一種D-氨基酸脫氫酶基因bll6812S及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種來源于高效固氮大豆慢生根瘤菌的D-氨基酸脫氫酶基因bll6812S及其制備方法和應用，其核苷酸序列如SEQ?ID?No1所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ?ID?No2所示。該D-氨基酸脫氫酶基因bll6812S是將來源于高效固氮大豆慢生根瘤菌的D-氨基酸脫氫酶基因bll6812按照植物偏愛密碼子進行改造，利用基因合成方法制備而成。將所述bll6812S基因轉(zhuǎn)化擬南芥獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥，該轉(zhuǎn)基因擬南芥在抗草甘膦的性能明顯優(yōu)于野生型擬南芥，可應用于抗草甘膦作物育種中。
【專利說明】—種D-氨基酸脫氫酶基因bl I6812S及其制備方法和應用
【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明屬于作物遺傳育種領域，具體涉及一種來源于高效固氮大豆慢生根瘤菌的D-氨基酸脫氫酶基因W16812S及其制備方法和應用。
【背景技術(shù)】[0002]草甘膦(Glyphosate)又稱:鎮(zhèn)草寧、農(nóng)達(Roundup)等，因理化性質(zhì)穩(wěn)定并具有高效、廣譜、低毒、低殘留、易分解、不破壞土壤環(huán)境和對大多數(shù)植物具有強滅生性等優(yōu)點，自1971年孟山都公司開發(fā)成功以來，現(xiàn)已成為全球銷售量最大的除草劑。因此，草甘膦也成為抗除草劑轉(zhuǎn)基因作物研究的首選對象，抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物是目前全球播種面積最大的轉(zhuǎn)基因作物。
[0003]草甘膦的毒性作用機理是競爭性抑制莽草酸途徑中的5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-勝酸合成酶(5-enolpyruvyl shikimate-3-phosphate synthase,簡稱 EPSPS),導致分枝酸合成受阻，阻斷芳香族氨基酸和一些芳香化合物的生物合成，從而擾亂了植物體正常的氮代謝而使雜草死亡。目前，抗草甘膦植物基因工程主要采用三種方法。第一，植物細胞通過EPSPS的超常表達對一定劑量的草甘膦產(chǎn)生抗性。第二，植物細胞通過EPSPS基因的作用活性位點變化對草甘膦產(chǎn)生抗性，即通常所說的EPSPS抗草甘膦基因。利用這種作用機理使植物具有草甘膦抗性的常用基因主要是CP4-EPSPS和aroA兩種。第三，導入編碼草甘膦降解相關基因，如草甘膦氧化還原酶基因(Glyphosate oxidoreductase, G0X),和草甘勝N-乙酸轉(zhuǎn)移酶(glyphosateNacetyhransferase)基因，即GAT基因。
[0004]目前商品化的抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物幾乎全部為美國孟山都公司產(chǎn)品(商品名RoundupReady)，且主要采用過表達對草甘膦低敏感的CP4_EPSPs提高作物對草甘膦的抗性，然而這種抗性機制不能消除植物體內(nèi)吸收的草甘膦，且植物對草甘膦代謝極為緩慢，造成草甘膦在植物體內(nèi)不斷積累，這可能會導致兩方面的危害:一是對植物繁育器官的造成損害，這種損害表現(xiàn)為授粉不良及果實敗育以致產(chǎn)量減少。有研究表明第一代抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆與非轉(zhuǎn)基因大豆相比產(chǎn)量降低了 6.7%【Duke,和Powle, Pest Manag.Sc1.，2008，64:319-325】；二是對食用者的身體健康可能會造成一定的潛在危害。最近的研究表明，長期喂食添加有草甘膦的飼料能夠?qū)е吕鲜筇汉蛻言械哪甘笤S多機能出現(xiàn)異?！綝aruich等，Environ.Res.，2001,85:226-231】。另外，草甘膦會干擾老鼠細胞產(chǎn)生睪酮的酶【W(wǎng)aiIh等，Environ.Health.Persp., 2000, 108:769-776.】和人類胎盤細胞中人雌激素合成酶【Richard等Environ.Health.Persp., 2005,, 13:716.】。這也是人們質(zhì)疑抗草甘膦轉(zhuǎn)基因食品安全性的主要原因之一，因而開發(fā)無/低草甘膦殘留的抗性機制是十分必要的。
[0005]現(xiàn)有的文獻及科學研究中關于D-氨基酸在抗草甘膦的應用報道很少。氨基酸序列同源性分析表明，D-氨基酸氧化酶(D-amino acid oxidase,簡稱DAA0, ECl.4.3.3)與甘氨酸氧化酶(glycine oxidase,簡稱GO, ECl.4.3.19)和單體肌氨酸氧化酶(monomeric sarcosine oxidase, ECl.5.3.1)同屬于谷胱甘妝還原酶家族II成員【Dym和Eisenberg, Protein Sc1.，2001，10:1712-1728】。DAAO 和 GO 都能催化氨基酸氧化脫氨，產(chǎn)生相應的α-酮酸，氨/胺和H202，但兩者底物譜不同。DAAO可催化草甘膦生成氨甲基磷酸(AMPA)和乙醛酸，從而降低草甘膦的毒性。