專利名稱：植物ap1基因的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物AP1基因的新用途，特別涉及植物AP1基因在植物改良中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物是分生組織的產(chǎn)物，分生組織形成的模式?jīng)Q定植物的結(jié)構(gòu)。在胚胎發(fā)生中，被子植物形成兩類頂端分生組織，即根尖分生組織和芽尖分生組織(shoot apicalmeristem，SAM)。根尖分生組織形成初生根和側(cè)根系統(tǒng)，芽尖分生組織在特定的時間和部位分別形成芽分生組織和花分生組織，芽分生組織在葉腋處形成，最終產(chǎn)生葉和莖，花分生組織在花序軸部位產(chǎn)生，形成生殖結(jié)構(gòu)-花。
AP1不僅是一類花分生組織標志基因，同時也是一類花器官標志基因，參與萼片和花瓣的形成。目前已從玉米、水稻、小麥等作物中克隆到AP1的同源基因(UCSD(University of California，San Diego)專利，Attorney DocketNo19452A-002400US)。
擬南芥AP1蛋白含有256個氨基酸，編碼MADS-box轉(zhuǎn)錄因子。其蛋白結(jié)構(gòu)可分為M，K和C域，其中M結(jié)構(gòu)域高度保守，其功能是DNA結(jié)合域，離體條件下AP1通過M域與CArG box(CC(A/T)6GG)基序結(jié)合(Riechmann et al.，Nucl Acids Res，1996，243134-3141)。K結(jié)構(gòu)域與角蛋白keratin的螺旋-螺旋結(jié)構(gòu)域相似，參與蛋白-蛋白相互作用，參與AP1同源二聚體的形成(Riechmann et al.，Proc NatlAcad Sci USA，1996，934793-4798)，AP1的C結(jié)構(gòu)域至少有兩個相互分離的、功能上相互增效的轉(zhuǎn)錄活性域所組成(Cho et al.，Plant Molecular Biology，1999，40419-429)。
AP1在花發(fā)育過程中具有雙重功能，首先，作為花分生組織標志基因，AP1能促進芽分生組織向花分生組織的轉(zhuǎn)變，促進植物提前開花。組成型過量表達擬南芥AP1后，轉(zhuǎn)基因植株的頂芽和側(cè)芽均變成花，且提前開花(Mandel & Yanofsky，Nature，1995，377(12)522-524)。過量表達擬南芥AP1的柑桔能縮短童期，提前開花。另外，AP1也是一個花器官標志基因，對花瓣和萼片的形成起決定作用，ap1突變體花萼轉(zhuǎn)變?yōu)槿~狀，無花瓣，在葉狀花萼的葉腋內(nèi)形成次生花，其形狀同初生花，即花萼轉(zhuǎn)變?yōu)槿~狀，無花瓣(Bowman et al.，Development，1993，119721-743)。
AP1 RNA只在花中測到，根、莖、葉中測不到(Mandel et al.，Nature，1992，360273-277)。在花形成過程中，AP1首先是在幼嫩的花原基和花序分生組織的側(cè)面表達，在內(nèi)兩輪的表達開始下降，最終定位于萼片和花瓣原基(Bowman et al.，Development，1993，119721-743；Gustafson-Brown et al.，cell，1994，76131-143；UCSD Patent，Attorney Docket No19452A-002400US)。
如上所述，在擬南芥中異位表達AP1基因，能使芽分生組織轉(zhuǎn)變?yōu)榛ǚ稚M織，轉(zhuǎn)基因植株的頂芽和側(cè)芽均變成花，并促進植物提前開花。這是以往文獻和專利中已知的AP1基因及其蛋白的功能。
