專利名稱：一個與黃原膠合成相關(guān)的基因及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物基因工程領(lǐng)域。具體涉及與黃原膠合成相關(guān)的基因，該基因編碼的蛋白質(zhì)為C-4二羧酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，該基因的突變可顯著增加黃原膠的產(chǎn)量，可用于黃原膠生產(chǎn)菌株的遺傳改良。
背景技術(shù)：
野油菜黃單胞菌胞外多糖(extracellular polysaccharide，EPS)，俗名黃原膠，它具有良好的增粘性和觸變性，極佳的熱、酸、堿穩(wěn)定性，較強(qiáng)的抗酶解能力，能與大多數(shù)的金屬鹽配伍，與常用的溶劑、試劑相容。它是目前國內(nèi)外已經(jīng)開發(fā)的幾種微生物多糖中最具特色的一種，也是世界上生產(chǎn)規(guī)模最大，用途最廣的微生物多糖。已作為助懸劑、增稠劑、乳化劑、穩(wěn)定劑，在石油開采、醫(yī)藥、食品、飲料、化妝品、洗滌劑、涂料等行業(yè)中廣泛應(yīng)用，另外在森林滅火、環(huán)境保護(hù)方面也有很好的應(yīng)用前景(Sutherland 1986；李信1995)。美國曾對9種微生物多糖進(jìn)行評價，黃原膠以其功能全面、用途廣泛而居首位。目前全世界黃原膠的年產(chǎn)量超過5萬噸，在發(fā)酵工業(yè)中占有十分重要的地位。黃原膠的廣泛應(yīng)用，為相關(guān)的行業(yè)創(chuàng)造了巨大的經(jīng)濟(jì)效益。然而，目前國內(nèi)黃原膠生產(chǎn)菌株的產(chǎn)量在4％碳源的發(fā)酵液中黃原膠產(chǎn)量為27g/L，而發(fā)達(dá)國家則超過34g/L，選育高產(chǎn)菌株仍有很大的發(fā)展空間，可以通過采用□提高黃原膠生物合成相關(guān)基因產(chǎn)物的活性(Harding et al 1987；Zha etal 1998)；□增加相關(guān)基因的拷貝數(shù)(Tseng et al 1992)；□修飾黃原膠生物合成調(diào)控基因(Tang et al 1991；Katzen et al 1998)；□修飾與糖代謝有關(guān)的基因，降低糖類的其他途徑消耗；□改變多聚糖分解酶類基因，以減少胞外多糖的降解，提高產(chǎn)膠率(Schroter et al 2001)；□提高胞外多糖轉(zhuǎn)運(yùn)酶類活性等方法來改良菌株提高黃原膠產(chǎn)量。
本發(fā)明的目的是提供與黃原膠合成相關(guān)的新基因，用于黃原膠生產(chǎn)菌株的遺傳改良，達(dá)到提高碳源利用率、提高黃原膠產(chǎn)量的目的。
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具體地講，一種源于野油菜黃單胞菌8004菌株的基因所表達(dá)的C-4二羧酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或功能類似物，其氨基酸序列與SEQ ID NO2所示的氨基酸序列具有至少80％的同源性，至少它具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。本發(fā)明還具體地涉及編碼它們的基因。另外還提供了C-4二羧酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在黃原膠生產(chǎn)中的應(yīng)用和基因在黃原膠生產(chǎn)和其菌株的遺傳改良中的應(yīng)用。
攜帶該基因的質(zhì)粒JM109/pXC0819的大腸埃希氏菌已在北京，中國普通微生物菌種保藏管理中心保存，保存編號為CGMCC No.1056，保存日期為2003年11月26日。
序列表中SEQ ID NO1是野油菜黃單胞菌8004菌株的基因DNA序列片段，由1597個堿基組成。含完整的C-4二羧酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，自5’端的第201-1544位核苷酸為該基因的開放閱讀框(Open Reading Frame，ORF)，自5’端的第201-203位核苷酸為該基因的起始密碼子ATG，自5’端的第1545-1547位核苷酸為終止密碼子TGA。自5’端的第140-180位核苷酸為啟動子區(qū)；自5’端的第189-193位核苷酸為SD序列。SEQ IDNO2所示的氨基酸序列是C-4二羧酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因編碼的C-4二羧酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白產(chǎn)物，由448個氨基酸組成。
本發(fā)明提供了一種與黃原膠合成相關(guān)的新基因，在黃原膠生產(chǎn)和其菌株的遺傳改良中的應(yīng)用有著重要的意義。


圖1為XC0819基因的克隆酶切電泳圖譜。
1λ/HindIII標(biāo)準(zhǔn)DNA(片段大小從大到小依次為23.1kb，9.4kb，6.6kb，2.4kb，2.0kb)；2XC0819基因的DNA片段；3基因克隆pXC0819/EcoRI+HindIII。