近年來，DAAO被人們應用于創(chuàng)造草甘膦抗性植物研究，但目前沒有關于將D-氨基酸脫氫酶基因應用于培育抗草甘膦植物的相關報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種來源于高效固氮大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium diazoefficiens)的D-氛基酸脫氧酶基因bll6812S及其制備方法和應用。本發(fā)明將來源于高效固氮大豆慢生根瘤菌的D-氨基酸脫氫酶基因(W16812)改造成可在植物中高效表達的D-氨基酸脫氫酶基因(W16812S)，并將該D-氨基酸脫氫酶基因bll6812S轉(zhuǎn)化擬南芥，進而提高轉(zhuǎn)基因擬南芥抗草甘膦的能力，該D-氨基酸脫氫酶基因W16812S對于培育抗草甘膦的植物品種非常重要，具有重要的理論意義和現(xiàn)實意義。
[0007]因此，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之一，在于提供一種來源于高效固氮大豆慢生根瘤菌的D-氨基酸脫氫酶基因W16812S。
[0008]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之二，在于提供所述來源于高效固氮大豆慢生根瘤菌的D-氨基酸脫氫酶基因W16812S的制備方法。
[0009]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之三，在于提供所述來源于高效固氮大豆慢生根瘤菌的D-氨基酸脫氫酶基因W16812S在植物轉(zhuǎn)化中的應用。
[0010]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之四，在于提供所述來源于高效固氮大豆慢生根瘤菌的D-氨基酸脫氫酶基因W1 6812S，在提高植物抗草甘膦性能中的應用及在培育抗草甘膦轉(zhuǎn)基因植物中的應用。
[0011]為了達到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0012]一種來源于高效固氮大豆慢生根瘤菌的D-氨基酸脫氫酶基因W16812S，其核苷酸序列如SEQ ID Nol所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID No2所示。所述D-氨基酸脫氫酶基因W16812S編碼閱讀框有1266bp組成編碼一個421個氨基酸的蛋白質(zhì)。
[0013]本發(fā)明所述的來源于高效固氮大豆慢生根瘤菌的D-氨基酸脫氫酶基因W16812S，采用人工方法合成，即將高效固氮大豆慢生根瘤菌的D-氨基酸脫氫酶基因(bll6812)按照植物偏愛密碼進行改造,利用基因合成法【Xiong et al.,Nucl Acids Res,2004，32: e98】進行化學合成，在保持D-氨基酸脫氫酶基因W16812的氨基酸序列不變的基礎上，設計引物W16812S-1~W16812S-32，并進行PCR擴增合成本發(fā)明的D-氨基酸脫氫酶基因(W16812S)。具體設計的引物如下:
[0014]bll6812S-l:
[0015]GAA, GGA, TCC ATGCCAGAGG GTCGTCACGT CGCTATCATC GGTGCTGGTGCTGTCGGTGTCATCTCCGCT
[0016]bll6812S-2:
[0017]CGATCAGAGT GACACGATGA CCCTCACGCA GAGCCTCGAT AGCGGAGATG ACACCGACAG
[0018]bll6812S-3:
[0019]TCATCGTGTC ACTCTGATCG ACCCAGGTGA GCCAGGTGGT GAGCAGGCTG CTTCCTACGG
[0020]bll6812S-4:
【權(quán)利要求】
1.一種來源于高效固氮大豆慢生根瘤菌的D-氨基酸脫氫酶基因W16812S，其核苷酸序列如SEQ ID Nol所不,其編碼的氨基酸序列如SEQ ID No2所不。
2.如權(quán)利要求1所述的來源于高效固氮大豆慢生根瘤菌的D-氨基酸脫氫酶基因bll6812S的制備方法，其特征在于，將高效固氮大豆慢生根瘤菌的D-氨基酸脫氫酶基因bll6812按照植物偏愛密碼進行改造，利用基因合成法進行化學合成，在保持D-氨基酸脫氫酶基因W16812的氨基酸序列不變的基礎上，設計引物W16812S-1~W16812S-32，進行PCR擴增合成所述的D-氨基酸脫氫酶基因W16812S ;設計的具體引物如下:
3.如權(quán)利要求1或2所述的來源于高效固氮大豆慢生根瘤菌的D-氨基酸脫氫酶基因W16812S在植物轉(zhuǎn)化中的應用。
4.如權(quán)利要求1或2所述的來源于高效固氮大豆慢生根瘤菌的D-氨基酸脫氫酶基因bll6812S在提高植物抗草甘膦性能中的應用。
5.如權(quán)利要求1或2所述的來源于高效固氮大豆慢生根瘤菌的D-氨基酸脫氫酶基因bll6812S在培育抗草甘膦植物中的應用。
【文檔編號】C12R1/41GK103740737SQ201310738841
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2013年12月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月27日
【發(fā)明者】韓紅娟, 姚泉洪, 彭日荷, 朱波, 付曉燕, 薛永, 王波, 田永生, 許晶, 高建杰, 王麗娟, 韓靜, 李振軍 申請人:上海市農(nóng)業(yè)科學院