植物生長發(fā)育分為營養(yǎng)生長和生殖生長兩個階段。營養(yǎng)生長與生殖生長之間的平衡是作物高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的前提。在作物生產(chǎn)中，經(jīng)常會遇到營養(yǎng)生長過旺的問題，造成植株徒長，籽粒充實度降低或落花落果嚴重，產(chǎn)量明顯下降，帶來巨大的經(jīng)濟損失。在棉花生產(chǎn)中，徒長嚴重的棉田蕾鈴脫落率可高達80％以上。目前主要通過整枝打杈，去除頂芽、腋芽和營養(yǎng)枝，或人為噴化學藥劑(如縮節(jié)胺)控制營養(yǎng)生長，為生殖生長提供足夠的養(yǎng)分，以減少蕾鈴脫落。整枝打杈需消耗大量勞動力，抗蟲棉大規(guī)模種植后，農(nóng)藥用量和噴藥用工已大大減少，棉田整枝打杈已成為用工最大的作業(yè)，特別是在大量農(nóng)民勞動力外出就業(yè)的情況下顯得尤其突出，目前棉花生產(chǎn)上精細整枝打杈每畝需用工15個，粗放整枝(僅打頂)每畝用工5個，還需結(jié)合化控。除棉花外，番茄、西瓜等作物上的整枝打杈用工也較多。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供植物AP1基因的新用途。
本發(fā)明所提供的植物AP1基因的新用途是利用植物AP1基因抑制植物腋芽萌發(fā)生長和/或使植物頂尖自封頂和/或使植株節(jié)間變短和/或使植物株型緊湊的方法。
本發(fā)明所提供的抑制植物腋芽萌發(fā)生長和/或使植物頂尖自封頂和/或使植株節(jié)間變短和/或使植物株型緊湊的方法，是將植物AP1基因?qū)肽康闹参镏小?br> 所述植物AP1基因來源于擬南芥。擬南芥AP1基因(AtAP1基因)具有序列表中序列1的核苷酸序列。
本發(fā)明的方法適合于雙子葉植物(如棉花，番茄，西瓜等)。
為了使植物AP1基因在植物細胞中，在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上獲得高效表達，在植物AP1基因的5′端連接啟動子，在所述植物AP1基因的3′端連接非編碼區(qū)和終止子形成AP1基因表達盒。
本發(fā)明中，為使AP1基因異位組成型表達，用于驅(qū)動該基因在植物細胞中轉(zhuǎn)錄的啟動子可為組成型表達的花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子或NOS啟動子等。
所述植物AP1基因的3’端非編碼區(qū)包括一個多聯(lián)終止密碼子序列，一個mRNA切割序列和一個mRNA切割后加工序列及多聚腺苷酸化序列。
所述終止子可為胭脂堿合酶(Nos)基因終止子或花椰菜花葉病毒35S終止子(Tnos)或其他基因的終止子。
可使用本領(lǐng)域中公知的方法，將AP1基因插入任何一種可在細菌細胞或植物細胞中自我復制的載體上，例如包括衍生于大腸桿菌的質(zhì)粒載體pUC18、pUC19(Yanisch-perron et al.，Gene 33103-119，1985)，pBlueScriptSK，尤其是植物表達載體pBI101，pBI121，pBI131系統(tǒng)(Jefferson，et al.，EMBO J.163901，1987)及pCamBia系統(tǒng)(Hajdukiewicz et al.，Plant Mol Biol 25989-994，1994；Hiei et al.，The Plant J 6271-282，1994)等。
為了正確地選擇和鑒定被轉(zhuǎn)化的植物細胞，本發(fā)明的上述重組表達載體還含有可選擇標記基因。所使用的選擇標記基因的兩側(cè)可帶有各自的調(diào)節(jié)序列，以促使它們在植物中的表達。適用的選擇標記是本領(lǐng)域內(nèi)公知的。編碼選擇標記的外源基因及其他基因可以包含于同一個表達載體中，或者包含于轉(zhuǎn)化時同時應(yīng)用的不同的載體中。本發(fā)明優(yōu)選的選擇標記基因是NPTII基因，并一同包含于同一個重組表達載體內(nèi)，從而保證了對被轉(zhuǎn)化細胞或植株選擇的可靠性。
本發(fā)明提供的適于在植物細胞中表達的AP1植物表達載體具體可包含1)AP1基因表達盒；a)CaMV 35S啟動子；b)AP1編碼基因(SEQ ID NO1)；c)3’端非編碼區(qū)；d)Nos終止子。