圖2為XC0819基因缺失突變體的PCR驗證凝膠圖。
1100bp標(biāo)準(zhǔn)DNA(片段大小從大到小依次為3kb，2kb，1.5kb，1.2kb，1kb，0.9kb，0.8kb，0.7kb等)；2野生型8004；3-6XC0819基因缺失突變體。
圖3為XC0819基因缺失突變體的黃原膠平板檢測。
A野生型8004菌株；BXC0819基因缺失突變體。
具體實(shí)施例方式
在本發(fā)明的實(shí)施例中所用到的材料包括大腸桿菌(Escherichia coli)株系JM109購自Promega公司；載體pGEM-3Zf(+)購自Promega公司；限制性內(nèi)切酶、修飾酶等試劑購自Promega、Stratagene、QIAGEN公司。
野油菜黃單胞菌野生型菌株Xcc 8004(Tang JL et al.1990.Cloning ofgenes involved in negative regulation of production of extracellular enzymesand polysaccharide of Xanthomonas campostris pathovar campestris.MolGen Genet.222157-160.)柯斯質(zhì)粒pLAFR1和pLAFR3(Liu YN etal.1990.A multipurpose broad host range cloning vector and its useto characterise an extracellular protease gene of Xanthomonascampestris pathovar campestris.Mol Gen Genet.220433-440.)；柯斯質(zhì)粒pPH1JI(Hirsch PR et al.1984.A physical map of pPH1JI andpJB4JI.Plasmid.12139-141.)；轉(zhuǎn)座子Tn5gusA5(Zha D et al.1998.Cloning of DNA sequences involved in exopolysaccharide synthesisof Xanthomonas campestris pv.campestris.Wei Sheng Wu Xue Bao.38251-255.)。
NYGB培養(yǎng)基每升中含蛋白胨5克、酵母粉5克、甘油20克，pH7.0。NYGA培養(yǎng)基為NYGB中加入15克/L瓊脂糖。
XC0819基因擴(kuò)增引物由上海生物工程公司根據(jù)下面序列合成。
上游引物XC0819-F GAATTC GGCCCTGCATCCCGCCGG下游引物XC0819-R AAGCTT GGCCAACAGCACAGAAAG斜體為附加酶切位點(diǎn)序列(EcoRI、HindIII)、框線內(nèi)為保護(hù)堿基。
實(shí)施例1、野油菜黃單胞菌突變體庫的構(gòu)建用Tn5gusA5誘變Xcc的策略以大腸桿菌和Xcc之間的穿梭質(zhì)粒pLAFR1為載體將Tn5gusA5引入Xcc野生型菌株，然后通過引入不相容質(zhì)粒pPH1JI驅(qū)趕pLAFR1，通過抗生素抗性標(biāo)記篩選Xcc∷Tn5gusA5插入突變體。本實(shí)驗室用Tn5gusA5誘變Xcc，構(gòu)建了Tn5gusA5在基因組隨機(jī)插入的突變體庫，結(jié)合Xcc全基因組序列和TAIL-PCR(ThermalAsymetric Interlaced-PCR)技術(shù)(Liu et al 1995)，確定Tn5gusA5在基因組上的插入位置。通過考察突變體胞外多糖產(chǎn)量等表型的變化，已篩選到黃原膠產(chǎn)量減少的突變株9株，黃原膠產(chǎn)量增加的突變體2株，涉及2個新的基因。本發(fā)明只涉及其中一個基因XC0819。
將XC0819基因的序列，在Genbank中進(jìn)行BLASTP(生物信息學(xué)的一種序列比對工具，由美國國家生物信息中心開發(fā)，在互聯(lián)網(wǎng)上免費(fèi)使用http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，結(jié)果顯示XC0819基因編碼產(chǎn)物為C-4二羧酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，屬于鈉二羧酸鹽共轉(zhuǎn)運(yùn)家族(Sodiumdicarboxylate symporter family)。
實(shí)施例2、XC0819基因(C-4二羧酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因)的克隆根據(jù)XC0819的基因序列，設(shè)計引物，以野油菜黃單胞菌總DNA為模板，用PCR法擴(kuò)增該基因全長序列，并將其克隆至載體pLAFR3中，構(gòu)建基因克隆pXC0819并酶切驗證(見圖1)。注為便于亞克隆、長期保存，該基因克隆于pUC18質(zhì)粒中EcoRI、HindIII位點(diǎn)之間。
