活血化瘀類中藥制劑生物效價測定法
【專利摘要】本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術領域，具體為一種活血化瘀類中藥制劑生物效價測定方法，包括如下步驟：（1）、選擇家兔或貓，20%烏拉坦麻醉，頸總動脈插管間斷取血，用3.8%枸櫞酸鈉抗凝；（2）、制備富血小板血漿PRP及貧血小板血漿PPP：800r/min，離心8min，取上清液，即為PRP，余下部分再以3000r/min，離心10min，取上清液即為PPP，PRP制備好1h內使用。本發(fā)明方法經(jīng)7種中藥制劑多批次方法學驗證，本法重現(xiàn)性更好，可用于對活血化瘀類中藥制劑生物效價測定，以達到綜合評價和控制此類產(chǎn)品質量的目的。
【專利說明】
活血化瘀類中藥制劑生物效價測定法
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術領域，具體為一種活血化瘀類中藥制劑生物效價測定方法。
【背景技術】
[0002] 中藥質量標準和含量測定方法具有很大的局限性，未能達到中藥質量標準的最終 目的，也不符合中醫(yī)的整體思想。首先，目前的中藥質量標準在很大程度上是通過測定某一 個或某幾個有效成分的含量來對中藥的質量加以控制，且該指標成分不一定是該藥品的藥 效成分或主要藥效成分，即使為主要藥效成分，其低微的含量限度與臨床有效劑量間缺乏 相關性，因而該指標成分測定也不一定能代表總體生物活性。最為關鍵的是對于組成藥物 多、成分極其復雜的中藥制劑，很難用其中一味藥的某個化學成分的作用來闡述其藥效。
[0003] 其次，中成藥在批準上市前新藥研究階段雖然經(jīng)過主要藥效學試驗和臨床研究， 研究結果表明藥品具有有效性，但藥效學研究和臨床研究時樣品的代表性、可靠性以及中 藥活性成分的可變性，不能保證每批產(chǎn)品是否仍具有藥效作用，其重現(xiàn)性一般未經(jīng)驗證。
[0004] 中藥制劑在生產(chǎn)過程中原料來源發(fā)生改變時、在考慮改進工藝時、在考核產(chǎn)品穩(wěn) 定性時，一般對生物活性可能發(fā)生的變化考慮甚少，認為只要滿足目前的藥品標準即可。長 此下去，某些藥品雖然仍符合目前的藥品標準，生物活性必然也會發(fā)生很大變化。
[0005] 因此，理化分析方法和"生物活性效價測定"方法的結合能夠通過綜合和分析的方 法達到全面控制中藥注射劑質量的目的。
[0006] 活血化瘀中藥是指以疏通血脈，祛除血瘀為主要功效的藥物，用于治療血瘀癥。血 瘀是由于某些功能障礙導致循環(huán)障礙而形成的某些病理狀態(tài)和臨床表現(xiàn)，活血化瘀則是針 對這些血瘀癥狀提出的治療方案?；钛鲋兴幫瑯哟嬖谥R床藥效與化學成分不一致的 問題。但目前還沒有確切的生物效價測定方法用于其質量控制?，F(xiàn)代藥理學認為，活血化瘀 中藥具有抗凝血、抗血小板聚集與黏附、抗血栓、改善血流動力學、改善微循環(huán)等方面的作 用。因此，活血化瘀中藥的生物效價測定方法擬這幾方面入手，建立一種簡便快捷、重復性 好、又能控制此類藥物質量的方法。
[0007] 已有的文獻報道活血化瘀類中藥的藥效學試驗方法主要有:體外或體內血栓形成 試驗，主要考察形成血栓后腦、主動脈、冠動脈，下腔靜脈、耳靜脈等部位的血栓重量、腦血 管通透性、染色面積，或者血栓形成后死亡率，還有考察纖溶酶活力、凝血時間、血小板凝聚 時間等方法。此類試驗均為藥效學研究報道，未進行系統(tǒng)的方法學驗證，也未對試驗條件進 行嚴格控制，重復性差，不能作為生物效價的質量控制手段。

【發(fā)明內容】