2)pBI121的載體a)NPTII表達盒；b)起始復制子及與植物轉(zhuǎn)化相關(guān)的T-DNA左右邊界序列等功能結(jié)構(gòu)。本發(fā)明優(yōu)選的植物AP1基因表達載體是pAP1。
將攜帶外源基因的重組載體導入宿主植物或其細胞內(nèi)的許多方法都是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。這些方法包括但并不僅限于1)農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化法(Agrobacterium-mediated transformation)；2)物理法，如基因槍法(Particlebombardment或Particle gun或Gene gun)、電擊法(Electroporation)、顯微注射法(Microinjection)、超聲波法(Ultrasonic)、激光微束法(Laser microwave)、碳化硅纖維介導法(Silicon carbide fiber)、電泳法(Electrophoretictransfection)等；3)化學法，如PEG介導的轉(zhuǎn)化法、脂質(zhì)體介導轉(zhuǎn)化法等；4)種質(zhì)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化法，如花粉介導法、花粉管通道法(子房注射法)、浸泡法等；5)以花椰菜花葉病毒(CaMV)、雙生病毒(Geminiviruses)或RNA病毒等病毒載體所介導的轉(zhuǎn)化法等。最好通過花粉管通道法將攜帶有植AP1基因的重組載體導入棉花。
本發(fā)明利用花粉管通道法將攜帶有植物AP1基因的重組載體轉(zhuǎn)化棉花、利用農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化番茄，結(jié)果表明擬南芥AP1在異位組成型表達后，除了具有使芽分生組織轉(zhuǎn)變?yōu)榛ǚ稚M織、促進早開花的功能外，還具有抑制腋芽萌發(fā)生長、無營養(yǎng)枝，頂尖自封頂，植株和果枝節(jié)間變短、株型緊湊等新功能。
本發(fā)明利用AP1的新功能，從分子水平上對營養(yǎng)生長和生殖生長進行調(diào)控，通過基因工程手段培育不需整枝打杈、株型緊湊的棉花，具有以下優(yōu)點1.不需整枝打杈，大大減少用工量，降低作物生產(chǎn)的投入；2.可采取適當?shù)拿苤泊胧?，提高棉花單產(chǎn)；3.解放農(nóng)村勞動力，增加農(nóng)民收入。因而可帶來巨大的經(jīng)濟和社會效益。本發(fā)明的方法同樣可用于其它作物，如番茄以及需要控制頂芽和腋芽生長的大田作物、林木、瓜果、蔬菜等。


圖1為植物表達載體pAP1的構(gòu)建示意2為pAP1的酶切鑒定圖譜圖3為轉(zhuǎn)基因棉花的PCR檢測圖譜圖4為轉(zhuǎn)基因棉花的Southern雜交圖譜圖5為轉(zhuǎn)基因棉花的表型具體實施方式
實施例1、利用擬南芥AP1基因培育無營養(yǎng)枝，腋芽短小或枯萎；和/或頂尖自封頂；和/或莖和果枝節(jié)間變短；和/或株型緊湊的轉(zhuǎn)基因棉花一、擬南芥AP1基因的克隆1、根據(jù)擬南芥AP1的基因序列設(shè)計引物At.AP1 55’gca atgggaaggggtagggttca3’(框內(nèi)堿基為Pst1識別序列)A.tAP1 35’acg tcatgcggcgaagcagcc3’(框內(nèi)堿基為Hpa1識別序列)為構(gòu)建載體方便，在At.AP1 5和At.AP1 3的5’端和3’端分別加入了Pst1和Hpa1酶切位點。
2、擬南芥RNA提取(1)取50mg擬南芥的花瓣組織，立即加入1ml TRIZOL溶液，充分研磨后轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中。
(2)室溫放置2min，4℃10000×g離心10min。