實(shí)施例3、XC0819基因缺失突變體的構(gòu)建和驗證以pGEM-3Zf(+)為載體，將用PCR方法擴(kuò)增得到的卡那霉素抗性基因(Kan基因)克隆到載體上。設(shè)計PCR引物，對XC2964的旁側(cè)序列進(jìn)行擴(kuò)增，得左、右旁側(cè)序列分別命名為2964L和0819R。分別將0819L和0819R克隆到載體上Kan基因的兩側(cè)，構(gòu)建帶有Kan基因和XC0819旁側(cè)序列的重組質(zhì)粒pGK0819。將pGK0819中的插入片段克隆到具有廣泛寄主范圍的柯斯質(zhì)粒pLAFR3上，構(gòu)建質(zhì)粒pLGK0819，通過三親本接合將pLGK0819導(dǎo)入野生型8004菌株進(jìn)行同源雙交換，再通過兩親本接合和抗生素篩選接合子。所得接合子用PCR方法進(jìn)行鑒定，因XC0819缺失突變體與野生型黃單胞菌8004菌株具有不同的擴(kuò)增帶型而得以驗證(見圖2)。
實(shí)施例4、XC0819基因缺失突變體的黃原膠平板檢測Xcc胞外多糖的平板檢測，可根據(jù)菌落形成的大小定性比較菌株之間EPS的產(chǎn)量的差異。將Xcc接種到10ml的NYGB，28℃搖床培養(yǎng)過夜。對培養(yǎng)物濃度進(jìn)行調(diào)節(jié)，使OD值基本相同，用移液器精確取1μl的培養(yǎng)物，分別接種于含2％葡萄糖的NYGA平板，28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3天，再將平板放置于培養(yǎng)箱外，見光培養(yǎng)2～5天，通過比較菌落的形態(tài)大小對EPS的產(chǎn)量進(jìn)行比較(見圖3)。
實(shí)施例5、XC0819基因缺失突變體的黃原膠產(chǎn)量檢測Xcc胞外多糖的產(chǎn)量檢測，可以通過搖瓶發(fā)酵，提取EPS，對產(chǎn)量進(jìn)行比較。EPS產(chǎn)量作定性分析時，將Xcc的過夜培養(yǎng)物以1％的接種量接種至加2％葡萄糖的NYGB培養(yǎng)基，28℃搖床培養(yǎng)3天后，取適量的培養(yǎng)物，緩慢注入到3～7倍的無水乙醇中，邊注入邊攪拌，然后將絮狀沉淀物取出后干燥，稱重，換算成每100ml培養(yǎng)物可形成多少克EPS進(jìn)行菌株間的產(chǎn)量比較。對XC0819基因缺失突變體與野生型8004菌株平行進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，重復(fù)三次，黃原膠產(chǎn)量統(tǒng)計對比結(jié)果如表1。結(jié)果顯示，培養(yǎng)72小時和120小時XC0819基因缺失突變體黃原膠產(chǎn)量分別比野生型8004菌株提高17.8％和19.8％。證實(shí)XC0819基因與黃原膠的生物合成相關(guān)。
表1 XC0819缺失突變體與野生型8004菌株黃原膠產(chǎn)量比較EPS產(chǎn)量g/100ml培養(yǎng)液菌株72小時 120小時野生型80040.73±0.080.91±0.05XC0819缺失突變體 0.86±0.111.09±0.09
序列表<110>廣西大學(xué)<120>一個與黃原膠合成相關(guān)的基因<130>
<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1597<212>DNA<213>Xanthomonas cappestris<400>1ggccaacagc acagaaagtc ggtgtctgcg ttaaacggaa ttaacggccg aggggcgcgt 60ggctgaagtg taagaccagg ttcacgcaac gcccagcgcg tagtaccaat gggttatcgg120cccgggctgt gacgtgcggc cagaatgcct gcaccgggtg cctggctcag gcgccctcca180agttccctcg gagtggtgtc atgcacatca gcaagcctgc cggccccctg ccggcgcctg240tccccttcta ccgccagttg tatttccagg tggtggtggc gatcgttctt ggcgccctgc300tgggccattt cgagccggcc ttcgccgaaa gcctcaagcc actcggcgat gccttcatca360agctggtgaa gatgatcatc gcgccggtga tcttcctgac catcgtcacc ggcatcgccg420gcatgaccca cctcaagacg gtgggccggg tcttcgccaa gtcgatgacc tatttcctgt480tcttctccac gctggcgttg atcgtcggca tggtggtggc gcacgtggtg cagccgggcg540ccggcatgaa catcaacccg gccgagctgg accagagcgc ggtcaacacc tacgtgcaga600aatcgcacga gctgagcctg gtcggctttt tgatggacat catcccggcc acgctgatca660gcgcattcgt cgatggcaac atcctgcagg tgctgttcgt ggcggtgctg ttcggcatcg720cgctggccct