[0008] 考察了多種試驗方法后，本技術方案最終選定重復性比較好的體外血小板聚集曲 線的評價方法，并從實驗動物本身、血小板數(shù)、時間、誘導劑濃度等多種因素進行驗證，建立 靈敏快捷、重復性好的活血化瘀類中藥的生物學效價檢測方法。
[0009] 本發(fā)明是采用如下技術方案實現(xiàn)的： 一種活血化瘀類中藥制劑生物效價測定法，包括如下步驟： (1 )、選擇家兔或貓，20%烏拉坦麻醉，頸總動脈插管間斷取血，用3.8%枸櫞酸鈉抗凝;血 液與抗凝劑之比為9:1。
[001 0] (2)、制備富血小板血衆(zhòng)PRP及貧血小板血衆(zhòng)PPP: 800r/min，離心8min，取上清液， 即為PRP，余下部分再以3000r/min，離心10min，取上清液即為PPP，PRP制備好lh內使用； (3) 、制得的貓或家兔的PRP及PPP，用200ul的PPP空白設置100%聚集，取PRP及一定濃度 的待測藥物依次加入測試管中，PRP與藥物體積比為1:10,理論計算血漿中藥物濃度為臨床 人血藥濃度的25倍，生理鹽水作為對照；在37°C恒溫及攪拌條件下加入誘導劑EPI溶液、 ADP溶液或⑶LL溶液25yL，其中，EPI濃度：100μΜ/mL; ADP濃度：50yg/mL; C0LL濃度：100μΜ/ mL； (4) 、描記血小板聚集曲線，記錄最大聚集率和最大聚集時間，比較給藥組與對照組血 小板聚集率，并計算待測藥物對血小板聚集的抑制率；
由于待測藥物對家兔或貓的血小板聚集具有極顯著的抑制作用，則該體外血小板聚集 實驗方法作為活血化瘀中藥注射劑生物活性評價指標。
[0011] 本發(fā)明建立了一種活血化瘀類中藥制劑生物效價測定方法。經(jīng)過對實驗動物的選 擇、血小板數(shù)、反應時間、誘導劑及濃度、穩(wěn)定性等多種因素進行方法學考察和驗證，最終確 定家兔和貓作為血小板供體，較大鼠來源廣，操作方便;利用血小板反應曲線作為定量指 標，避免了單點計算的誤差，指標明確、靈敏度高;增加了C0LL和PRP兩種誘導劑，并確定了 劑量，利于推廣。
[0012] 本發(fā)明方法經(jīng)7種中藥制劑多批次方法學驗證，本法重現(xiàn)性更好，可用于對活血化 瘀類中藥制劑生物效價測定，以達到綜合評價和控制此類產(chǎn)品質量的目的。
【附圖說明】
[0013]圖1表示家兔體外血小板數(shù)對血小板聚集的影響。
【具體實施方式】
[0014] 下面對本發(fā)明的具體實施例進行詳細說明。
[0015] 本實施例從8種活血化瘀類中藥注射劑(紅花注射液、血塞通注射液、刺五加注射 液、燈盞細辛注射液、血栓通注射液、紅花黃色素注射劑、丹參注射液、注射用丹參)主要藥 效學實驗結果及實驗系統(tǒng)的可行性與適用性綜合考慮，本實施例選用:體外血小板聚集和 血凝模型和大鼠體內血小板聚集和血凝模型來篩選探討活血化瘀類中藥質量控制指標。
[0016] 1、材料 1.1、試驗藥物 紅花注射液，血塞通注射液，血栓通注射液，燈盞細辛注射液，刺五加注射液，注射用紅 花黃色素，注射用丹參。
[0017] 肝素注射液:天津生物化學制藥廠，規(guī)格:2mL。
[0018] 1.2、試驗動物 昆明種小鼠300只，雌雄兼用，體重20~24g，來源:解放軍醫(yī)科院實驗動物中心，合格證 號：SCXK(京）2007-004號；昆明種小鼠，雌雄兼用，體重20~24g，來源：山西醫(yī)科大學實驗 動物中心，合格證號：醫(yī)動字第070102;大耳白兔5只，雌雄兼用，體重20~24g，來源北京海 淀興旺動物養(yǎng)殖場，合格證號：SCXK(京)2006-0006號;貓1只，雌，體重3.6kg，來源:市場購 買；大鼠125只，Wistar，雌雄兼用，體重20~24g，來源：中國藥品生物制品檢定所實驗動 物中心，合格證號:SCXK(京)2005-0004號。