(3)取上清轉(zhuǎn)移到新離心管中，加入200μl氯仿，充分混勻。
(4)室溫放置2min，4℃12000×g離心15min。
(5)將上清液轉(zhuǎn)移到新離心管中，加入500μl異丙醇，充分混勻。
(6)室溫放置10min，4℃12000×g離心10min。
(7)棄上清，沉淀用75％乙醇洗滌一次，室溫放置10min，使乙醇揮發(fā)，用水溶解RNA沉淀。
3、RT-PCR克隆擬南芥AP1基因(1)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(根據(jù)TaKaRa公司的RT-PCR試劑盒說明進行操作)按下列組成在反應(yīng)管中配制反應(yīng)液10×RNA PCR緩沖液2μlMgCl2(25mmol/L) 4μldNTP混合物(各10mmol/L) 2μlAMV Reverse Transcriptase XL(5U/μl) 1μlRNase Inhibitor(40U/μl) 0.5μlOligo(dT)20Primer(2.5μmol/L)1μl擬南芥花瓣總RNA 2μlRNase Free dH2O 7.5μl總體積 20μl按以下條件進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)30℃10min；50℃30min；95℃5min；5℃5min。
其中，10×RNA PCR緩沖液，AMV Reverse Transcriptase XL和Oligo(dT)20Primer均為試劑盒中所帶溶液。
(2)PCR反應(yīng)反應(yīng)體系為10×LA PCR buffer5μldNTP混合物(每種2.5mmol/L)5μlAt.AP13(10μmol/L) 1μlAt.AP15(10μmol/L) 1μlLA Taq(5U/μl) 0.5μl
擬南芥花RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄的cDNA 1μldH2O 36.5μl總體積 50μl其中，LA Taq和10×LA PCR buffer購自TaKaRa公司。
反應(yīng)條件為94℃變性4min；94℃45sec，60℃45sec，72℃1min，30個循環(huán)；72℃延伸5min。
4、中間載體pMD-AP1的構(gòu)建(1)凍融法回收步驟3得到的PCR產(chǎn)物，連接到pMD18-T-vector(購自TaKaRa公司)。
連接體系為pMD18-T-vector0.5μlSolution 15μl回收產(chǎn)物 2μlH2O 2.5μl總體積10μl其中，Solution 1為購實pMD18-T-vector時配帶產(chǎn)品。
16℃水浴鍋中反應(yīng)1h。
(2)熱擊法轉(zhuǎn)化DH5a，篩選鑒定陽性克隆(含有攜帶目的基因的pMDAP1質(zhì)粒)。
(3)陽性克隆經(jīng)上海生物工程有限公司測序，證明得到的基因具有序列表中序列1的核苷酸序列，是擬南芥的AP1基因。
二、植物表達載體pAP1的構(gòu)建人工合成包括2*35S啟動子、PolyA和NOS終止子的DNA序列(35S啟動子和NOS終止子來自pCamBia2301)，在此DNA序列的3’和5’端分別含有HindIII和EcoRI酶切位點，在35S后面含有BamHI，PstI，XhoI，HpaI等酶切位點。此DNA序列經(jīng)HindIII和EcoRI酶切后與pUC19連接，構(gòu)成p2Pma。用HindIII和EcoRI分別酶切p2Pma和pBI121質(zhì)粒，回收酶切p2Pma得到的1.3kb和酶切pBI121得到的14.7kb的條帶，連接成中間載體pC2P，再用Pst I和Hpa I酶切此中間載體，回收16kb的條帶，用Pst I和Hpa I酶切攜帶目的基因的pMDAP1質(zhì)粒，回收768bp的條帶后，重組成植物表達載體pAP1(圖1)。經(jīng)酶切鑒定，證明構(gòu)建的載體是正確的(圖2)。圖2中，MλDNA HindIII/EcoR1雙酶切結(jié)果；1為pAP1的EcoR1單酶切結(jié)果，得到一條大小為17kb的條帶；2為pAP1的Pst1和Hpa1雙酶切結(jié)果，得到一條大小為768bp和一條大小為16kb的條帶；3為pAP1的Pst1單酶切結(jié)果，得到一條大小為17kb的條帶。