ggtgggcgag cgtggccgcc cggtgctgag cttcctggaa gcgctcaccg780ccccggtgtt ccgcctggtg cacatgctga tgaaggccgc gccgatcggt gcattcggtg840caatcgcttt caccatcggc aagtacggcg tggaatcgct ggtcaacctg gcctggctgg900tgggctcgtt ttacctgacc tcgctgttct tcgtgctggt gatcctgggc atcgtgtgcc960ggttgtgcgg cttttcggtg ctcaagctga tccgctacct caaggccgag ctgctgctgg 1020tgctgggcac ctcctcgtcg gaatcggcat tgccgtcgct gatggagaag atggaaaagg 1080ccggctgcga gaagtcggtg gtgggcctgg tcgtgccgac cggctactcg ttcaacctgg 1140acggcaccaa catctacatg accctggcgg cgctgttcat cgcccaggcc accaatgtcg 1200acctcaccct cggccagcag atcaccttgc tggcggtggc gatgctcagc tccaagggcg 1260cggccggcgt gaccggcgcc ggcttcatta cgcttgcggc cacgctgtcg gtggtgccgg 1320atgtgccggt ggcgggcatg gcgctgatcc tgggcgtgga ccgcttcatg agcgagtgcc 1380gctcgctgac caacttcatc ggcaatgcgg tggccacggt ggtggtgtcg cgttgggaaa 1440atgcgctgga ccgtgaccag ttgagcctgg ccttggacgg ccgtgcgccg ccgctgcagg 1500caccggtgcc gccgccggac gcagtcgcgc cggtcagcgc acgctgatgc ttcctacggc 1560cctgtattcc gctgatatcc cggcgggatg cagggc 1597<210>2<211>448<212>PRT
<213>Xanthomonas cappestris<400>2Met His Ile Ser Lys Pro Ala Gly Pro Leu Pro Ala Pro Val Pro Phe1 5 10 15Tyr Arg Gln Leu Tyr Phe Gln Val Val Val Ala Ile Val Leu Gly Ala20 25 30Leu Leu Gly His Phe Glu Pro Ala Phe Ala Glu Ser Leu Lys Pro Leu35 40 45Gly Asp Ala Phe Ile Lys Leu Val Lys Met Ile Ile Ala Pro Val Ile50 55 60Phe Leu Thr Ile Val Thr Gly Ile Ala Gly Met Thr His Leu Lys Thr65 70 75 80Val Gly Arg Val Phe Ala Lys Ser Met Thr Tyr Phe Leu Phe Phe Ser85 90 95Thr Leu Ala Leu Ile Val Gly Met Val Val Ala His Val Val Gln Pro100 105 110Gly Ala Gly Met Asn Ile Asn Pro Ala Glu Leu Asp Gln Ser Ala Val115 120 125Asn Thr Tyr Val Gln Lys Ser His Glu Leu Ser Leu Val Gly Phe Leu130 135 140Met Asp Ile Ile Pro Ala Thr Leu Ile Ser Ala Phe Val Asp Gly Asn145 150 155 160Ile Leu Gln Val Leu Phe Val Ala Val Leu Phe Gly Ile Ala Leu Ala165 170 175Leu Val Gly Glu Arg Gly Arg Pro Val Leu Ser Phe Leu Glu Ala Leu180 185 190Thr Ala Pro Val Phe Arg Leu Val His Met Leu Met Lys Ala Ala Pro195 200 205Ile Gly Ala Phe Gly Ala Ile Ala Phe Thr Ile Gly Lys Tyr Gly Val210 215 220Glu Ser Leu Val Asn Leu Ala Trp Leu Val Gly Ser Phe Tyr Leu Thr225 230 235 240Ser Leu Phe Phe Val Leu Val Ile Leu Gly Ile Val Cys Arg Leu Cys245 250 255Gly Phe Ser Val Leu Lys Leu Ile Arg Tyr Leu Lys Ala Glu Leu Leu260 265 270Leu Val Leu Gly Thr Ser Ser Ser Glu Ser Ala Leu Pro Ser Leu Met275 280 285Glu Lys Met Glu Lys Ala Gly Cys Glu Lys Ser Val Val Gly Leu Val290 295 300Val Pro Thr Gly Tyr Ser Phe Asn Leu Asp Gly Thr Asn Ile Tyr Met305 310 315 320Thr Leu Ala Ala Leu Phe Ile Ala Gln Ala Thr Asn Val Asp Leu Thr325 330 335Leu Gly Gln Gln Ile Thr Leu Leu Ala Val Ala Met Leu Ser Ser Lys340 345 350