[0019] 1.3、試驗試劑 血小板聚集誘導劑：Collagen Reagen(凍干），HELENA LABORATORIES BEAUM0NT，TX，1-08-551188;ADP Reagen (凍干），HELENA LABORATORIES BEAUM0NT，TX，2-08-551189; Epin印hrine Reagent(凍干），HELENA LABORATORIES BEAUM0NT，TX，4-07-551170，ll-08。
[0020]血凝試劑：PT: Thromborels(凍干），Dade behring Marburg GmbH Marburg Germany ,54518629;凝血酶原時間（2mL溶液），太原博奧生物技術有限公司，20090103 JT: Test Thombin Reagent(凍干），Dade behring Marburg GmbH Marburg Germany, 51549626。APTT:Activated Cephaloplastin Reagent(2ml溶液），Dade behring Marburg GmbH Marburg Germany，53719829〇 CaCL2:CaCL2 Calcium chloride Solution,Dade behring Marburg GmbH Marburg Germany，53689436。
[0021 ]血凝試劑質控品：Dade Ci-Trol 1 normal range，Dade behring Marburg GmbH Marburg Germany，54814127，2010-10-03〇
[0022] 3.2%枸櫞酸鈉一次性真空采血管:江蘇康健醫(yī)療用品有限公司，08 111 8。
[0023]檸檬酸鈉(二級）：北京化工廠，741019。
[0024] 1.4、試驗儀器 AggRAM血小板聚集儀;SysMex CA-50自動血液凝固分析儀;KDC-1042低速離心機，科大 創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司。
[0025] 2、方法與結果 2.2、體外抗血小板聚集模型 家兔(貓、豚鼠），20%烏拉坦麻醉，頸總動脈插管間斷取血，用3.8%的枸櫞酸鈉抗凝(血 液與抗凝劑之比為9:1 )，制備富血小板血漿(PRP)及貧血小板血漿(PPP):800r/min，離心 8min，取上清液，即為PRP，余下部分再以3000r/min，離心10min，取上清液即為PPP，PRP制備 好lh內使用。
[0026] 制得的貓或家兔的PRP及PPP，用200燦的PPP空白設置100%聚集，取PRP 200燦 及一定濃度的待測藥物2〇tiL(對照：生理鹽水)依次加入測試管中（PRP與藥物體積比為1: 10,理論計算血漿中藥物濃度為臨床人血藥濃度的25倍），在37°C恒溫及攪拌條件下加入 誘導劑EPI溶液、ADP溶液或⑶LL溶液(EPI: 100yM/mL;ADP:50yg/mL;C0LL: 100yM/mL)25yL， 描記血小板聚集曲線，記錄最大聚集率和最大聚集時間，比較給藥組與對照組血小板聚集 率，并計算藥物對血小板聚集的抑制率。
[0028] 2.2.1、試驗系的考察 (1)實驗動物及誘導劑劑量的選擇 選用不同的實驗動物(家兔、貓和豚鼠）按上述實驗方法制的PRP，加入不同劑量的血小 板聚集試劑(ADP、COLL、EPI)進行血小板聚集實驗。
[0029] 實驗結果（表1)顯示:豚鼠血漿RP對血小板誘導劑ADP、EPI、⑶LL均不敏感，最大 血小板聚集率很低;貓和家兔血漿PRP對ADP、C0LL較敏感，而對EPI不敏感，聚集率較低;ADP 時對血小板聚集達到最大。因此，選擇貓和家兔作為 實驗動物選擇，選擇ADP( 50^/1^)25^1^，C0LL( lOOuM/mLWSuL作為實驗誘導劑參考劑量。 [0030]表1實驗動物及誘導劑劑量考察實驗結果 (*Ρ〈0·05，**Ρ〈0·01)