三、制備花粉管通道法轉(zhuǎn)化用的pAP1質(zhì)粒DNA1、大量提取質(zhì)粒pAP1(1)接單菌落于20ml帶有卡那霉素(100mg/ml)的液體LB培養(yǎng)基中，37℃，250rpm條件下振蕩培養(yǎng)12h。
(2)將菌液轉(zhuǎn)入4000ml液體LB培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)8～12小時。
(3)5000rpm離心5分鐘，收集菌體。
(4)用100ml STE緩沖液懸浮洗滌菌體，合并各管于2個500ml離心管中，重新離心去上清。
(5)分別向每管加入80ml Solution I(50mmol/L蔗糖，10mmol/L EDTA，25mmol/L Tris-HCl pH8.0)，將菌體懸浮后加入160ml新配制的Solution II(0.2mol/L NaOH，1％SDS)，輕輕混勻數(shù)次，冰上放置10分鐘，再加入120ml預冷的Solution III(每100ml含5mol/L KAc 60ml，冰乙酸11.5ml，蒸餾水28.5ml)，輕輕混勻，冰上放置30分鐘。
(6)8000rpm離心15分鐘，收集上清，加入0.6倍體積的異丙醇，室溫放置10分鐘。
(7)8000rpm離心15分鐘，70％乙醇洗滌一次，溶于4ml TE(10mmol/L TrispH8.0，1mmol/L EDTA pH8.0)中，加RNase 8μL(10mg/ml)37℃處理1小時。
(8)用酚、氯仿抽提純化，乙醇沉淀后溶于3ml TE中。
2、超速離心進一步純化提取的質(zhì)粒DNA(用Beckman公司超速離心機)(1)在一個50ml離心管中加入2.9ml DNA溶液，6.6ml飽和氯化銫溶液及1ml溴化乙錠溶液(EB，10mg/ml)，混勻待用。
(2)上步中如有許多沉淀，則8000rpm離心5分鐘。
(3)將上述混合液轉(zhuǎn)入兩個5.2ml超速離心管中，用Beckman超速離心機專用設(shè)備熱封管口。
(4)用vTi80轉(zhuǎn)頭室溫真空離心20小時，6,5000rpm。
(5)在暗室中紫外光下，先在離心管上部用針頭穿孔，然后用5ml一次性注射器吸出質(zhì)粒亮帶。
(6)用水飽和正丁醇抽提數(shù)次去EB。
用TE稀釋三倍后，用二倍無水乙醇4℃沉淀，離心，溶解后稀釋待用。
四、花粉管通道法轉(zhuǎn)化棉花在本實施例中，子房注射外源基因的時間是在棉花開花授粉后約10-24小時之間。在珠心孔道封閉之前，用微量注射器將外源基因溶液注射到子房內(nèi)，外源基因即可通過珠孔和珠心孔道，逐漸擴散到或在珠心孔道封閉的過程中被擠壓到剛受精后的胚囊內(nèi)。在受精卵分裂的過程中，外源基因被整合到受精卵細胞的基因組中，從而完成外源基因?qū)牒驼系倪^程。
棉花是常異花授粉作物，為保持品種(系)的相對純度，在開花的前一天下午，將要在第二天開花的蕾用線扣緊，使花瓣不能張開，以使其自花授粉。開花第二天進行外源基因的注射。注射前將花瓣連同雄蕊剝?nèi)?，露出幼鈴，抹去幼鈴頂端的花柱，將吸取外源DNA溶液的微量注射器，沿中軸垂直插入幼鈴大小的2/3處，再將微量注射器向上提到1/3的地方，留下約幼鈴1/3的注入空間，緩慢將注射裝置內(nèi)的外源DNA溶液注射到注入空間內(nèi)。此后，外源DNA溶液將沿著珠孔和珠心孔道向受精胚囊內(nèi)擴散，或由于珠心孔道逐漸封閉而被擠壓進受精胚囊，實現(xiàn)基因的整合。每朵花注射DNA溶液10μL，DNA總量約為0.25～0.5μg。外源DNA注射后，為防止和減少幼鈴脫落，提高成鈴率，在幼鈴柄基部用毛筆涂沫40(mg/L)的赤霉素或用浸有40(mg/L)赤霉素的棉球夾在幼鈴柄基部和莖(枝)之間，同時將注射外源DNA的幼鈴所在的枝條項端摘掉，以保持幼鈴的充分營養(yǎng)，有利于成鈴和鈴內(nèi)種子的發(fā)育。
