶菌酶，RT，0. 5h ;用超 聲破碎儀超聲至溶液澄清，12000rpm，20min離心3次；將上清液使用GE healthcare的 Glutathione-S印harose4B柱料純化，得到純化融合蛋白。PSP酶切GST標(biāo)簽，柱料純化，得 到除去標(biāo)簽的HA截短蛋白。 實(shí)驗(yàn)證明，純化后HA截短蛋白可溶性極高，一年內(nèi)未有聚合物出現(xiàn)。 本發(fā)明提供的利用Pgex-6p-l系統(tǒng)融合表達(dá)再經(jīng)酶切處理去掉標(biāo)簽制得的HA截
短蛋白，可以在大腸桿菌中成功表達(dá)，表達(dá)量與前人的結(jié)果類(lèi)似，相對(duì)于真核表達(dá)，原核表
達(dá)制備工程化抗體技術(shù)相對(duì)簡(jiǎn)單，成本更低； 本發(fā)明的目的之二是提供一種快速、準(zhǔn)確、安全、廉價(jià)的檢測(cè)甲型H1N1流感病毒 抗體水平的ELISA診斷方法及診斷試劑盒。 所述診斷試劑盒制備的具體方法經(jīng)離心破碎BL21rosseta細(xì)胞，提取并純化表 達(dá)的HA重要抗原表位。用該蛋白包被ELISA酶標(biāo)板制備ELISA抗原酶標(biāo)板。用空白對(duì)照 菌(Escherichia coli BL21Rosseta/HA)誘導(dǎo)產(chǎn)物制備血清稀釋液，按照普通ELISA方法檢測(cè)待檢血清。根據(jù)反應(yīng)后的吸光值確定陰性、可疑、陽(yáng)性的判斷臨界值。 按照如下的配方制備包被液、洗滌液、封閉液、稀釋液、底物液、終止液包被液(25mmol/L碳酸鹽緩沖液):Na2C032. 322g， NaHC032. 352g， ddH20加至
1000mL(pH9. 6)。 1倍洗滌液NaCl 8g， KC1 0. 2g， Na2HP04 12H20 3. 63g， KH2P04 0 . 44g，雙蒸水加至 1000mL(pH7. 4)。 封閉液2g牛血清白蛋白(BSA)溶于lOOmL洗滌液。
稀釋液lg牛血清白蛋白(BSA)溶于100mL洗滌液
底物液購(gòu)買(mǎi)自天健生物生物制藥(天津)有限公司
終止液2N H2S04 將HA抗原酶標(biāo)板、洗滌液(25倍)、稀釋液、HRP標(biāo)記的抗人IgG抗體、底物緩沖 液、終止液組裝成HA-ELISA鑒別診斷試劑盒。
本發(fā)明的有益效果是 1.本發(fā)明的有益效果之一是生物安全性高。本發(fā)明所用的檢測(cè)抗原是重組蛋白， 制備過(guò)程中不涉及活病毒，因此沒(méi)有活病毒逃逸、擴(kuò)散的潛在危險(xiǎn)。 2.本發(fā)明的有益效果之二是生產(chǎn)成本低。本發(fā)明所提供的甲型H1N1流感抗體檢 測(cè)方法和檢測(cè)試劑盒所需抗原是甲型H1N1流感病毒的HA的重要抗原表位。該蛋白可以通 過(guò)重組大腸桿菌BL21Rosseta/HA截短蛋白在體外得到大量的表達(dá)，適合大規(guī)模的生產(chǎn)。
3.本發(fā)明的有益效果之三是提供的檢測(cè)試劑盒使用方便。本發(fā)明在提供了檢測(cè)方 法的基礎(chǔ)上，還將該方法所需的各種試劑組裝成試劑盒，操作簡(jiǎn)單易行，非常適合臨床大規(guī) 模檢測(cè)。


圖1、顯示Pgex-6P-1載體圖譜。 圖2、 HA截短蛋白融和蛋白小量表達(dá)鑒定SDS-PAGE電泳圖。其中1為未誘導(dǎo)菌 株；M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，從上到下依次為115KD、66KD、45KD、35KD、25KD、18. 4KD、14. 4KD ;2 為1號(hào)誘導(dǎo)后菌株；3為2號(hào)誘導(dǎo)后菌株；4為3號(hào)誘導(dǎo)后菌株； 圖3、顯示的是純化后的HA截短蛋白融和蛋白SDS-PAGE電泳圖。其中1為純化后 的融和蛋白；M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，從上到下依次為115KD、66KD、45KD、35KD、25KD、18. 4KD、 14. 4KD ; 圖4、酶切后除掉標(biāo)簽的HA截短蛋白SDS-PAGE電泳圖。其中1為酶切后不帶標(biāo) 簽的HA蛋白；M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，從上到下依次為115KD、66KD、45KD、35KD、25KD、18. 4KD、 14. 4KD。 專(zhuān)利
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。 實(shí)施例1甲型H1N1流感病毒HA截短蛋白基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建 BamHI及Sail酶切PUC57-HA截短蛋白和載體pGEX-6P-1，回收HA截短蛋白基因
和載體pGEX-6p-l ;然后用T4DNA ligase連接，22度水浴1小時(shí)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rossetta
感受態(tài)細(xì)胞，37— C培養(yǎng)，從中隨機(jī)挑選多個(gè)單菌落，分別放入LB液體培養(yǎng)基中37t:培養(yǎng)5小時(shí)后，菌體0D值約0. 6時(shí)加IPTG至終濃度lmM，經(jīng)小量表達(dá)鑒定，挑取陽(yáng)性克隆。