(2 )血小板數(shù)對血小板聚集的影響的考察 按上方法將離心制得的家兔PRP不同倍數(shù)稀釋，測定其的血小板數(shù)，并加入ADP: 50ug/ ml X 25yL，COLL: 100uM/ml X 25yL對其進行血小板聚集考查。
[0031 ]表2家兔體外血小板數(shù)對血小板聚集的影響 (*Ρ <0·05，**Ρ〈0·01)
從表2和圖1得出：血小板數(shù)大于180X 109/ L時，誘導劑所致的最大血小板聚集率相 對穩(wěn)定，易于考察藥物對血小板聚集的影響。因此，實驗得到的PRP血小板數(shù)應大于180 X 109/L〇
[0032] (3)試驗條件的確定 實驗選擇貓和家兔作為實驗動物;PRP血小板數(shù)控制在大于180X 109/L;選擇ADP(5〇ti 8/11^)25仙，0)1^(100_/1^)25仙作為實驗誘導劑參考劑量。
[0033] 2.2.2、貓體外抗血小板聚集模型試驗結果 結果顯示(表3):注射用丹參2mg/mL 1個批號樣品（F-1)對ADP誘導的貓血小板聚集均 有極顯著的抑制作用。
[0034] 注射用丹參2mg/mL 1個批號樣品（F-1)，血栓通注射液0.875mg/mL 1個批號樣品 (B-1)，紅花注射0.05mg/mL不同廠家的6個批號樣品中3個批號樣品（H-5、H-7、Η-10 )對 COLL誘導的貓血小板聚集有顯著的抑制作用。
[0035]表3貓體外抗血小板聚集模型實驗結果 (*Ρ <0·05，**Ρ〈0·01)
2.2.3、家兔體外抗血小板聚集模型試驗結果 結果顯示(表4):血塞通注射液0.2mg/mL不同廠家的3個批號樣品中2個批號樣品(A-1、 A-3)，紅花注射液0.05mg/mL不同廠家的14個批號樣品中9個批號樣品(H-l，H-3、H-5、H-7、 H-4、H-8、H-11、H-12、H-13)對ADP誘導的家兔血小板聚集均有極顯著的抑制作用。
[0036] 注射于丹參2mg/mL 1個批號樣品(F-1)，燈盞細辛注射液0.45mg/mL 1個批號樣品 (C-1)，血塞通注射液0.2mg/mL不同廠家的3個批號樣品，紅花注射液0.05mg/mL不同廠家 的14個批號樣品(H1-14)對C0LL誘導的家兔血小板聚集均有極顯著的抑制作用。
[0037]表4家兔體外抗血小板聚集模型實驗結果 (*Ρ <0·05，**Ρ〈0·01)
2.3、體外抗凝血模型 家兔(貓），20%烏拉坦麻醉，頸總動脈插管間斷取血，用3.8%枸櫞酸鈉抗凝(血液與抗凝 劑之比為9:1)，制備貧血小板血漿(PPP):3000r/min離心10min，取上清液即為PPP，PPP制 備好2h內使用或-20 °C凍存，復融后2h內使用，盡量避免反復凍融。
[0038]取上述貓或家兔PPP加入一定濃度的待測藥物或生理鹽水混勻(PPP與藥物體積比 為1:10，理論計算血漿中藥物濃度:除刺五加注射液為臨床人血藥濃度的5倍，燈盞細辛注 射液為12.5倍外，其余藥物劑量均為臨床人血藥濃度的25倍），應用CA-50型自動血液凝固 分析儀及試劑測定凝血酶原時間(PT)，凝血酶原時間（TT)，部分激活促凝血酶時間(APTT)， 計算出給藥組和對照組PT、TT、APTT的平均值，組間比較用t檢驗。
[0039] PT用于檢測對外源凝集途徑的作用;APTT用于檢測對內源凝集途徑的作用；TT用 于檢測對纖維形成的作用。
[0040] 2.3.1、實驗動物及測試指標的選擇 按上述實驗方法，制得不同動物的貧血小板血漿(PPP)，進行測定。