收獲的種子播種出苗后，用5000(mg/L)卡那霉素涂抹T1代單株的葉片，連續(xù)數(shù)次進行卡那霉素抗性篩選，并進行分子檢測和表型觀察，確認獲得轉(zhuǎn)基因植株。
五、轉(zhuǎn)基因棉花的分子生物學檢測1、棉花基因組DNA的提取(銅試劑法)(1)0.5g棉花嫩葉加液氮研磨后，加入1ml冰冷的提取緩沖液I(0.35mol/L葡萄糖，0.1mol/L Tris-HCl pH8.0，0.05mol/L EDTA pH 8.0，2％PVP40，0.1％DIECA(二乙基二硫代氨基甲酸鈉，銅試劑)，使用前加入0.1％Vc和0.2％巰基乙醇并定容，4℃保存，1-2周內(nèi)使用)。注在進行步驟(2)之前，此混合物應(yīng)置于冰上。
(2)12000rpm、4℃離心5min。
(3)倒掉上清留沉淀。
(4)加入0.4ml提取緩沖液II(0.1mol/L Tris-HCl pH8.0，1.4mol/L NaCl，0.02mol/L EDTA pH 8.0，2％CTAB，2％PVP40，0.1％DIECA，使用前加入0.1％Vc和0.2％巰基乙醇并定容，室溫保存，1-2周內(nèi)使用)。
(5)65℃水浴20-30min后置冰上5min。
(6)加10ml氯仿-異戊醇(24∶1)，混勻，5000rpm離心5min。
(7)取上清再抽提一次。
(8)取上清，加入等體積冰冷的異丙醇，顛倒混勻20～30次，直DNA析出。用玻璃棒將DNA挑出，70％乙醇洗滌數(shù)次，溶于500μl TE或無菌水中備用。
2、轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測(1)根據(jù)擬南芥AP1基因序列設(shè)計并合成引物p55’attgcacctg agtccgacgt c3’p35’cgaagcagccaaggttgcagttgt3’(2)提取轉(zhuǎn)基因植株的葉片DNA。同時以非轉(zhuǎn)基因植株的葉片DNA和水作為對照。
(3)PCR擴增檢測。
PCR反應(yīng)體系為dNTP混合物(每種2.5mmol/L)5μl10×LA Taq buffer5μlp3(10μmol/L)1μlp5(10μmol/L)1μl棉花基因組DNA3μlLA Taq酶(5U/μl) 0.5μlH2O 34.5μl總體積 50μl混勻后短暫離心，按下列條件進行PCR擴增94℃3min；94℃30sec，62℃30sec，72℃30sec，30個循環(huán)；72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果如圖3所示，表明轉(zhuǎn)基因植株均擴增得到一條500bp左右的條帶，非轉(zhuǎn)基因植株和水均無此條帶。圖中，1為Marker，λDNA HindIII/EcoR1；2-8為轉(zhuǎn)基因棉花；9為陽性對照(pMDAP1)；10為非轉(zhuǎn)基因棉花；11為水。
3、轉(zhuǎn)基因棉花的Southern雜交檢測(1)將轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因棉花基因組DNA用PstI和HpaI雙酶切過夜，0.8％瓊脂糖凝膠電泳并照相。
(2)將膠置于小盤中，加入200ml變性液(0.5mol/L NaOH，1.5mol/L NaCl)，振蕩45分鐘。
(3)棄去變性液，用蒸餾水漂洗數(shù)次，加入中和液(1mol/L Tris pH7.4，1.5mol/L NaCl)200ml，振蕩30分鐘，然后更換新的中和液，繼續(xù)中和15分鐘。
(4)剪相應(yīng)大小的硝酸纖維素膜(NC膜)，于蒸餾水中均勻濕透后，將NC膜浸于10×SSC(20×SSC每1000ml含NaCl 175.3g，檸檬酸鈉88.2g，pH 7.0)中，放置20分鐘。
(5)使用Bio-Rad公司的轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜1小時。
(6)去掉膠塊，標記好加樣孔位置，用6×SSC洗膜5分鐘，然后紫外照射5分鐘，以固定DNA。2×SSC洗膜，室溫風干。