實(shí)施例2甲型H1N1流感病毒HA的大量誘導(dǎo)表達(dá)和蛋白純化
pGEX-6p-l-HA截短蛋白在大腸桿菌Rosetta中表達(dá)，克隆接種至3ml含有l(wèi)OOug/ ml氨芐青霉素的LB緩沖液，37t:，過(guò)夜，220rpm;將過(guò)夜培養(yǎng)物1 : IOO稀釋至IL含有 100ug/ml氨芐青霉素的LB緩沖液，37。C，220rpm，培養(yǎng)5h ;加入終濃度為0. ImM的IPTG， 22。C，180rpm，繼續(xù)培養(yǎng)22h ;以8000g， 15min， 4°C離心收菌；菌體用50mM Tris-Cl， 200mM NaCl pH8.0懸起至25ml，加入5mg溶菌酶，RT，O. 5h ;用超聲破碎儀超聲至溶液澄清， 12000rpm， 20min離心3次；將上清液使用GE healthcare的Glutathione-S印harose4B柱 料純化，得到純化融合蛋白。PSP酶切GST標(biāo)簽，柱料純化，得到除去標(biāo)簽的HA截短蛋白。
實(shí)施例3甲型H1N1流感病毒抗體-ELISA診斷試劑盒構(gòu)成
1. 1包被抗原的微孔板(8孔X 12條X 1塊)
1. 2HRP標(biāo)記抗人IgGl瓶(120ul/瓶)
1. 325倍洗滌液濃縮液1瓶(20m1/瓶)
1. 4稀釋液2瓶(20m1/瓶)
1. 5底物液1瓶(10m1/瓶)
1. 6終止液1瓶(10m1/瓶) 實(shí)施例4甲型H1N1流感病毒抗體ELISA檢測(cè)操作步驟
1)從4t:冰箱中取出試劑盒，平衡各組分至室溫。 2)取預(yù)包被的微孔條板(根據(jù)標(biāo)本多少，可拆開(kāi)分次使用)，除空白對(duì)照孔外，每
孔加入以樣品稀釋液i : 40稀釋的待檢樣品，每孔加iooui，同樣i : 40稀釋對(duì)照血清，設(shè)
陽(yáng)性對(duì)照2 L陰性對(duì)照2 L空白孔不加，輕輕振勻孔中樣品(勿溢出)，置37t:溫育1小時(shí)。 3)甩掉板孔中的溶液，用洗滌液洗板3次，200u1/次，每次靜置3分鐘倒掉，最后 一次拍干。 4)每孔加酶標(biāo)二抗100ul，置37。C溫育30分鐘。 5)洗滌4次，200ul/次，每次靜置3分鐘倒掉，最后一次拍干。 6)每孔加底物90ul ，室溫避光顯色(30分鐘以?xún)?nèi))。 7)每孔加終止液50ul， 15分鐘內(nèi)測(cè)定結(jié)果。
權(quán)利要求
一種體外評(píng)價(jià)針對(duì)甲型H1N1流感病毒抗體效價(jià)的檢測(cè)方法的建立。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲型H1N1流感病毒，其特征是，包括但不限于活體甲型H1N1 流感病毒的全病毒顆粒、滅活的甲型H1N1流感病毒的全病毒顆粒病毒顆粒的部分結(jié)構(gòu)、重 組甲型H1N1包膜蛋白及重組甲型H1N1非結(jié)構(gòu)蛋白。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體，其特征是，包括但不限于活體甲型H1N1流感病毒的全 病毒顆粒、滅活的甲型H1N1流感病毒的全病毒顆粒病毒顆粒的部分結(jié)構(gòu)、重組甲型H1N1包 膜蛋白及重組甲型H1N1非結(jié)構(gòu)蛋白作為抗原通過(guò)某些途徑進(jìn)入宿主后產(chǎn)生的抗抗原的免 疫球蛋白。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征是，基于免疫學(xué)方法建立包括但不限于免 疫比濁法以及酶聯(lián)免疫(ELISA)法的免疫學(xué)方法檢測(cè)樣品中抗H1N1的抗體效價(jià)的方法。
全文摘要
本發(fā)明屬于人畜共患病研究領(lǐng)域，涉及一種人畜共患病的鑒別診斷方法。選擇了公開(kāi)的甲型H1N1加利福尼亞病毒株(A/California/08/2009(H1N1))cDNA序列中HA基因?yàn)檠芯績(jī)?nèi)容，首先根據(jù)結(jié)構(gòu)生物學(xué)軟件分析出HA蛋白漏在包膜外部分的序列，再根據(jù)抗原性分析，選出免疫原性比較高的部分，通過(guò)基因合成方法獲得基因片段構(gòu)建原核表達(dá)載體pGEX-6P-1-HA；將陽(yáng)性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中得到重組菌株(Escherichia coli BL21 Rosseta/pGEX-6P-1-HA截短蛋白)；通過(guò)多種層析方法獲得純化后的H1N1的HA截短蛋白，并利用所述的表達(dá)蛋白建立酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)間接法實(shí)驗(yàn)原理評(píng)價(jià)病人體內(nèi)因?yàn)榱鞲胁《靖腥净蛞呙缑庖弋a(chǎn)生的抗體效價(jià)。
文檔編號(hào)G01N33/569GK101710119SQ20091027220
公開(kāi)日2010年5月19日 申請(qǐng)日期2009年9月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月25日
發(fā)明者華權(quán)高, 沈鶴霄 申請(qǐng)人:武漢華美生物工程有限公司