Gly Ala Ala Gly Val Thr Gly Ala Gly Phe Ile Thr Leu Ala Ala Thr355 360 365Leu Ser Val Val Pro Asp Val Pro Val Ala Gly Met Ala Leu Ile Leu370 375 380Gly Val Asp Arg Phe Met Ser Glu Cys Arg Ser Leu Thr Asn Phe Ile385 390 395 400Gly Asn Ala Val Ala Thr Val Val Val Ser Arg Trp Glu Asn Ala Leu405 410 415Asp Arg Asp Gln Leu Ser Leu Ala Leu Asp Gly Arg Ala Pro Pro Leu420 425 430Gln Ala Pro Val Pro Pro Pro Asp Ala Val Ala Pro Val Ser Ala Arg435 440 44權(quán)利要求
1.一種來源于野油菜黃單胞菌的XC0819基因所表達(dá)的C-4二羧酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或功能類似物，其氨基酸序列與SEQ ID NO2所示的氨基酸序列具有至少80％的同源性。
2.按照權(quán)利要求1所述的C-4二羧酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或功能類似物，它具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
3.一種編碼權(quán)利要求1-2中任意一項所述的C-4二羧酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或功能類似物的基因。
4.按照權(quán)利要求3所述的基因，它具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
5.按照權(quán)利要求4所述的基因SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，自5’端的第201-1544位核苷酸為該基因的開放閱讀框。
6.含有3或4或5所述核苷酸序列的質(zhì)粒。
7.含有權(quán)利要求4所述基因的轉(zhuǎn)化子大腸埃希氏菌CGMCCNo.1056。
8.權(quán)利要求1-2所述的C-4二羧酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或功能類似物在黃原膠生產(chǎn)中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求3或4所述的基因或7所述的轉(zhuǎn)化子在黃原膠生產(chǎn)和其菌株的遺傳改良中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求7所述的轉(zhuǎn)化子在黃原膠生產(chǎn)和其菌株的遺傳改良中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了與黃原膠合成相關(guān)的新基因及其表達(dá)的蛋白和功能類似物。具體地講，一種源于野油菜黃單胞菌8004菌株的基因所表達(dá)的C－4二羧酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或功能類似物，其氨基酸序列與SEQ ID NO2所示的氨基酸序列具有至少80％的同源性，至少它具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。本發(fā)明還具體地涉及編碼它們的基因。另外還提供了C－4二羧酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在黃原膠生產(chǎn)中的應(yīng)用和基因在黃原膠生產(chǎn)和其菌株的遺傳改良中的應(yīng)用。
文檔編號C07K14/195GK1623998SQ20031011687
公開日2005年6月8日 申請日期2003年12月1日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月1日
發(fā)明者唐紀(jì)良, 何勇強(qiáng), 唐東階, 馮家勛, 陳保善, 梁曉夏, 陸光濤, 姜伯樂, 徐榮旗, 晃耐霞 申請人:廣西大學(xué)