[0041 ]實驗結果得出（表5):對于動物貓來說，TT值均不凝，不適宜作為測試試劑;PT值相 對穩(wěn)定，相對標準偏差較小;APTT值相對標準偏差值較大。對于動物家兔來說，TT和PT值相 對穩(wěn)定，相對標準偏差較小;APTT值相對標準偏差值稍大。
[0042]表5實驗動物及測試指標選擇實驗結果
2.3.2、 血漿穩(wěn)定性考察 按上述實驗方法，將離心所得的家兔血漿分裝凍存，在不同時間段測定PT、TT、APTT值， 考察血漿的穩(wěn)定性。
[0043]結果得出（表6):貧血小板血漿PPP在2h內穩(wěn)定，且-20°C凍存條件下6天以內穩(wěn) 定。因此，實驗過程中應控制好血漿的測定時間；實驗還發(fā)現(xiàn)反復凍融的血漿凝血時間明顯 延長，因此實驗過程中要避免血漿反復凍融。
[0044] 表6血漿穩(wěn)定性考察結果
2.3.3、 貓體外抗凝血模型實驗結果 結果顯示(表7):紅花注射液0.05mg/mL 6個批號樣品中1個批號樣品(H-2)可使貓體外 血漿PT不凝血。
[0045] 肝素注射液62.5單位/mL，紅花注射液0.05mg/mL 6個批號樣品中3個批號樣品汨- 2、H-6、H-7 )可延長貓體外血衆(zhòng)APTT凝血時間。
[0046]表7貓體外抗凝血模型實驗結果 (*Ρ <0·05，**Ρ〈0·01)
2.3.4、家兔體外抗凝血模型實驗結果 結果顯示(表8):肝素注射液62.5單位/mL可明顯延長家兔體外血漿PT的凝血時間。 [0047] 血塞通注射液0.2mg/mL 3個批號樣品中1個批號樣品（A-1)，紅花注射液0.05mg/ mL 10個批號樣品中2個批號樣品2(H-2、H-4)可明顯延長家兔體外血漿TT的凝血時間。 [0048] 血塞通注射液0.2mg/mL 3個批號樣品中1個批號樣品（A-1)，燈盞細辛注射液 0.45mg/mL 1個批號樣品（C-1)可明顯延長家兔體外血衆(zhòng)APTT的凝血時間。
[0049]表8家兔體外抗凝血模型實驗結果 (*Ρ <0·05，**Ρ〈0·01)
2.4、大鼠體內抗血小板聚集模型 大鼠體重200~250g，雌雄各半，隨機分組，每組4只，腹腔給藥4天，lmL/100g，1次/天 (臨床人用劑量的30倍），末次給藥lh后用20%烏拉坦腹腔注射麻醉后，3.2%枸櫞酸鈉一次性 真空采血管腹腔主動脈取血，制備富血小板血漿(PRP)和貧血小板血漿(PPP)。
[0050] 血小板聚集儀打開預熱30min后，用PPP空白設置100%聚集。每次取PRP 200燦加 入誘導劑ADP溶液或⑶LL溶液(ADP: SOyg/mL; COLL: 100uM/ml )25燦，測定血小板聚集率，記 錄最大聚集率和最大聚集時間，計算方法同前。
[0051 ] 2.4.1、大鼠體內抗血小板聚集實驗結果 實驗結果顯示(表9)，血塞通注射液200mg/kg不同廠家3個批號樣品中1個批號樣品(A-1)，對ADP和C0LL誘導的大鼠體內血小板聚集均有顯著的抑制作用。
[0052] 紅花注射液5g/kg不同廠家5個批號樣品中2個批號樣品(H-5，H-3)對ADP誘導的大 鼠體內血小板聚集有顯著的抑制作用。紅花注射液0.84g/kg 1個批號(H-3 )對ADP誘導的大 鼠體內血小板聚集有顯著的抑制作用。
[0053]表9大鼠體內抗血小板聚集 (*Ρ <0·05，**Ρ〈0·01)
2.5、大鼠體內抗凝血模型 取2.4中PPP應用CA-50型自動血液凝固分析儀及試劑，測定凝血酶原時間(PT)，凝血酶 原時間（TT)，部分激活促凝血酶時間（APTT)，計算出給藥組和對照組PT、TT、APTT的平均 值，統(tǒng)計方法同前。
[0054] 2.5.1、大鼠體內抗凝血模型實驗結果 實驗結果顯示(表10)，注射用丹參200mg/kg 1個批號(F-1)，血塞通注射液200mg/kg 3 個批號樣品中2個批號樣品(A-3、A-2)可明顯延長TT，APTT的凝血時間。