(7)將NC膜卷入雜交瓶中，加入20ml預雜交液(6×SSC，5×Denhardt，0.5％SDS，200μg/ml魚精DNA)，使膜均勻浸潤無氣泡，然后置于DNA分子雜交爐中68℃預雜交過夜。
(8)探針的標記采用Promega公司隨機引物試劑盒標記。取待標記DNA片段(PstI和HpaI酶切pMDAP1得到的擬南芥AP1基因(AtAP1基因))，95-100℃變性2分鐘，迅速置于冰上，在一新的Eppendrof管中，依次加入5×labeling buffer10μldCTP，d6TP，dTTP混合物2μlAtAP1基因 25ngBSA 2μlα-32P-dATP 5μlKlenow 酶1μl加H2O至總體積50μl其中，5×labeling buffer來自Prime-a-Gene Labeling System試劑盒。
(9)輕輕混勻，室溫反應(yīng)60分鐘。95℃變性2分鐘置于冰上。加入2μl 0.5mol/L的EDTA。
(10)向預雜交完畢的袋中加入變性探針30-50μl，重新封好，繼續(xù)于68℃雜交8-10小時。
(11)取出雜交膜用2×SSC、0.5％SDS洗膜30分鐘，用2×SSC、0.1％SDS洗15分鐘，再用0.1×SSC、0.5％SDS于42℃洗膜30分鐘-數(shù)小時，中間更換新的洗膜液。
(12)1×SSC洗膜2分鐘，用吸水紙吸去水珠，用保鮮膜包好膜，暗室中壓片。
(13)-70℃放射自顯影3-6h后洗片。
該Southern雜交檢測結(jié)果如圖4所示，表明在轉(zhuǎn)基因植株中均有雜交條帶。圖中，1，6非轉(zhuǎn)基因棉花；2-5轉(zhuǎn)基因棉花；7PstI和HpaI酶切pMDAP1得到的擬南芥AP1基因(陽性對照)。
六、轉(zhuǎn)基因棉花的表型觀察現(xiàn)蕾、開花至吐絮期間對40株轉(zhuǎn)基因植株進行表型調(diào)查，觀察轉(zhuǎn)基因植株腋芽萌發(fā)生長、有無營養(yǎng)枝、頂尖是否封頂、第一果枝著生節(jié)位、果枝臺數(shù)、節(jié)間長短、株型和早熟性等性狀。結(jié)果表明所有40株卡那霉素陽性轉(zhuǎn)基因T1代單株均無營養(yǎng)枝，腋芽短小或枯萎，第一果枝著生的節(jié)位與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓隉o差異，部分植株在長出12-14臺果枝后頂尖自封頂，莖和果枝節(jié)間明顯變短，株型緊湊，或提早開花吐絮(圖5)。圖5中，a示腋芽短?。籦示腋芽枯萎；c示頂尖自封頂；d示自封頂后株高僅70cm，非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩旮?05cm；e示調(diào)查時轉(zhuǎn)基因植株吐絮鈴數(shù)為9/15，屆時對照植株尚未吐絮；f示對照植株尚未吐絮。
序列表<160>1<210>1<211>768<212>DNA<213>擬南芥屬擬南芥((Arabidopsis thaliana))<400>1atgggaaggg gtagggttca attgaagagg atagagaaca agatcaatag acaagtgaca 60ttctcgaaaa gaagagctgg tcttttgaag aaagctcatg agatctctgt tctctgtgat120gctgaagttg ctcttgttgt cttctcccat aaggggaaac tcttcgaata ctccactgat180tcttgtatgg agaagatact tgaacgctat gagaggtact cttacgccga aagacagctt240attgcacctg agtccgacgt caatacaaac tggtcgatgg agtataacag gcttaaggct300aagattgagc ttttggagag aaaccagagg cattatcttg gggaagactt gcaagcaatg360agccctaaag agcttcagaa tctggagcag