[0055] 紅花注射液5g/kg不同廠家5個批號樣品中2個批號樣品可明顯延長TT的凝血時 間。
[0056] 紅花注射液5g/kg不同廠家5個批號樣品中1個批號樣品(H-6)、注射用紅花黃色素 40mg/kg 1個批號樣品(E-1)可明顯延長APTT的凝血時間。
[0057] 紅花注射液(H_3)5g/kg(5g/kg、2 · 5g/kg、0.84g/kg)發(fā)現(xiàn) 5g/kg、0.84g/kg 對 ADP 誘 導的大鼠體內血小板聚集有顯著的抑制作用;可明顯延長TT的凝血時間，而2.5g/kg抗凝血 作用較差。
[0058]表10大鼠體內抗血凝模型 (*Ρ <0·05，**Ρ〈0·01)
3.3、結論 考察了不參與凝血酶作用或不含溶栓酶類的8種活血化瘀類中藥注射劑，家兔和貓體 外血小板聚集和體外凝血，大鼠體內血小板和凝血模型，得出如下結論： 體外血小板聚集實驗結果受實驗動物本身、血小板數(shù)、時間、誘導劑濃度等多種因素影 響?？紤]到實驗的經(jīng)濟，簡單，準確，體外血小板聚集實驗可以作為活血化瘀中藥注射劑生 物活性評價指標。
[0059] 凝血試驗實驗過程中發(fā)現(xiàn)TT與APTT值的測定影響因素較多，導致對實驗結果影響 較大，重復性較差。還有待進一步考察其精密度，重現(xiàn)性及專屬性等。
[0060] 大鼠體內血小板聚集及血凝法，操作復雜，影響因素多（實驗動物、血漿血小板數(shù)、 時間、誘導劑濃度等），量效關系不確切，生物誤差較大，不宜作為生物活性測定指標。
[0061] 最后所應說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案而非限制，盡管參 照本發(fā)明實施例進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，對本發(fā)明的技術方案 進行修改或者等同替換，都不脫離本發(fā)明的技術方案的精神和范圍，其均應涵蓋本發(fā)明的 權利要求保護范圍中。
【主權項】
1. 一種活血化瘀類中藥制劑生物效價測定法，其特征在于:包括如下步驟： (1 )、選擇家兔或貓，20%烏拉坦麻醉，頸總動脈插管間斷取血，用3.8%枸櫞酸鈉抗凝； (2) 、制備富血小板血漿PRP及貧血小板血漿PPP: 800r/min，離心8min，取上清液，即為 PRP，余下部分再以3000r/min，離心10min，取上清液即為PPP，PRP制備好lh內使用； (3) 、制得的貓或家兔的PRP及PPP，用200仙的PPP空白設置100%聚集，取PRP及一定濃度 的待測藥物依次加入測試管中，PRP與藥物體積比為1:10，理論計算血漿中藥物濃度為臨床 人血藥濃度的25倍，生理鹽水作為對照；在37°C恒溫及攪拌條件下加入誘導劑EPI溶液、 ADP溶液或⑶LL溶液25yL，其中，EPI濃度：100μΜ/mL; ADP濃度：50yg/mL; COLL濃度：100μΜ/ mL； (4) 、描記血小板聚集曲線，記錄最大聚集率和最大聚集時間，比較給藥組與對照組血 小板聚集率，并計算待測藥物對血小板聚集的抑制率；由于待測藥物對家兔或貓的血小板聚集具有極顯著的抑制作用，則該體外血小板聚集 實驗方法作為活血化瘀中藥注射劑生物活性評價指標。2. 根據(jù)權利要求1所述的活血化瘀類中藥制劑生物效價測定法，其特征在于:步驟（1) 中，血液與抗凝劑之比為9:1。
【文檔編號】G01N33/15GK105866361SQ201610315823
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月12日
【發(fā)明人】樸晉華, 董培智, 郭景文, 張志偉
【申請人】山西省食品藥品檢驗所