cagcttgaca ctgctcttaa gcacatccgc420actagaaaaa accaacttat gtacgagtcc atcaatgagc tccaaaaaaa ggagaaggcc480atacaggagc aaaacagcat gctttctaaa cagatcaagg agagggaaaa aattcttagg540gctcaacagg agcagtggga tcagcagaac caaggccaca atatgcctcc ccctctgcca600ccgcagcagc accaaatcca gcatccttac atgctctctc atcagccatc tccttttctc660aacatgggtg gtctgtatca agaagatgat ccaatggcaa tgaggaatga tctcgaactg720actcttgaac ccgtttacaa ctgcaacctt ggctgcttcg ccgcatga 768
權(quán)利要求
1.抑制植物腋芽萌發(fā)生長和/或使植物頂尖自封頂和/或使植株節(jié)間變短和/或使植物株型緊湊的方法，是將植物AP1基因?qū)肽康闹参镏小?br> 2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述植物AP1基因來源于擬南芥。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述目的植物為雙子葉植物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述雙子葉植物為棉花、番茄或西瓜。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述植物AP1基因的5′端連接啟動子，所述植物AP1基因的3′端連接非編碼區(qū)和終止子形成AP1基因表達盒。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述啟動子為花椰菜花葉病毒35S啟動子或NOS啟動子。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述植物AP1基因的3’端非編碼區(qū)包括一個多聯(lián)終止密碼子序列，一個mRNA切割序列和一個mRNA切割后加工序列及多聚腺苷酸化序列；所述終止子為胭脂堿合酶基因終止子或35S終止子。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于攜帶所述植物AP1基因的植物表達載體為pAP1。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于將攜帶所述植物AP1基因的表達載體導入目的植物的方法為農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化法、基因槍法、電擊法、顯微注射法、超聲波法、激光微束法、碳化硅纖維介導法、電泳法、PEG介導的轉(zhuǎn)化法、脂質(zhì)體介導轉(zhuǎn)化法、花粉介導法、花粉管通道法、浸泡法或以花椰菜花葉病毒、雙生病毒或RNA病毒載體所介導的轉(zhuǎn)化法。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述目的植物為棉花。
全文摘要
本發(fā)明公開了植物AP1基因的新用途。本發(fā)明所提供的植物AP1基因的新用途是利用植物AP1基因抑制植物腋芽萌發(fā)生長和/或使植物頂尖自封頂和/或使植株節(jié)間變短和/或使植物株型緊湊的方法。本發(fā)明的方法適合于雙子葉植物(如棉花，番茄，西瓜)，特別是棉花。
文檔編號C12N15/29GK1800405SQ200510000040
公開日2006年7月12日 申請日期2005年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月5日
發(fā)明者賈士榮, 王旭靜, 王志興 申請人:北京優(yōu)利康生物農(nóng)業(yè)技術(shù)有限責任公司